형태와 오픈 소스 소프트웨어 파이프라인 Agar에 움직일 활성된 슬러지 입자의 크기 측정

요약

활성된 슬러지 입자의 형태와 크기는 다양 한 방법을 사용 하 여 측정 하는 중요 한 매개 변수. 부정확 비 대표 샘플링, 차선 이미지 및 주관적인 분석 매개 변수에서 발생 한다. 이러한 오류를 최소화 하 고 쉽게 측정, 우리는 오픈 소스 소프트웨어 파이프라인을 포함 하 여 모든 단계를 지정 하는 프로토콜을 제시.

초록

그 치료 폐수 등 실험적인 bioreactors 입자의 크기와 모양이 중요 한 매개 변수를 포함 합니다. 예를 들어 크기와 활성된 슬러지 flocs의 모양 수는 눈금에서 조건을 나타내고 슬러지는 헤어 청 징 제에서 침전 하는 얼마나 잘에 직접적인 영향을 합니다.

입자 크기와 모양 모두 misleadingly '간단한' 측정 있습니다. 많은 미묘한 문제가, 종종 비공식 프로토콜에 unaddressed 샘플링, 이미징, 및 입자를 분석 하는 경우 발생할 수 있습니다. 샘플링 방법 편견 수 있습니다 또는 충분 한 통계적 인 힘을 제공 하지. 샘플 스스로 가난 하 게 유지 될 수 있습니다 또는 동원 정지 하는 동안 변경 받 다. 이미지는 충분 한 품질;의 않을 수 있습니다. 겹치는 입자, 분야, 확대율, 그리고 다양 한 잡음의 깊이 수 모든 결과가 가난한. 잘못 지정 된 분석 편견, 수동 이미지 임계 처리 및 시장 세분화에 의해 생산 등 발생할 수 있습니다.

경제성 및 처리량 재현성 함께 바람직한 있습니다. 저렴 한 가격, 높은 처리량 방법 더 자주 입자 측정, 입자의 수천을 포함 하는 많은 이미지를 설정할 수 있습니다. 저렴 한 시 약, 일반적인 해 현미경, 그리고 자유롭게 사용할 수 오픈 소스 분석 소프트웨어를 사용 하는 방법에 반복, 액세스할 수, 재현, 부분적으로 자동화 된 실험 결과 수 있습니다. 또한, 이러한 방법의 제품 잘 서식, 정의 그리고 데이터 분석 소프트웨어, 실험실 내에서 분석 및 실험실 사이 공유 하는 데이터를 완화 하 여 쉽게 이해할 수 있습니다.

우리는 이러한 제품을 생산 하는 데 필요한 단계를 자세히 설명 하는 프로토콜을 제시 포함: 샘플링, 샘플 준비 및 동원 정지 천, 디지털 이미지 수집, 디지털 이미지 분석과 실험 관련 그림 생성의 예는 분석 결과입니다. 우리는 또한이 프로토콜을 지원 하기 위해 오픈 소스 데이터 분석 파이프라인 포함.

서론

이 방법의 목적은 특히 활성된 슬러지 flocs 및 에어로빅과 립¹ 를 포함 하는 생물 반응 기에서 입자의 크기와 모양 분포를 결정 하기 위한 잘 정의 된, 반복, 그리고 부분적으로 자동화 된 방법을 제공 하는 ^{, 2}.이 방법은 뒤에 있는 근거 경제성, 단순, 처리량, 향상 하 고 우리의 기존 사내 프로토콜^3,4, 반복성, 다른 입자 측정 및 공유를 용이 하 게 하 고 데이터의 비교입니다.

두 개의 광범위 한 카테고리의 입자 측정 분석-산란⁵같은 자질을 사용 하 여 직접 이미징 및 날개 식 방법 있다. 날개 식 방법과 자동화 될 수 있다 큰 처리량, 비록 장비는 비싸다. 더하여, 날개 식 방법을 정확 하 게 입자⁶의 동일한 크기를 확인할 수 있습니다, 하는 동안 그들은 제공 하지 않습니다 자세한 모양 정보⁷.

셰이프 데이터에 대 한 필요 때문에 우리는 기반으로 우리의 방법을 직접 영상. 높은 처리량 이미징 방법 몇 가지 존재 하는 동안 그들은 전통적으로 비싼 상용 하드웨어 또는 사용자 지정 구축된 솔루션^8,9를 요구 했다. 우리의 방법은 일반적인, 저렴 한 하드웨어 및 처리량, 감소에서 고통 비록 많은 분석¹⁰에 필요한 최소 보다 훨씬 더 많은 입자 이미지를 생성 하는 소프트웨어를 개발 되었습니다.

중요 한 샘플링 및 이미지 수집 단계 기존 프로토콜 지정 하지 않을 수 있습니다. 다른 프로토콜 (예: ad hoc 임계 처리¹¹) 주관적인 편견을 소개 하는 수동 단계를 지정할 수 있습니다. 자유롭게 사용할 수 있는 분석 소프트웨어와 결합 된 샘플링, 동원 정지 및 이미지 수집 단계를 지정 하는 잘 정의 된 메서드는 실험실 내에서 이미지 분석 및 실험실 비교 강화할 것 이다. 이 프로토콜의 주요 목표는 워크플로 및 동일한 샘플에 대 한 다른 실험실에서 재현 가능한 결과를 이끌어야 하는 도구를 제공.

이미지 분석 과정을 정상화, 외 인기 있는 데이터 분석 패키지^13,14, 완화 실험이이 파이프라인에 의해 생성 하는 데이터 사용을 위해 적당 한 잘 정의 된, 잘 서식 파일¹² 에 기록 된 특정 분석 (예: 사용자 지정 그림 세대)와 연구소 간에 공유 촉진 데이터입니다.

이 프로토콜은 특히 입자 모양 데이터, 날개 식 방법에 대 한 액세스를 필요가 없습니다, 그들의 자신의 이미지 분석 파이프라인을 개발 하 고 그들의 데이터를 다른 사용자와 쉽게 공유 하고자 하고자 하지 않습니다 연구자에 대 한 제안

프로토콜

1. 입자 분석에 대 한 샘플을 수집

1. 통계 분석¹⁰ 에 대 한 충분 한 입자를 생산할 예정 이다 특정 원자로 대 한 샘플 볼륨을 결정 (> 500) 입자 중복을 피하고 있는 동안.
   1. 혼합된 액의 샘플 당 0.5 ~ 2 mL의 범위는 250와 5000 mg/l. 사이 혼합된 액 일시 중지 고체 (MLSS)와 활성된 슬러지 샘플에 대 한 충분 한 가정
   2. 그렇지 않으면, 3 테스트 한 천 배지 0.5, 2, 및 샘플 (2.7 통해 1.2 단계)의 5 mL을 사용 하 여 준비 합니다.
   3. 시각적으로 견적을 (해당 되는 경우) 샘플 볼륨 최고의 단계 1.1에에서 나열 된 조건에 맞는.
   4. 입자는 여전히 0.5 mL 샘플에 대 한 중복 추가 0.5, 1 및 2 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수를 0.5 mL 샘플 단계 2.1 전에 희석 해야 합니다 결정을 희석 3 0.5 mL 샘플 1.1.2와 1.1.3 단계를 반복 합니다.
      참고: 단계 1.1 − 1.1.4 실험 당 한 번 수행만 필요 또는 원자로 내용을 변경 등 후속 측정 더 이상 나열 된 기준을 충족 하는 경우에 1.1 단계.
2. 잡아 ~ 40 mL 비 커 또는 50 mL 원심 분리기 튜브, 부드럽게 혼합 하 고 즉시 15ml 원심 관으로 잘 혼합된 잡아의 결정된 샘플 볼륨을 붓는에 의해 원자로의 잘 혼합된 부분에서 대표적인 샘플을 취득. 정한 단계 1.1.4 필요한 샘플을 희석.
   참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기 하 고 샘플 최대 48 시간 동안 냉장 (4 ° C)에서 저장 될 수 있습니다. 샘플을 동결 하지 않습니다.
   주의: 일반적인 보존 미디어 (예: 포름알데히드/formamide) 적합 하지 않습니다. 오픈 컨테이너와 함께에서 접시의 큰 표면 영역 열 광원, 그리고 잠재적으로 가난 하 게 통풍이 현미경 설치 프로그램에서 이미지 품질에 작은 이익을 위해 불필요 하 게 위험 조건 생산.

2. 준비 스테인드, 고정 입자에의 한 천 배지

1. 1% (w/v) 메 틸 렌 블루의 5 µ L 각 샘플을 다음 모자를 더하고 부드럽게 혼합 3 최소 시간에 반전. 실 온에서 30 분 더 이상 하지만 적어도 5 얼룩을 샘플 수 있습니다.
2. 이온된 수 한 천 7.5% (w/v)의 샘플 당 약 10 mL를 준비 합니다.
   참고: 한 천 미리 생산 고 소독 하는 경우에, 불명확 하 게 저장 될 수 있습니다. Agarose 대체 될 수 있습니다, 하지만 실질적으로 이미지를 개선 하지 않습니다.
3. 전자 레인지 또는 물 목욕을 사용 하 여 한 천 녹과 약간 사용 하기 전에 냉각 수 있습니다. 천이 완전히 녹아 쉽게 따른다 확인 합니다. 한 천의 단단한 소 품질 이미지 다르게, 얼룩 것입니다.
4. 원심 분리기 튜브 6.5 및 9 mL 사이 총 튜브 볼륨을가지고 충분 한 녹은 7.5% (w/v) 한 전송.
5. 원심 분리기 튜브를 개괄 하 고 부드럽게 혼합을 3 번 이상 반전.
6. 자신을 멀리 또는 후드 모자를 가리키는 동안 뚜껑을 엽니다. 관 내용을 부드럽게 흔들어 전체, 부드러운 코팅과 입자의 시각적으로 균일 한 분포를 달성 하기 위해 요리 100 m m 플라스틱 페 트리 접시에 붓으십시오.
   주의:는 agar에서 열 튜브에 약간의 압력을 생성할 수 있습니다. 이 종종 가청 히스를 생성 하 고 뜨거운 agar의 작은 방울을 추방 하는.
7. 접시는 agar 굳은 때까지, 5 분 이상 실 온에서 냉각 수 있습니다.
   참고: 프로토콜 수 있습니다 수 일시 중지 여기. 스토어 도금 거꾸로 하 고 냉장 (4 ° C)에서 최대 48 시간 동안 (예, 봉인 비닐 봉지에에서 또는 파라핀 영화) 밀봉.

3. stereomicroscope와 디지털 카메라를 사용 하 여 입자 이미지 획득

1. 10 x 20 x 확대를 할 수는 stereomicroscope의 현미경 스테이지 발견된 격판덮개 얼굴을 놓습니다. 심지어, 확산 조명 LED 조명 스탠드 또는 가벼운 접시 같은 장비를 사용 하 여 샘플을 아래에서 밝히는.
2. 오픈 이미지 캡처 소프트웨어, 사진, 현미경 빛 경로 설정 되어 있는지 확인 하 고 카메라 목록에서 적절 한 카메라 클릭 합니다.
3. 나타나도록 여러 입자 초점면에 소프트웨어에 큰, 잘 정의 된 가장자리와 현미경을 조정 합니다. 10-20 x의 확대를 사용 하 여 상대적으로 깊은 초점 평면을 유지 하면서 입자를 측정.
   1. 일시적으로 한 천 배지를 제거 하 고 무대에는 마이크로미터를 놓습니다. 마이크로 미터에 눈금 표시 이미지 캡처 소프트웨어에 크게 집중 될 때까지 잘 초점을 조정 합니다.
   2. 이전 보정 하는 경우 현재 배율에 대 한 마이크로 비율에 있는 픽셀을 기록 합니다.
      1. 클릭 하 여 확대/축소를 100%로 설정 확대 > 실제 크기 를 선택 하 고 옵션 > 보정 다음 0 및 200 µ m 졸업식에 중심 수직 막대는 마이크로 미터의 긴 축 따라 주요 뷰포트에서 빨간 교정 바 정렬. 보정 대화 상자에서 현재 확대 수준과 200 µ m의 실제 길이 입력 합니다.
   3. 만약 이미 보정 메뉴 모음에서 선택 확대 하 고 선택 현재 확대율 레벨 보정을 확인.
      1. 선택 측정 > 라인 > 임의의 선. 0 졸업은 마이크로 미터의 긴 축 교차 클릭 하십시오. 200와 긴 축에 교차로에서 다시를 클릭 합니다. A 정확한 교정 표시 약 200 µ m. 삭제 선을 그것을 눌러 삭제를 클릭 하 고 확인 상자에서 예 를 누르면.
         참고: 카메라 및 교정 선택에 대 한 지시는이 하드웨어를 위해 사용 되는 소프트웨어를 특정. 비슷한 기능 다른 이미징 소프트웨어에서 사용할 수 있어야. 목표는 미크론 비율 정확한 입자 크기 측정에 대 한 이미지의 픽셀을 결정 하는.
4. 한 천 배지를 장착 하 고 이미징 소프트웨어에 최대 세부 사항을 달성 하기 위해 정밀한 초점을 조정.
5. 최대 이미지 품질 달성 이미징 소프트웨어를 조정 합니다.
   1. 비트 깊이 카메라 사이드바의 비트 깊이 패널에서 라디오 버튼을 선택 하 여 허용 되는 최대 값을 늘립니다. 카메라 사이드바의 색상/회색 패널에서 적절 한 라디오 단추를 선택 하 여 회색 음영 이미지를 수집 하는 소프트웨어를 설정 합니다.
   2. 노출과 히스토그램 사이 모든 오픈 사이드바 패널을 축소 합니다. 1.0으로 이득을 감소 하 고 깨끗 한 이미지에에서 나타납니다 뷰포트 히스토그램 히스토그램 상자의 양쪽 끝으로 잘립니다 하지 배포로 나타날 때까지 때까지 노출을 증가.
   3. 피하기 위하여 히스토그램과 부족을 조정 합니다. 카메라 측면 표시줄의 막대 그래프 패널에서 최저 값 밖에 그냥 히스토그램의 왼쪽된 경계 및 높은 값 밖에 그냥 오른쪽 경계를 밀어.
6. 저장 이미지는 압축 되지 않은 TIFF이미지 메타 데이터에 배율 정보를 포함 하 여, 사용 하는 파일 > 다른 이름으로 저장 TIFF 형식을 선택 하 고 되도록 교정 정보 저장 상자 대화 상자 확인 합니다.
   참고: 저장 공간 보정을 포함 하는 이미지 메타 데이터 수집 프로그램 간에 달라질 수 있습니다. 피지¹⁵, 파이프라인에 의해 사용 하는 기본 소프트웨어 가장 일반적인 이체를 이해 한다. 중요 한 정보를 기록 하는 픽셀 높이, 너비, 및 관련된 장치입니다.
7. 어느 모바일 단계를 사용 하 여 또는 수동으로 접시 자체를 이동, 이전 이미지를 왼쪽에서 오른쪽과 오른쪽에서 왼쪽으로 사이 격판덮개; 아래로 이동 하는 경로 다음 중복 되지 않는 다른 지역 선택 로 알려진 ' lawnmower 검색 무늬 '. 3.6 단계를 반복 하 여 충분 한 이미지 캡처 적어도 500 시각적으로 예상된 입자, 더는 더 나은 생산 됩니다.
   참고: 대안 패턴 (예:., 원형, 임의의) 허용 하지만 보고 되어야 한다. 디지털 봉합 생산 통해 모자이크에 조합에 대 한 여러 개의 겹치는 이미지 획득 결과 파일 크기는 크게 다운스트림 처리와 바느질에서 유물을 방해 소개 될 수 있습니다 하 고 현재 권장 되지 않습니다.
8. 잠재적인 후속 이미징에 대 한 이미지 분석 후 때까지 접시를 유지 합니다. 마지막 영상, 후 생물 폐기물에 대 한 적절 한 폐기.

4. 측정 하 고 분석 하는 입자 실루엣

1. 필요한 이미지 분석 소프트웨어 패키지를 설치
   1. 피지를 설치 (지침에 국립 보건원의 ImageJ v1.52e의 향상된 된 버전: https://imagej.net/Fiji/Downloads
   2. 지침에 따라 이미 존재 하지 않을 경우 git를 설치: https://git-scm.com/downloads
   3. Git 저장소¹⁶을 복제 하 여 입자 분석 코드를 취득 합니다.
      1. 명령줄에 입력 하 여 코드의 최신 버전을 검색:
         git 클론 https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis.git
         1. 분석 코드 다음 README.md 텍스트 파일에 있는 지침은 복제 저장소의 최상위 디렉터리에 설치 합니다.
            참고: git을 사용 하는, 최신 버전의 코드를 자동으로 검색 됩니다. Git를 사용할 수 없는 경우 그것은 또한에서 릴리스 페이지에 zip 파일로 코드 다운로드 수: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis/releases
   4. 선택적 매개 변수와 함께 처리 하는 디렉터리를 나열 하는 텍스트 파일을 편집 합니다. 매개 변수 및 예제 목록에 대 한 예/분석 하위 디렉터리를 참조 하십시오.
2. 입력 하 여 명령줄에서 분석을 실행 합니다.
   < 피지-경로 > \ImageJ-win64.exe-콘솔-매크로 SParMorIA-SludgeParticle_Morphological_Image_Analysis < paramsfile >
   여기서 < 피지-경로 > ImageJ win64.exe가 있는 디렉토리와 < paramsfile > 분석 설치를 설명 하는 텍스트 파일의 위치는
   참고: 실행 파일의 이름을 달라질 수 있습니다, 따라서 운영 체제 피지에 설치. 수와 이미지의 크기에 따라 분석 시간 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다 그리고 자동으로 실행 됩니다.
3. 품질 관리 검사를 수행
   1. 지정 된 출력 디렉터리의 오버레이 하위 디렉터리에 있는 품질 관리 파일을 검사 합니다. 스 퓨 리 어스, 누락, 그리고 저조한 캡처된 입자, 모든 배경 일치 하지 않는 회색된 윤곽선으로 명백한 이미지 note 같은 예제 그림 3 을 참조 하십시오. 입자 자료는 이제 실험 관련 분석 그림 생성에 대 한 준비.
4. 유명한 파일 및/또는 입자 무시 하 Id 분석 코드에 지정 하 여 전체 접시 또는 개별 입자를 거부 합니다. 예제/검열 관련 연구 및 Python 코드 저장소에서를 참조 하십시오.
5. 각 이미지에 지정 된 출력 디렉터리의 결과 하위 디렉터리에 깔끔한¹² 쉼표로 구분 된 텍스트 파일 저장에 대 한 이미지 분석 결과 사용 하 여 실험 구체적인 수치를 생성 합니다. 결과 파일을 읽는 방법의 예제를 보려면 예제/인물/R 및 예/인물/파이썬 하위 디렉터리를 참조 하십시오.

결과

생성 된 파일
그림 1 에 나와 있는 프로세스 분석 이미지 당 두 개의 파일을 생산할 예정 이다. 첫 번째 파일은 쉼표로 구분 된 값 (CSV) 텍스트 파일 개별 입자에 해당 하는 각 행과 열 영역, 순환 성, 견고성 등 다양 한 입자 통계 설명 ImageJ 수동¹⁷에 정의 된. 예제 CSV 파일 추가 정보 및 예제/데이터 디렉터리에 포함 됩니다.

그림 1: 프로토콜의 4 개 주요 단계를 설명 하는 그래픽 워크플로.

토론

이미지 분석 시스템은 상당히 강력 하 고 불 쌍 한 이미지 제거 되도록 품질 관리 조치는, 비록 샘플링, 접시 준비, 및 이미지 수집에 특정 문제에 적절 한 관심을 향상 시킬 수 모두 데이터의 정확도의 비율 이미지 품질을 전달 합니다.

샘플링 농도
대표 하는 샘플 촬영 되었습니다 가정, 가장 중요 한 단계는 충분 한 입자는 입자 겹치는 그리 집중 하는 동안 대표⁹ 와 효율적인 분석을 위한 존재입니다.

이 총 중단된 한 고체의 넓은 범위에 약 0.5 ~ 2 mL의 혼합된 액에 대응 있다 하지만 실험 관련 결정 할 수 있습니다. 지나치게 집중의 예는 지나치게-희석, 그리고 적절 한 입자 농도 기준으로 그림 5 에 나와 있습니다. 얼룩은 또한 영향을 입자 농도. -희석 지나치게 스테인드, 모호한 입자 밑 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10% 표백제 용액	Chlorox	31009	작업 공간 소독용.
15 mL 원심분리 튜브(캡 포함	Corning	430790	시료당.
50 mL 삼각 플라스크	Corning	4980-50	다른 용기는 >40 mL의 시료를 함유 할 수 있고
500 mL Kimax Bottle	Kimble-Chase	14395-50	또는
7.5 % gel을 제조하기 위해	한천 취급 한	BD	214010
데이터 분석 소프트웨어	N/A	N/A	R 또는 Python을 제안합니다
탈이온수	N/A	N/A 얼룩	및 한천을 준비하기에 충분합니다. 사용할 수 없는 경우 탭해도 됩니다.
데스크톱 컴퓨터	N/A	N/A	이미지 분석은 CPU를 많이 사용하지 않으므로 2017년경의 '일반' 데스크톱 컴퓨터면 충분합니다.
외장 하드 드라이브	Seagate	STEB5000100	완전히 필요하지는 않지만 이미지 수와 크기를 감안할 때 매우 유용합니다. 2TB 이상의 저장 공간이 권장됩니다.
FIJI	NIH	버전 1.51d	버전은 ImageJ 코어입니다. 플러그인은 작성 시점을 기준으로 업데이트되었습니다. 사용 가능 : https://imagej.net/Fiji/Downloads
GIT	오픈 소스	버전 2.19.1 이상	사용 가능 : https://git-scm.com/
이미지 캡처 소프트웨어	ToupView	버전 3.7.5177	카메라와 호환되는 모든 제품은 카메라와 함께 제공 될 수 있습니다. 공간 보정 데이터와 함께 TIFF 이미지를 저장할 수 있어야 합니다.
기계식(X/Y) 스테이지	OMAX	A512	완전히 필요하지는 않지만 이미지 획득에 큰 도움이 됩니다.
메틸렌 블루	Fisher	M291-100	Solid, 1% w/v 용액을 준비합니다.샘플당 5uL 용액.
현미경 카메라	OMAX	A35140U	현미경과 호환되는 모든 디지털 카메라. 10배 배율에서 픽셀당 최소 5um을 제공하는 해상도와 색상 채널당 픽셀당 최소 8비트의 동적 범위가 제안됩니다.
광학 스테이지 마이크로미터	OMAX	A36CALM1	또는 공간 보정에 충분합니다.
페트리 접시, 100mm	Fisher	FB0875712	샘플당 1개.
PPE	N/A	N/A	표준 실험복, 장갑 및 안경.
Sparmoria 매크로	NCSU	버전 0.2.1	github 저장소에서 사용 가능 : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis
입체 / 해부 현미경	Nikon	SMZ-2T	10-20 배 배율을 제공해야하며 내장 카메라 또는 CCD 장착 지점 프로피드로 디지털 사진을 허용해야합니다.