이 문서에는 ex vivo 공상 장기 형태로 결합 될 수 있는 메 추 라 기 및 닭 배아에서 순수 배아 조직 분리 하는 방법을 제공 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
배아 조직 분리 용량 차례로 발달 생물학에서 공개 키 프로세스에 확실 한 공헌을 제공 했다 메 추 라 기-치킨 키메라 시스템을 설정 하기 위한 필수적인 단계를 했다.
여기는 메 추 라 기를 미세 및 그것의 생물 학적 속성을 유지 하면서 효소 소화에 의해 닭 배아 조직 분리 하는 최적화 된 방법 설명. 절연, 후 48 헤 메 추 라 기에 대 한 생체 외에서 organotypic 분석 결과에서 두 종에서 조직 관련 및 닭고기 조직 고유 핵 기능 및 분자 마커 사이 세포 잡담 연구를 수 있도록 하 여 차별 수 있습니다. heterospecific 협회 조직입니다. 이 접근은, 그러므로, 공부는 foregut의 형성과 pharyngeal morphogenesis 동안 발생 등 매우 역동적인 공간 수정, 개발 프로세스에 복잡 한 조직 상호 작용을 위한 유용한 도구 endoderm 파생 된 기관입니다. 이 실험적인 접근 thymus 형성의 초기 단계 동안 엽 상피 상호 작용 연구를 처음 개발 되었다. 이, 미래의 thymic rudiment endoderm 파생 및 mesoderm 파생 mesenchyme는 각각 메 추 라 기 및 닭 배아에서 분리 했다.
용량의 관련된 조직 기관 생성 하는 더 닭 배아의 chorioallantoic 막 (CAM)에 접목 하 여 테스트할 수 있습니다. 캠은 영양분을 제공 하 고 explanted 조직에 가스 교류를 허용 한다. 비켜 개발에서의 10 일 후 공상 장기 기존의 형태학 방법으로 수확된 explants에 분석 수 있습니다. 이 절차 또한 수 있습니다 초기 개발 (생체 외에서 개발)에서 기관 형성 동안 조직 관련 기여를 공부 (비켜 개발)에서 organogenesis의 최종 단계에.
마지막으로, 향상 된 격리 방법 또한 제공 한다 3 차원으로 (3D) 보존 배아 조직, 조직 관련 유전자 발현 패턴의 고해상도 지형 분석에도 사용할 수 있습니다.
서론
1970 년대 초반에 우아한 메 추 라 기-치킨 키메라 시스템 르 Douarin, 새로운 수익원 개발1,2중 세포 이동과 세포 상호 작용의 역할을 이해 하 여에 의해 개발 되었다. 모델 두 종 사이의 셀 교환 것 크게 embryogenesis, 나중에 긴장의 형성 하 고는 조 혈을 포함 하 여 수많은 발달 과정을 연구 하는 데 사용 하는 경우 확인을 방해 하지 않는 전제에서 고안 되었다 시스템1. 예를 들어 후자 복용, 조 혈 창시자 thymic 상피 rudiment 식민지의 주기적 파도 처음 관찰 되었다 메 추 라 기-치킨 키메라 시스템3를 사용 하 여. Thymus, 세 번째 및 네 번째 pharyngeal 주머니 (3/4PP) endoderm의 미래의 영토 15-30 somite 단계 [배아 일 (전자) 1.5-E2.5]에서 기계적 및 효소 메 추 라 기 (q) 배아에서 분리 했다. 이러한 단계는 닭고기 햄버거와 해밀턴4 (HH)-단계 12 월 17 일에 해당합니다. 격리 절차 트립 신 효소 연결 된 mesenchyme에서 endoderm 해리를 사용 하 ....
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프로토콜
이러한 모든 실험 동물 관리 및 센트 Académico 드 메디 시 나의 윤리적 지침 따라 리스보아.
1. 수정 된 메 추 라 기 그리고 닭 계란 외피
- 장소는 3 일 동안 38 ° C 습도 인큐베이터에서 일본 메 추 라 기 (Coturnix coturnix japonica)의 알을 수정 된. 공기 챔버에 향하도록 계란 (계란 무뚝뚝한 끝)를 품 어.
참고: 습도 환경 인큐베이터의 밑에 물 컨테이너를 배치 하 여 이루어집니다. - 38 ° C 습도 인큐베이터에 2.5 일 동안 치킨 (갈 루스 갈 루스)의 수정 된 알을 품 어. 수평 위치에 알 품 어 고 상부 태아 위치를 식별할 수 숯불의 한 조각을 사용 하 여 표시 합니다.
참고:이 실험을 설정할 때 40 메 추 라 기 계란과 60 닭고기 달걀으로 시작.
2. 격리의 메 추 라 기 endoderm thymic rudiment의 예비 도메인을 포함 하
참고: 메 마른 조건에서 수평 층 류 두건 및 멸 균된 악기와 계란 조작 절차에 대 한 자료를 사용 합니다.
- Thymic rudiment의 추정 ....
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결과
프로토콜에는 여러 세포 및 개발 생물학 기술 접근에 사용 되는 조류 배아 조직 분리 하는 방법을 자세히 설명 합니다. 이 방법은 이전 thymus 형성5의 초기 단계 동안 엽 상피 상호 작용을 공부 고용 되었다. 여기, 새로운 결과 그림 1 과 그림 2, 비슷한 방법을 사용 하 여 표시 됩니다.
그림 1 . 유전자 발현의 대표적인 결과 연구의 3 차원으로 보존 추정 영토를.......
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토론
여기 상세한 배아 조직 격리 절차는 다른 생물학 문맥3,,56에 메 추 라 기-닭고기 공상 배아를 생산 하는 이전 기술에서 개선 되었다.
이 방식은 유전자 조작 이나 결정, 유전자 변형된 동물 모델의 사용을 제한 하지는 조직의 특정 마커를 사용 하 여 필요 없이 순수 배아 조직 분리에 적합 합니다. 그것은 능력을 제한 하는 요인이 되 고 순수한 조직 분리 개발 하는 동안 엽 상피 상호 작용을 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 개발 진행, 조직 및 두꺼운, 더 조밀한 그들의 별거는 더 어려운 같은 다른 인접 조직에 연결. 이 격리 절차가 아니다, 따라서, 개발, 즉 늦은 organogenesis의 나중의 단계에 적합.
이 메서드는 고유 3D 보존 배아 조직에서 유전자.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
저자는 원고의 중요 한 독서에 대 한 감사 이사벨 Alcobia 비디오 나레이션 대 한 마리 Henriques Instituto de Histologia e Biologia의 조직학 서비스에서 Vitor 쾌속 범선을 할 Desenvolvimento, Faculdade de Medicina 드 리스보아 Universidade 드 리스보아, 기술 지원에 대 한입니다. 우리는 특히 파울로 카에 이루와 휴고 실바 Unidade 드 audiovisuais (시청각 단위), Faculdade 데에서에서 빚을 Medicina 드 리스보아,이 비디오의 생산에 그들의 뛰어난 노력에 대 한 Universidade 드 리스보아. 친절 하 게 제공 Interaves 비디오 시스템을 갖추고 stereoscope Leica 마이크로 시스템즈 인정-계란을 기름 지 게 하 고 있다 농업-Pecuária, 메 추 라 기와 기여에 대 한 활발. 이 작품은 Faculdade 드에 의해 지원 되었다 Medicina 드 리스보아, Universidade 드 리스보아 (FMUL).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 닭 수정란 (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | 가금류 농장 | |
| 메추라기 수정란 (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP 원심분리기 튜브 | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP 원심분리기 튜브 | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm 파이렉스 접시 | Duran 그룹 | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm 파이렉스 접시 | Duran 그룹 | 21 755 48 | |
| 메탈 그리드 | Goodfellows | 세밀한 메시 스테인레스 스틸 그리드 | |
| 멤브레인 필터 | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore 막 필터 |
| 페트리 디쉬, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| 60 x 30mm 파이렉스 그릇 (작은 크기) | 슈퍼마켓에서 | ||
| 100 x 50mm 파이렉스 그릇 (대형 크기) | 슈퍼마켓에서 | ||
| 트랜스퍼 피펫 | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL 플라스틱 피펫 |
| 유리 파스퇴르 피펫 | Normax | 5426015 | |
| 슈퍼마켓에서 판매하는 투명 플라스틱 테이프 | |||
| 사이토케라틴(팬, 산성 및 염기성, 유형 I 및 II 사이토케라틴), 클론 Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P-3292 | 제조업체의 지침에 따라 25mg/mL 용액을 준비합니다. 분취 전에 원심분리기 및 여과를 하고 -20°C에서 보관하십시오. 분취액은 냉동 보관할 수 있습니다. 몇 년. |
| 파라포름알데히드 | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | 인비트로겐, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| 인산염 완충 식염수 (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN 항체 | 개발 연구 하이브리도마 은행 | QCPN | |
| RPMI 1640 매체, GlutaMAX 보충제 | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B 실리콘 엘라스토머 1.1Kg 키트 | ELKEM/Silmid | RH141001KG | 페트리 디쉬를 위한 뒷받침을 준비하기 위해 |
| Dumont #5 펜치 | 파인 사이언스 도구 | 11251-30 | 얇은 집게 |
| 매우 세밀한 Bonn 가위, 곡선 | Fine Science Tools | 14085-08 | 곡선형 가위 |
| 곤충 핀 | Fine Science Tools | 26001-30 | 0.3 mm 스테인리스 스틸 핀 |
| 마이크로 스패튤라 | Fine Science Tools | 10087-12 | 이식 스푼 |
| Minutien 핀 | Fine Science Tools | 26002-20 | 0.2 mm 스테인레스 스틸 마이크로 메스 |
| Minutien 핀 | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1 mm 스테인레스 스틸 마이크로 메스 |
| Moria 니켈 도금 핀 홀더 | Fine Science Tools | 26016-12 | 니켈 도금 핀 홀더 |
| Moria 천공 스푼 | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| 카메라 | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| 현미경 | Leica Microsystems | DM2500 | |
| 나노줌머 S360 디지털 슬라이드 스캐너 | Hamamatsu Photonics | C13220-01 | |
| 스테레오스코프 | Leica Microsystems | 라이카 M80 |
참고문헌
- Le Douarin, N. The Nogent Institute--50 years of embryology. The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. The migration of neural crest cells to t....
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