여기, 우리 소설 간격 접속점 세포 통신 분석 결과 갭 정션 변조 화학 약물 발견 및 독성 평가의 높은 처리량 검열에 대 한 설계에 대 한 프로토콜을 제시.
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이 논문에서
요약
초록
간격 접속점 (GJs)는 인접 한 셀 사이의 1 kDa 보다 작은 분자의 유포를 허용 하는 세포 막 채널. 그들은 생리 적 및 병 적인 역할을가지고, 약물 발견과 독물학 분석에서 글리제 변조기를 식별 하기 위해 높은 처리량 검열 (HTS) 분석 실험의 필요가 있다. 소설 요오드 화물-노랑 형광 단백질-간격 접속점 세포 통신 (난-YFP-GJIC) 분석 결과 수행이 필요 합니다. 그것은 안정적으로 노란 형광 성 단백질 (YFP) 변종, 그 형광은 요오드 화물, 또는 요오드 화물 운송업 자 SLC26A4 각각 침묵 민감하게 표현 하 설계는 기증자와 수락자 셀을 포함 하 여 세포 기반 분석 결과. 요오드 화물을 혼합된 문화는 두 종류의 세포에 추가 될 때 그들은 SLC26A4 전송 통해 기증자 세포를 입력 하 고 어디 그들이 YFP 형광 담금질 GJs 통해 인접 수락자 셀에 확산. YFP 형광 운동 모드에서 잘에 의해 잘 측정 된다. YFP 냉각 속도 글리제 활동을 반영합니다. 분석 결과 신뢰성과 HTS.에 사용 될 만큼 빠른 인간의 glioma 세포, LN215 세포를 사용 하 여 YFP-GJIC 분석 결과 대 한 프로토콜을 설명 합니다.
서론
간격 접속점 (GJs) 역할의 작은 분자의 확산을 허용 하도록 작성 채널 < 영양소, 대사 산물, 등 인접 한 셀 사이의 신호 분자 1 kDa. 접합 요소는 각 셀에 hemichannel 또는 connexon 포함 하 고 각 connexon 구성 6 connexins (Cxs)1. GJs 및 Cxs 글리제 억제제2,,34인 내는 다 환 방향족 탄화수소 (PAH) 등 발암 물질의 독성 분석 실험에 사용 되었습니다. 교란된 GJIC nongenotoxic 발암5,6와 연결 되었습니다. 잠재적인 치료 대상으로 GJ 참여 발작7,8, 심장 및 뇌 허 혈/reperfusion 상해9, 오 라10, 편두통에서에서 보호의 특정 하위에서 보고 되었습니다. 약물 유발 간 부상6....
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프로토콜
1. YFPQL 와 SLC26A4는 lentiviruses 세대
- 100mm 문화 접시에 confluency 80 %HEK293T 인간 미 발달 신장 세포를 성장 한다. Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청, 100 U/mL 페니실린와 100 µ g/mL 스 보충은 HEK293T 아래에 언급 된 다른 셀을 유지 하기 위해 전체 프로토콜 사용 문화 매체 이다.
- 10 분에 대 한 각 잘을 멸 균 폴 리-L-리 신 (PLL) 솔루션의 0.005%의 2 개 mL를 추가 하 여 코트 6-잘 배양 배지 PLL 솔루션을 발음 하 고 표면 살 균 물 2 mL로 두 번 씻어.
- 워시는 HEK293T 셀 10 mL의 인산 염과 식 염 수 (PBS)를 버퍼링 문화 매체의 3 분 추가 5 mL에 대 한 37 ° C에서의 0.25% trypsin EDTA 용액 2 mL와 함께 각 100 mm 접시에 셀 monolayers를 치료 하 고 셀 resuspend.
- hemocytometer에 셀 문화 매체에 250, 000 셀/mL로 세포 현 탁 액의 밀도 조정 하 고 lysine 코팅 6 잘 플레이트의 각 문화 매체의 2 mL에 500000 셀을 추가. 습도 5 셀을 품 어 % CO2
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결과
29 96 잘 문화 접시-YFP GJIC 분석 결과 LN215 YFPQL LN215를 사용 하 여 2320 화학 소설 GJIC 변조기를 식별 하기 위해 화면을 사용 했다-난− 셀. 대표 한 접시와 함께 얻은 결과 그림 2에 표시 됩니다. 각 잘에서 YFP 형광의 비율 그림 2A 에서 선 그래프로 표시 되 고 각 잘에서 GJIC 활동의 비율 그림 2B에 막대 그래프에 표시 됩니다. 부정적이 고 긍정적인 컨트롤 및 상영 했다 80 화학 물질은 표 1에 표시 됩니다. 각 잘 대우 되었다 화합물의 25 µ M로 10 분 Terbinafine 완전히 저해 GJIC과 homosalate GJIC.......
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토론
YFP-GJIC 분석 결과 때문에, 급속 한, 강력 하 고 저렴 한 HTS에 대 한 사용할 수 있습니다. HTS 분석 결과 강력한 간주 됩니다 경우 Z'-요소 0.525이상입니다. 참조 장 그 외 여러분 HTS 분석25의 적합성을 평가 하는 데 사용 하는 통계 분석에 대 한. LN215 셀 사용 했다 Z'-요소 > 어떤 분석 결과 최적화 없이 0.5. 다른 세포 유형 분석 결과 및 그것의 Z에 사용 됩니다 '-요소는 < 0.5, 견고성은21의 시험 시간 확장 하 여 향상 시킬 수 있습니다. Z를 LN215 및 호, 인간의 다리 셀, 셀 필요만 10 s'-팩터 > 0.521. 분석 결과는 기증자와 수락자 셀만, I-솔루션, C 솔루션 필요합니다. 광 등 calcein 오전 없습니다 추가 시 약이 필요 합니다. 이 GJIC 분석 결과의 또 다른 장점은 단일 음, .......
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공개 사항
저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.
감사의 글
이 연구는 기본 과학 연구 프로그램을 통해 국가 연구 재단의 한국 (NRF) 교육부의 재정 지원에 의해 지원 되었다 (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397, 및 2018R1A6A1A03023718).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 96웰 플레이트 | SPL | 30096 | |
| 염화칼슘(CaCl2) | Sigma | C5670 | 용액 |
| D-(+)-글루코스 | 시그마 | G7021 | C-용액, |
| 용액 Dimethyl sulfoxide (DMSO) | 시그마 | 276855 | |
| Hepes | Sigma | RES6003H-B7 | C-용액, |
| Lipofectamine 2000 용액 | Invitrogen | 11668-027 | 트랜스펙션 시약 |
| 염화마그네슘 육수화물 (MgCl2 6H2O) | Sigma | M2393 | C-solution |
| Microplate reader | BMG 랩테크 | POLARstar 오메가 415-1618 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| 폴리브레네 | 시그마 | H9268 | |
| 폴리-L-라이신 용액 | 시그마 | P4707 | |
| 염화칼륨(KCl) | 시그마 | P5405 | C-용액, 용액 |
| psPAX2 | 애드진 | #12260 | |
| 퓨로마이신 디하이드로클로라이드 | 시그마 | P8833 | |
| 염화나트륨(NaCl) | 시그마 | S5886 | C-용액, |
| 히록사이드나트륨(NaOH) | 시그마 | S2770 | |
| 요오드화나트륨(NaI) | 시그마 | 383112 | 용액 |
참고문헌
- Goodenough, D. a, Goliger, J. a, Paul, D. L. Connexins, connexons, and Intercellular Communication. Annual Review of Biochemistry. 65, 475-502 (1996).
- Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. M....
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재인쇄 및 허가
