심장 세포 치료를 위한 줄기 세포 DNA 무결성을 평가

요약

여기, 우리 세포 이식 전에 줄기 세포에서 DNA 무결성의 평가의 분석 실험 설정에 대 한 자세한 설명을 제공합니다.

초록

줄기 줄기 세포 유래 세포는 다양 한 퇴행 성 질환 재생 치료로 서 엄청난 잠재력이 있다. DNA는 줄기 세포를 포함 하 여 모든 셀에서 유전 정보의 창 고입니다 그리고 그것의 무결성은 재생 능력에 기본적 이다. 줄기 세포가 식 위한 필요한 수를 달성 하기 위해 실험실에서 급속 한 전파를 받 다. 빠른된 세포 성장 반응 산소, 생성, 에이전트 alkylating 등 축적 된 대사 산물에 의해 DNA 무결성의 손실에 지도 한다. 이 세포를 이식 가난한 engraftment 및 악화 장기의 재생 발생할 것 이다. 또한, 돌연변이, DNA 불안정, 세포 노화, DNA 손상 세포 리드를 이식 하 고 가능 하 게, 생명이 암 같은 질병. 따라서,이 식 위한 세포의 적합성을 평가 하는 품질 관리 방법에 대 한 즉각적인 필요가 있다. 여기, 우리는 이전에 세포 이식 줄기 세포의 DNA 무결성의 평가 대 한 단계별 프로토콜을 제공합니다.

서론

실험 및 임상 증거 세포 이식 적당히 마음^{1,2,,34,5 실패의 좌 심 실 수축 성능을 향상 시킬 수 보여줍니다. ,6,7,,89}. 최근 진보 심혈 관 재생;에 대 한 기회를 더 매력적인 연 이러한 체세포 pluripotency 유도 다른 심장 계보, 중요 한 것은 cardiomyocyte (CM)^10, 으로이 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)를 구분 하기에 재활 요인의 강제 식 포함 ^{11 , 12 , 13}. 인위적으로 생성 된 Ipsc, iPSC 파생 CM (iPS-CM)를 포함 하 여 모든 세포에서 유전 물질은 DNA. DNA에 저장 된 유전 지시 지시 성장, 개발 및 셀, 조직, 장기, 그리고 유기 체 기능. DNA는 불활성; 세포 대사 산물, 반응성 산소, 생성, 질소 종 등 하 고 에이전트 alkylating 손상 될 수 있습니다 원인 DNA 생체 외에서 그리고 vivo에서^14,15,,1617. 중요 한 것은, DNA 손상 중요 한 주파수를 가진 모든 셀에 직관적으로 발생합니다. 경우 이러한 손해는 해결 되지 않으면, 그것은 DNA 돌연변이, 세포 노화, DNA와 세포 무결성, 그리고 아마도, 질병, 생명을 위협 하는 암 등의 손실 이어질 것입니다. 따라서, DNA 무결성 유지 특히 Ipsc, 병원에서 엄청난 잠재력을 가진 어떤 셀에 필수적 이다.

수량 및 고립 된 게놈 DNA의 무결성을 평가, 고가의 장비 시장에 유효 하다. 그러나, 셀을 분리 하지 않고 셀에 DNA 무결성을 평가 하기 위해 아무 간단 하 고 비용 효율적인 방법이 있다. 또한, DNA 분리 하는 동안 DNA 저하 사용자 유도 이러한 메서드를 사용 하 여 주요 단점 중 하나입니다. 단일 셀 젤 전기 이동 법 (혜성 분석 결과 라고도 함)^18,19 와 γH2A.X immunolabeling⁸ 기술 연구 실험실에서 DNA 손상 평가 대 한 근본적인 접근 있습니다. 이러한 두 가지 방법 고가의 장비 또는 DNA 무결성^8,,2021분석 하 고립 된 게놈 DNA를 필요 하지 않습니다. 이후, 이러한 기술은 전체 셀; 수행 되었습니다. 샘플 준비 하는 동안 사용자 유도 DNA/RNA/단백질 저하는 이러한 프로토콜에 영향을 미치지 않습니다. 여기, DNA 손상 및 줄기와 줄기 세포 유래 세포에서 DNA 손상 응답 평가, 우리 혜성 분석 결과 및 γH2A.X immunolabeling를 모두 수행 하는 단계별 프로토콜을 제공 합니다. 또한, 결합이 두 가지 방법, 제안 한다 순진한 평가 이식에 대 한 셀의 적합성을 평가 하는 데 사용할 수 있습니다.

혜성 분석 결과, 또는 단일 셀 젤 전기 이동 법, 세포에서 DNA 나누기를 측정 한다. 낮은 녹는 agarose에 포함 된 셀은 supercoiled DNA를 포함 하는 양식 nucleoids을 lysed. 전기 이동 법, 그들의 거 대 한 크기와 매트릭스 단백질 그들의 활용 그대로 DNA 제한 마이그레이션 갖습니다 반면 agarose 숨 구멍을 통해 작은 조각 조각난된 DNA와 깨진된 DNA 가닥의 마이그레이션합니다. 형광 현미경으로 얼룩진된 DNA의 패턴은 혜성을 모방합니다. 그대로 DNA를 포함 하는 혜성 머리와 꼬리 조각의 구성 및 고장 DNA 가닥. DNA 손상의 분수는 그대로 DNA (혜성 머리) 강도 기준으로 손상 된 DNA (혜성 꼬리)의 형광 강도 의해 측정할 수 있습니다. 그림 1과 같이 매개 변수 꼬리 순간을 계산할 수 있습니다.

DNA 손상 히스톤 H2A의 인 산화를 유도 한다. ATM, ATR, 및 DNA-PK kinases 여 Ser139에서 (γH2A.X) X. 인 산화 그리고 H2A의 모집입니다. DNA 가닥 나누기에서 X DNA 손상 응답 (DDR) 이라고 하 고 DNA 손상 후 급속 하 게 일어난다. 이 과정, 세포 주기 검문소 중재 체포 및 DNA 복구 프로세스가 시작 됩니다. DNA 수리 완료 후 γH2A.X dephosphorylated 이며 가수분해에 의해 비활성화. 연장 하 고 여러 개의 DNA 가닥 나누기 DNA에 γH2A.X foci의 축적으로 이어질. 이 DNA 손상 및 DNA 무결성의 손실 복구 하 셀의 무 능력을 나타냅니다. 이러한 γH2A.X foci DNA에 의해 확인 될 수 있다 그리고 2 절에서 프로토콜을 사용 하 여 DDR foci의 수를 계산 하실 수 있습니다.

프로토콜

1. 혜성 분석 결과

1. 시 약 준비
   1. 낮은 용 해 점 agarose 낮은 녹는 agarose의 500 mg 100 ml의 DNA-장소/물 RNA-무료. agarose를 녹이 고 때까지 전자 레인지에서 병을 열. 37 ° C 물 목욕까지 필요에 병을 배치 합니다.
      참고: 추가 읽기를 위해 Azqueta 그 외 여러분, DNA 해제 시간 및 여러 전기 요소²³agarose 농도의 영향을 공부한 참조.
   2. 재고 염료 솔루션 작업 x 1를 1:10,000 비에 트리 스-EDTA (테) 버퍼에 SYBR 녹색 DNA 염료 희석. 이 염료는 빛에 민감한, 그래서 어두운 장소에 보관.
   3. 세포 세포의 용 해 버퍼에 대 한 분해 세포의 용 해 버퍼의 100 mL (2.5 M NaCl, 0.1 m M EDTA, 10 mM Tris, 1% 트라이 톤 X-100) 이온을 제거 된 물 (디 H₂O). 그런 다음, 추가 10 M NaOH pH 10.0 조정. 4 ° c.에 버퍼를 냉각
   4. 알칼리 성 DNA-해제/전기 실행 버퍼에 대 한 해산 디 H₂o. 쿨 4 ° c 버퍼에에서 알칼리 성 해결책 (0.3 M NaOH, 1 mM EDTA) 1 리터 PH를 확인 > 13.
   5. 도장된 혜성 슬라이드 유리 슬라이드에 0.5 %agarose 몇 방울을 놓습니다. 즉시, 다른 슬라이드의 평평한 표면에 사용 하 여, agarose 코팅의 얇은 층을 형성 하는 agarose 확산.
      참고: 사용 하기 전에 슬라이드를 건조.
   6. IPS 세포 배양에 대 한 간단히 문화 iPS 세포 지하실 막 매트릭스 코팅 ( 재료의 표참조) 문화 접시 mTESR1 문화 매체에 confluency에이 때까지.
      참고: 인간 심장 섬유 아 세포 파생 iPS 세포는이 프로토콜에 사용 되었다. 프로그래밍의 iPS 세포 파생 문화 우리 연구 그룹^12,13,21에서 최근 기사에 설명 되어 있습니다.
2. 샘플 준비
   1. 문화 매체를 삭제 하 고 셀을 씻어. 해리 초연 솔루션을 사용 하 여 셀 ( 재료의 표참조). 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 셀 펠 릿을 세척 하 고 resuspend 1 x 10⁵ 셀/mL에 PBS에 셀.
3. 샘플 슬라이드 준비
   참고: 자외선 빛 유도 하는 세포의 손상을 방지 하려면 낮은 조명 조건에서 다음 단계를 수행 합니다.
   1. 세포 현 탁 액 및 agarose 솔루션의 90 μ의 믹스 10 μ (1시 10분 비율) 튜브에서. 장소는 37 ° C 물 목욕에서 튜브는 agarose 응고 하지 않도록.
   2. 공기 방울을 소개 하지 않고 솔루션을 혼합 하 고 플라스틱 도장된 혜성 슬라이드에 70 μ/자리. 피 펫 팁을 사용 하 여 얇은 레이어를 셀 agarose 혼합 확산. 15 분 동안 4 ° C에 슬라이드를 놓습니다.
   3. 컨테이너에 완전히 찬 세포의 용 해 버퍼에 슬라이드 잠수함. 1 시간에 4 ° C에서 어둠 속에서 컨테이너를 놓습니다.
   4. 냉 알칼리 성 해결책에 세포의 용 해 버퍼를 바꿉니다. 슬라이드는 완전히 빠져들 다는 것을 확인 하십시오. 30 분 동안 4 ° C에서 어둠 속에서 컨테이너를 놓습니다.
4. 전기 이동 법
   1. 수평 전기 탱크에 슬라이드를 놓습니다. 슬라이드는 완전히 빠져들 때까지 차가운 알칼리 성 전기 이동 법 버퍼 탱크를 채우십시오. 15 ~ 30 분 1 V/cm에 전압을 적용 합니다.
      참고: 총 전압 = x 1 V 전극 사이의 거리
   2. 컨테이너에 완전히 찬 디 H₂o. 슬라이드 잠수함 2 분 후 디 h 조₂O를 제거 하 고 신선한 디 H₂o. 반복이이 단계를 추가 합니다.
   3. 찬 70% 에탄올과 디 h 조₂O를 교체 합니다. 부드럽게 5 분을 기다려 제거 슬라이드, 기울기, 없고 그것은 건조.
   4. 건조 되 면, 각 자리를 희석된 DNA 염료의 100 μ를 추가 합니다. 실 온에서 15 분을 기다립니다. FITC 필터를 사용 하 여 epifluorescence 현미경에서, 샘플 당 총에서 50 ~ 100 혜성의 이미지를 가져가 라.
5. 이미지 분석 및 결과의 계산
   1. 혜성, 점수는 국립 보건원의 (NIH) 사용 하 여 혜성 분석 결과 플러그인 ImageJ (ImageJ 여기 다운로드: https://imagej.nih.gov/ij/download.html; 여기 플러그인 다운로드: https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/).
      참고: 플러그인 분석을 수행 하기 위해 모든 세부 정보를 포함 하는 PDF 명령을 함께 제공 됩니다. 또한, 혜성 분석의 스크린샷은 그림 2A-C에 표시 됩니다. 제어 및 독 소 루비 (Doxo)의 대표적인 혜성 이미지-대우 iPS 세포 및 혜성의 정량화 그림 3A-C에 나와 있습니다.

2. DNA 손상 응답

1. 샘플 및 시 약 준비
   1. IPS CM 세포 배양에 대 한 문화 iPS-CM 세포 지하실 막 매트릭스 코팅 ( 재료의 표참조)에 confluency에이 때까지 B-27 (CMM) 보충 RPMI 매체에 문화 접시.
      참고: 인간 iPS 세포 유래 cardiomyocytes은이 프로토콜에서 사용 되었다. Cardiomyocytes에 iPS 세포 분화에 대 한 프로토콜은 우리의 연구 그룹^12,13,21에서 최근 기사에서 찾을 수 있습니다.
   2. IPS-CMs 챔버 슬라이드에 씨앗
      1. IPS-CM 우물에서 문화 매체를 버리십시오. 3 회 PBS로 세포 세척.
      2. 잘 당 0.25 %trypsin 1 mL을 추가 하 고 37 ° C 5 분 표 셀 분리에 대 한 현미경 접시에서 품 어. CMM는 트립 신을 막으려고의 1 mL를 추가 합니다.
      3. 15 mL 튜브와 4 ° C와 200 x g에 5 분 동안 원심 분리기에 세포 현 탁 액을 배치 합니다. 매체를 폐기, CMM의 1 mL를 추가 하 고 셀을 resuspend. 셀을 계산 하 고 20 x 10⁵ 셀 CMM의 1.6 mL를 셀 수를 조정 합니다.
      4. 씨 8 잘 챔버의 당 세포 현 탁 액의 200 µ L 슬라이드 ( 재료의 표참조). 부드럽게 잘 주위 세포를 확산 하 고 37 ° c.에 품 어 슬라이드를 누릅니다
   3. IPS-CM 독 소 루비 치료에 대 한 Ip CM 우물에서 문화 매체를 삭제 합니다. PBS로 세포 세척. 1 μ M 독 소 루비 셀 치료 4 헤 대 한 CMM 매체를 발음 하 고 PBS로 세포 세척.
   4. 블로킹 버퍼에 대 한 준비 10 mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 솔루션 3 %BSA 및 0.05%의 트라이 톤 X-100. 블로킹 버퍼의 10 mL를 준비 하려면 준비 BSA 솔루션의 9 mL를 정상 당나귀 혈 청 1 mL를 추가 합니다.
   5. 1 차적인 항 체 솔루션에 대 한 안티 토끼 인 히스톤 H2A의 1 μ를 추가 합니다. 블로킹 버퍼의 200 μ 항 체 (Ser139) X.
   6. 이차 항 체 믹스에 대 한 블로킹 버퍼의 200 μ에 형광 색소 활용 된 항 토끼 이차 항 체, DAPI, 및 형광 색소 활용 된 phalloidin의 각 1 μ를 추가 합니다.
2. Immunolabeling
   1. 3 회 PBS로 세포 세척 하 고 각 우물에 갓된 4 %paraformaldehyde (PFA)의 200 μ를 추가. 실 온에서 어둠 속에서 20 분에 대 한 셀을 수정 합니다. PBS로 세포 세척.
   2. PBS를 제거 하 고 실내 온도에 습도 챔버에 잘와 30 분에 대 한 블록 당 블로킹 버퍼의 200 μ를 추가. 블로킹 버퍼를 제거 하 고 기본 항 체 솔루션의 200 μ를 추가 합니다. 실내 온도, 습도 챔버에 45 분 동안 품 어. 다음, 세 번 PBS와 웰 스 워시.
   3. PBS를 제거 하 고 이차 항 체 혼합의 200 μ를 추가. 실내 온도, 습도 챔버에 45 분 동안 품 어. 다음, 세 번 PBS와 웰 스 워시. Antifade와 함께 그들을 장착 하기 전에 디 H₂O 세척. coverglass 놓고 4 ° c.에 어둠 속에서 슬라이드 저장
   4. Epifluorescence 현미경을 사용 하 여, 샘플 당 임의의 필드의 3-5 이미지 그림 4A와 같이 고 이미지 분석을 진행.
3. DDR foci의 계산
   1. 다운로드 및 설치 CellProfiler²⁴ (http://cellprofiler.org).
   2. 참고: 이 연구에서 처리 하는 이미지는 CellProfiler 버전 2.1.1 사용 하 여 수행 되었다. 사용 된 CellProfiler에 대 한 자습서는 다른 곳에서 찾을 수 있습니다 (https://www.youtube.com/watch?v=PvhRL9xpduk & 목록 = PL7CC87670239B4D10). CellProfiler의 최신 버전은 사용 되는 경우 파이프라인 부 적응이 필요할 수 있습니다.
   3. 파이프라인 punctae_gH2AX.cpipe를 다운로드 합니다. 선택 파일 > 가져오기 > 파이프라인 파일에서 punctae_gH2AX.cpipe를 선택 하 고.
   4. 분석 (그림 5A)에 대 한 입력 모듈/이미지 섹션에서 파일 목록 창에 γH2A.X foci의 인수 이미지가 포함 된 폴더 끌어서 놓습니다. 그림 5A-L와 같이 그런 다음 지침을 따르십시오.
   5. 이미지에 대 한 다음 매개 변수를 설정:
      1. 분석을 위해 원하는 이미지 파일 목록끌어다 놓습니다. 입력 모듈에서 이미지 를 선택 합니다 ( 그림 5A 모듈 설정 참조). 입력 모듈에서 메타 데이터 를 선택 합니다 ( 그림 5B 모듈 설정 참조). 입력 모듈에서 NamesAndTypes 를 선택 합니다 ( 그림 5C 모듈 설정 참조).
      2. 그룹선택 없음. 분석 모듈에서 ColorToGray 를 선택 합니다 ( 그림 5D 모듈 설정 참조).
   6. 분석 모듈에서 선택 부드러운 ( 그림 5E 모듈 설정 참조).
      참고: 이 값은 이미지 해상도 따라 최적화 할 수 있습니다.
   7. 분석 모듈에서 IdentifyPrimaryObjects 를 선택 합니다 ( 그림 5 층 모듈 설정 참조).
      참고: 이 값을 전체 핵 선택 되어 있는지 확인 최적화. 이 단계 후 컴퓨터 지연 될 수 있습니다.
   8. 분석 모듈에서 선택 부드러운 ( 그림 5G 모듈 설정 참조).
      참고: 이 값은 이미지 해상도 따라 최적화 할 수 있습니다.
   9. 분석 모듈에서 EnhanceOrSuppressFeatures 를 선택 합니다 ( 그림 5 H 모듈 설정 참조).
   10. 분석 모듈에서 IdentifyPrimaryObjects 를 선택 합니다 ( 그림 5I 모듈 설정 참조).
       참고: 이 값은 punctae가 선택 되어 있는지 확인을 최적화 합니다. 이 단계 후 컴퓨터는 다시 지연 될 수 있습니다.
       1. 분석 모듈에서 RelateObjects 를 선택 합니다 ( 그림 5J 모듈 설정 참조). 분석 모듈에서 ClassifyObjects 를 선택 합니다 ( 그림 5 K 모듈 설정 참조). 분석 모듈에서 ExportToSpreadsheet 를 선택 합니다 ( 그림 5 L 모듈 설정 참조).
       2. 이미지 분석을 수행 하려면 하단 왼쪽된 패널에서 이미지 분석 을 클릭 합니다. 분석의 성공적인 완료에 여러 이미지 생성 됩니다 (그림 6A-F).
          참고: 사용자는 미래의 참고를 위해이 이미지를 저장 해야 합니다.
       3. 생성 되 고 컴퓨터에 적절 한 위치에 저장 하는 추가 분석을 위해 정량 데이터를 포함 하는.csv 파일 note MyExpt_Image라는 스프레드시트에서 열 B와 D는 각각 5와 더 많은 punctae에는 핵의 수가 있을 것 이다. 핵의 총 수를 B 및 D 열을 추가 합니다.
   11. 단계 2.3.3-2.3.8 (모든 분석 하기 전에 MyExpt_ 파일 이름 변경) 모든 이미지를 반복 합니다. 그림 4C와 같이 DNA 무결성을 평가 하기 위한 음모를 만들 수 있습니다.

결과

인간 유도 만능 줄기 세포를 배양 하 고 DNA 무결성의 측정으로 사용 되었다, DNA 손상 및 꼬리 순간 혜성 분석 결과 의해 분석 되었다. iPS 세포는 낮은 녹는 점 agarose에 포함 되었고 유리 슬라이드에 배치. 셀, 다음, 세포의 용 해 버퍼, 이어서 supercoiled DNA를 알칼리 성 해결책으로 취급 됩니다. Nucleoids electrophoresed 했다 고 혜성 DNA 염료 (그림 1A-D)에 의해 시각화 했다. 혜성, 혜성 분석 결과 플러그인 (그림 2A-C)를 사용 하 여 ImageJ로 분석 되었다.

인간 iPS 세포 Doxo DNA 손상을 유도 하 고 긍정적인 컨트롤...

토론

DNA 무결성을 셀 무결성을 그렸다. 손상된 DNA와 세포 스트레스에 자주 하 고 결국 그들의 완전성을 잃고. 줄기와 줄기 세포 유래 세포 이식 목적으로 전파 되 고 되는 그들의 원하는 기능을 수행 하는 셀에 대 한 주은. 손상된 DNA와 세포 이식 셀^8,20의 성능과 가난한 engraftment 속도 발생할 것 이다. 따라서, 세포 이식 전에 DNA 무결성 검사는 필요한 품질 관리 프로토콜입니다. 여기 우리 두 비용 효과적인 접근 방식, 즉는 혜성 분석 결과 및 γH2A.X 면역 형광 라벨, DNA 손상 및 줄기와 줄기 세포 유래 세포의 품질 평가를 설명 합니다.

세포 노화의 주요 원인 세포에서 DNA 손상의 축적 생각. 혜성 분석 결과 사용 하 여, 알 베이커 그 외 여러분 분석²²젊고 노화 인간 피부 섬유 아 세포 DNA 손상....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.25% 트립신	코닝	25200056
8웰 챔버 슬라이드	밀리셀	PEZGS0816
Accutase	Stemcell Technologies	7920	세포 분리 솔루션
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson Immuno Research Laboratories	711-545-152 (RRID: AB_2313584)
소 혈청 알부민	시그마-알드리치	A7906
Cy3 AffiniPure 당나귀 안티 래빗 IgG	잭슨 면역 연구소	711-165-152 (RRID:AB_2307443)
DAPI	시그마-알드리치	D9564
Gibco B-27 보충제, 무혈청,	Gibco	17504-044
Matrigel 성장 인자 감소	코닝	354230
mTeSR1	스템셀 기술	85850
팔로이딘A488	라이프 테크놀로지	A12379
포스포-히스톤 H2A. X (Ser139) 항체	세포 신호 기술	2577 (RRID: AB_2118010)
RPMI	Gibco	11875-093
SYBR  녹색 I 핵산 젤 얼룩	Sigma-Aldrich	S9430
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100
UltraPure 저융점 Agarose	Invitrogen	16520050
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000	Antifade