간단한 ATP 측정 분석 결과 및 라이브/죽은 방법 얼룩 계량 ceftriaxone 치료 후 Neisseria gonorrhoeae 생존을 시각화 하 사용 되었다. 이 프로토콜 검사 어떤 항생제의 항균 효과를 확장할 수 있습니다 고 박테리아 biofilms에서 항생제의 최소 억제 농도 정의 하기 위해 사용할 수 있습니다.
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방법 논문
정량 검사의 항생제 자화 율 Neisseria gonorrhoeae 집계를 사용 하 여 ATP 이용 상업적인 분석 실험 및 라이브/죽은 얼룩
이 논문에서
요약
초록
항생제 내성 Neisseria gonorrhoeae (GC)의 출현은 세계적인 건강 위협이 고 치료 하지 못하는 개인을 식별 하는 필요를 강조. 이 그램 음성 박테리아는 인간에서 독점적으로 임 질을 발생합니다. 감염, 동안 양식 집계 biofilms 하 수 있다. 최소 억제 농도 (MIC) 테스트 항생제 자화 율을 결정 하 고 적절 한 치료를 정의 하기 위해 사용 됩니다. 그러나, vivo에서 박멸 및 실험실 결과 관계의 메커니즘은 알려져 있지 않습니다. GC 집계 항생제 자화 율에 영향을 미치는 방법과 집계 크기와 항생제 자화 율 사이의 관계를 표시를 검사 하는 방법 개발 되었다. 때 GC 집계, 그들은 더 죽이 항생제에 저항력이, 센터에서 박테리아와 함께 주변에 그 보다 더 나은 ceftriaxone 치료를 생존. 데이터 표시 N. gonorrhoeae 집계 표준 한 천 격판덮개 기반 마이크 메서드를 사용 하 여 반영 되지 않습니다 ceftriaxone의 민감성을 줄일 수 있습니다. 이 연구에 사용 되는 방법은 연구자 임상 관련 조건 하에서 세균 자화 율 테스트를 수 있습니다.
서론
임 질은 일반적인 성병 감염 (STI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), 그람 음성 diplococcal 박테리아는이 질병의 원인이 되는 대리인. 생식 기 감염의 증상 통증 배 뇨, 일반화 된 생식 기 통증, 그리고 요도 방전 하는 동안 발생할 수 있습니다. 감염이 종종 무 증상2,3,,45, 이며 이로써 확장된 식민. 그들은 유기 체의 전송을 촉진 가능성이 있고이 골반 염증 성 질환 (PID) 등의 합병증으로 이어질 수 있습니다 gonococcal 감염 (DGI)6전파 이러한 치료 감염 주요 건강 관심사는. 항생제 내성 임 질은 중요 한 공중 위생 위기와 증가 사회경제적 부담7. Cephalosporins 감소 민감성 ceftriaxone8azithromycin 또는 doxycycline 결합 듀얼 치료에서 단일 항생제 치료 처방 변경 결과입니다. Ceftri....
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프로토콜
1. 일반적인 유지 보수의 GC 변종
- N. gonorrhoeae 긴장 행진 1% GCK agar에 켈로그18 (표 1, 표 2) 냉장고 주식에서 보충 하 고 5% CO2 16-18 헤 사용 MS11 단계 변수 Opa (MS11Opa +), 아니 Opa (MS11ΔOpa), 표현에 대 한 37 ° C를 품 어 또는 잘린된 로스 (MS11ΔLgtE)입니다.
- 신중 하 게 부정적인 pili (어두운 가장자리 없이 식민지) 또는 양성 (어두운 가장자리 식민지) 식민지 식민지 형태학19 해 가벼운 현미경 및 새로운 GCK 플레이트에 연속 사용에 따라 각 스트레인에서 선택 합니다.
- 사용 하기 전에 16-18 h 5% CO2 와 37 ° C에서 품 어.
2. 생존 GC 집계의 정량화
- 메 마른 주걱을 사용 하 여 GC를 수집 합니다. 면봉 접시에서 GC와 미리 데워 국물 (GCP, 표 3)에 다시 중단 GC 1%와 4.2% NaHCO3 켈로그 솔루션
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결과
두 가지 방법을 사용 했다: ATP 사용률 분석 결과 및 라이브/죽은 얼룩 분석 결과. 결과 결합 하거나 개별적으로 항생제 치료 후 집계 내 세균 생존을 검토를 위해 사용 될 수 있습니다 합니다. ATP 사용률 분석 결과 미 균 biofilms20,21에서 정확 하 게 실행 가능한 박테리아를 측정 하기 위해 표시 되었습니다. 여기, MS11Opa + 필 + 스트레인 항생제 자화 율에서 GC 집계의 역할 검사 사용 되었다. 비 집계 MS11Opa + 필 +, 집계 MS11Opa + 필 +, 또는 집계 및 다음 쥡니다 MS11Opa + 필에 의해 중단 + 직렬 희석 ceftriaxone 및 ATP 수준 측정 (그림 1A)로 치료 했다. 비교 백분율 생존와 항생제 치료를 하.......
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토론
박테리아는 인체 감염 시 biofilms을 형성할 수 있다. 전통적인 마이크 테스트는 biofilm에서 박테리아를 박멸 하는 데 필요한 농도 반영 되지 않을 수 있습니다. biofilm에 항균 효과 테스트 하려면 방법 biofilm 바이오 매스를 기반으로 CFUs 도금 biofilm 구조의 영향으로 인해 잘못 된 될 수 있습니다. 예를 들어 도금 방법은는 biofilm 중단 될 수 있습니다 하는 경우 작동 합니다. 따라서, 얻은 CFU 실행 가능한 박테리아의 실제 번호 보다 낮은 수 있습니다. 그러나 머릿속 죽은 및 라이브 박테리아는 biofilm 내의 측정 biofilm 내의 박테리아의 생존에 대 한 설립 되었습니다,, 구조와 biofilm의 밀도 따라 얼룩이 지는 실패할 수 있습니다는 biofilm에 침투 하 여 발생 한 부정확 하 고 과소 평가 생존 속도입니다.
여기 방법의 치료 후 세균 생존을 측정 하는 양적 및 시각화 분석 결과 사용 합니다. 이 방법의 장점은 실제 감염.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 작품은 D.C.S.를 되었다 AI123340 건강의 국립 연구소에서 교부 금에 의해 지원 되었다. L.-C.W., jw 메리어트, 교류, E.N. 부분/메릴랜드 대학에 의해 투자 하는 "첫 해 혁신 및 연구 경험" 프로그램에 참여에 지원 했다. Funders 게시, 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 또는 원고 준비에 전혀 역할을 했다. 우리는 모든 현미경 실험을 위한 UMD CBMG 이미징 코어를 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 100x Kellogg의 보충제 | |||
| Agar | United States Biological | A0930 | |
| BacTiter Assay | Promega | G8232 | |
| Ceftriaxone | TCI | C2226 | |
| Difco GC 중간 베이스 | BD | 228950 | |
| 질산철, 비수화물 | Sigma-Aldrich | 254223-10G | |
| 포도 | Thermo Fisher Scientific | BP350-1 | |
| L-글루타민 결정성 분말 | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| BacLight 생염색/사염색 | Invitrogen | L7012 | |
| MS11 Neisseria gonorrhoeae 균주 | Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute가 친절하게 제공했습니다. 연구 | ||
| 산칼륨 이염기성 (K2HPO4)Fisher | Scientific | P290-500 | |
| 인산칼륨 일염기성 (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| 프로테오스 펩톤 | BD Biosciences | 211693 | |
| 염화나트륨 (NaCl) | Fisher Scientific | S671-10 | |
| 가용성 전분 | Sigma-Aldrich | S9765 | |
| 티아민 피로 인산 | Sigma-Aldrich | C8754-5G | |
| 장비 | |||
| 페트리 접시 | VWR | 25384-302 | |
| 8-well 커버슬립 바닥 챔버 | Thermo Fisher Scientific | 155411 | |
| 96웰 조직 배양 플레이트 | Corning, Falcon | 3370 | |
| Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) | Nuaire | 32776 | |
| CO2 인큐베이터 | Fisher Scientific | 라이브 이미징 챔버가 장착된 모델 3530 | |
| 컨포칼 현미경 | Leica | SP5X | |
| Corning 96 웰 블랙 폴리스티렌 마이크로플레이트 | 코닝 | 3904 | |
| 글로맥스 일루미네이터 | Promega | E6521 | |
| 피펫 팁(0.1-10 &마이크로; L) | Thermo Fisher Scientific | 02-717-133 | |
| 피펫 팁(1000 &마이크로; L) | VWR | 83007-382 | |
| 피펫 팁 (200 µ L) | VWR | 53509-007 | |
| 분광 광도계 Ultrospec 2000 UV | Pharmacia Biotech | 80-2106-00 | |
| 멸균 15ml 원추형 튜브 | VWR | 21008-216 | |
| 멸균 마이크로 원심분리기 튜브(1.7mL) | Sorenson BioScience | 16070 | |
| 멸균 폴리에스터 팁 애플리케이터 | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Sonicator | Kontes | 9110001 |
참고문헌
- CDC STD Facts. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: http://www.cdc.gov/std/gonnorrhea/STDFact-gonorrhea-detailed.htm (2017).
- den Heijer, C. D., et al. A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorr....
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