세포내 캘리포니아2 + 제자리에서 신호 계량 Spatio 시간적 매핑 및 입자 분석 기법에의 응용

Summary

유전자 인코딩된 Ca^{2 +} 지표 (GECIs) 근본적으로 어떻게 현장에서 캘리포니아^{2 +} 이미징 수행 달라졌다. 이러한 녹음에서 데이터 복구를 최대화 하기 위해 캘리포니아^{2 +} 신호의 적절 한 분석이 필요 합니다. 이 종이에 프로토콜 캘리포니아^{2 +} 신호를 원래의 spatiotemporal 매핑 및 입자 기반 분석을 사용 하 여 기록의 정량화를 촉진 한다.

Abstract

캘리포니아^{2 +} 이미징 격리 된 셀 또는 그대로 조직 내의 세포의 특정 종류의 종종 캘리포니아^{2 +} 신호의 복잡 한 패턴을 보여준다. 이 활동에는 신중 하 고 깊이 있는 분석과 정량화 가능한 기본 이벤트에 대 한 많은 정보를 필요 합니다. 공간, 시간 및 강도 매개 변수 캘리포니아^{2 +} 신호 주파수, 기간, 전파, 속도 진폭 등 본질적인 세포내 신호 전달에 필요한 몇 가지 생물 학적 정보를 제공할 수 있습니다. 고해상도 캘리포니아^{2 +} 시간이 걸릴 정량 데이터 이미징 정보 번역의 관점에서 프로세스 및이 프로세스는 큰 데이터 파일의 인수에 결과 일반적으로 이미징 인간의 오류와 편견에 감염 될 수 있습니다. 캘리포니아^{2 +} 세포 제자리에서 신호 분석 일반적으로 시야 (FOV) 내의 관심 (ROI)의 임의로 선택한 영역에서 간단한 강도 측정에 의존합니다. 이 이렇게 많은 FOV에 포함 된 중요 한 신호 정보를 무시 합니다. 따라서, 캘리포니아^{2 +}염료 또는 optogenetic Ca^{2 +} 얻은 같은 고해상도 녹음에서 정보의 복구를 최대화 하기 위해 이미징, 적절 한 공간 및 시간 분석 Ca^{2 +} 신호는 필요 합니다. 이 문서에 설명 된 프로토콜 어떻게 대용량 데이터의 더 완전 한 분석 및 캘리포니아^{2 +} 신호의 조합을 사용 하 여 셀에서 기록의 정량화를 촉진 하기 위하여 캘리포니아^{2 +} 영상 녹음에서 얻어질 수 있다 설명 spatiotemporal 지도 (STM)-분석 및 입자 기반 분석을 기반으로. 프로토콜은 또한의 캘리포니아^{2 +} 인구 현장에서 적절 하 게 분석 될 수 있다 다른 셀에서 관찰 된 신호 어떻게 다른 패턴을 설명 합니다. 이해를 돕기 위해 메서드를 검사 합니다 Ca^{2 +} 중간 셀의 Cajal (ICC), GECIs를 사용 하 여 작은 창 자에 있는 세포의 특수 인구에 신호.

Introduction

캘리포니아^{2 +} 는 다양 한 근육 수축^1,2, 신진 대사³, 셀 확산^3,4, 등의 세포 프로세스를 제어 하는 유비 쿼터 스 세포내 메신저 ⁵, 신경 터미널^6,7, 신경 전달 물질 방출의 자극과 활성화 전사의 핵에 있는 요인. ⁷ 세포내 캘리포니아^{2 +} 신호 종종 cytosolic 캘리포니아^{2 +}, 과도 고도의 형태를 걸릴 및 이러한 자발적인 수 수 또는 셀 유형⁸따라 주 작동 근 자극에서 발생 한다. 공간, 시간 및 강도 매개 변수 캘리포니아^{2 +} 신호 주파수, 기간, 전파, 속도, 진폭 등 본질적인 세포내 신호^5, 에 필요한 생물 정보를 제공할 수 있습....

Protocol

사용 하는 모든 동물 및 본이 연구에서 실시 하는 프로토콜 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 헬스 가이드의 국가 기관에 따라 했다. 모든 절차는 기관 동물 사용 관리 네바다, Reno의 대학에 위원회에 의해 승인 되었다.

1입니다. KitGCaMP6f 마우스의 세대

1. Ai95 크로스 (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f 마우스)와 c-키트^{+ Cre ERT2} ICC 특정 GCaMP6f 표현 동물 (마우스 키트-Cre-GCaMP6f)을 생성 하 (키트-Cre 쥐).
   참고: GCaMP6f 지역화 보고에 보고 된 효율성 때문에 사용 되었다, 간단한 세포내 캘리포니아^{2 +} 신호 현장에서 그리고 vivo에서⁵⁴.
2. 6-8 주 유도 Cre Recombinase 활성화 및 ICC (그림 1)에 후속 GCaMP6f 식의 나가에 tamoxifen과 키트-Cre-GCaMP6f 쥐를 주사.
   1. Tamoxifen 솔루션을 만들려면 분해 Tamoxifen의 80 mg ( 재료의 표참....

Results

키트-Cre-GCaMP6F 마우스 (그림 1), 동적 캘리포니아^{2 +} 위장에 ICC의 행동 현장에서 몇 군데 수 신호를 사용 하 여. Confocal 현미경 검사 법, ICC의 특정 인구의 고해상도 이미지는 같은 조직 내의 하지만 초점 (그림 2A)³⁷ 의 해부학 다른 비행기에 ICC의 다른 인구에서 신호를 오염 없이 취득 될 수 있다 ^{, 39 , 40 , 41}. 수-간략 한 기록 (< 100 ms), 지역화 Ca^{2 +} 이벤트 막 투과성 캘리포니아^{2 +} 표시기로 불가능 했다........

Discussion

캘리포니아^{2 +} 영상 그대로 조직 또는 세포의 네트워크에서 셀의 특정 종류의 종종 캘리포니아^{2 +} 과도의 복잡 한 패턴을 보여준다. 이 활동에는 신중 하 고 깊이 있는 분석과 정량화 가능한 기본 이벤트와 이러한 이벤트의 활동에 대 한 많은 정보를 필요 합니다. STM과 PTCL 분석 이런이 종류의 녹음에서 나왔고 양적 데이터의 양을 최대화 하는 기회를 제공 합니다.

좁은, ICC DMP의 스핀 들 모양 형태 있도록 위에서 설명한 STMs에서 파생 된 STM 분석에 적합. 그러나,이 분석은 적합에 ICC 내는 방사상 모양 및 (그림 3A)는 네트워크에 연결 합니다. 또한, Ca^{2 +} 신호 패턴 ICC 내에 더 복잡 하 고, CTCs 기원 ICC 내 네트워크를 통해 여러 사이트에서 전파로 명시 합니다. 따라서,는 FOV 내에서 전체 ICC 내 네트워크에서 발생 하는 활동을.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ImageJ 소프트웨어	NIH	1.5a	ImageJ 소프트웨어
Volumetry	GWH	Volumetry 8Gd	맞춤형 분석 소프트웨어
Isoflurane	Baxter, Deerfield, IL,	USA NDC 10019-360-60
Tamoxifen	Sigma	T5648
GCaMP6F 마우스	Jackson Laboratory	Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
	Dr. Dieter Saur	c-Kit+/Cre-ERT2
Ethanol	Pharmco-Aaper	SDA 2B-6