사이트 감독 Mutagenesis에 대 한 생체 외에서 그리고 Vivo 실험 대장균 RNA 상호 Exemplified에서

요약

사이트 지시 된 mutagenesis deoxyribonucleic 산 (DNA) 특정 돌연변이 소개 하는 기술 이다. 이 프로토콜 사이트 감독 mutagenesis 2 스텝을 수행 하는 방법을 설명 하 고 3 단계 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 기반 접근, 관심의 모든 DNA 조각에 적용 됩니다.

초록

사이트 지시 된 mutagenesis은 작은 비 코딩 ribonucleic 산 (요 스르나.) 분자와 대상 메신저 RNAs (mRNAs) 간의 상호 작용을 조사 하기 위하여 DNA에 있는 특정 돌연변이 소개 하는 기술입니다. 또한, 사이트 지시 된 mutagenesis는 RNA를 특정 단백질 바인딩 사이트를 매핑하는 데 사용 됩니다. 돌연변이의 2 단계와 3 단계 PCR 기반 소개 설명 되어 있습니다. 접근은 모든 단백질-RNA와 RNA RNA 상호 작용 연구에 관련이 있다. 즉, 기술 설계 뇌관 원하는 mutation(s)와 돌연변이 PCR 제품을 합성 하는 PCR의 2 또는 3 단계를 통해 사용 합니다. PCR 제품은 복제에 사용 됩니다. 여기, 우리는 요 스르나., McaS, 그리고 mRNA, csgD, RNA RNA와 RNA-단백질 상호 작용을 조사 하는 돌연변이 소개 하는 두 2 및 3 단계 접근 방식으로 mutagenesis 사이트 감독을 수행 하는 방법을 설명 합니다. 우리 조사 RNA 상호 작용;이 기법을 적용 그러나, 기술은 모든 mutagenesis 연구 (예를 들어, DNA 단백질 상호 작용, 아미노 산 대체/삭제/추가)에 적용 됩니다. 비 자연 기지를 제외 하 고 돌연변이의 어떤 종류를 소개 수 있지만 기술은만 경우 적용 PCR 제품 다운스트림 응용 프로그램 (예: 복제 추가 PCR에 대 한 서식 파일)에 사용할 수 있습니다.

서론

DNA는 종종 라고 합니다 살아있는 세포의 청사진 때문에 모든 구조는 세포의 DNA의 순서에 인코딩됩니다. 정확한 복제 및 DNA 수리 메커니즘 코딩된 유전자의 정확한 기능 유지에 필수적입니다, 돌연변이의 매우 낮은 요금 발생 확인 합니다. DNA 순서의 변화 다음 (자료 쌍 complementarity 그리고 이차 구조 변경) RNA 및 단백질 (아미노산 DNA 전사 요소와 제한 효소 (인식)로 시작 하는 서로 다른 수준에서 연속 함수에 영향을 미칠 수 있습니다. 산 성 대체, 삭제, 추가 또는 프레임 교대). 많은 돌연변이 유전자 기능을 크게 미치지 않습니다, 그러나 일부 돌연변이 DNA에서 거 대 한 의미를 가질 수 있습니다. 따라서, 사이트 지시 된 mutagenesis 모든 수준에서 특정 DNA 사이트의 중요성을 공부 하기 위한 유용한 도구입니다.

이 프로토콜에는 특정 돌연변이 소개 하는 데 사용 하는 타겟된 mutagenesis 접근 방식을 설명 합니다. 두 개의 서로 다른 PCR 전략에 의존 하는 프로토콜: 2 단계 또는 3 단계 PCR. 2 단계 PCR는 적용 가능한 경우 원하는 돌연변이의 DNA의 3' 끝 또는 5' 끝은 (< 200 기본적인 쌍 (bp) 끝에서) 3 단계 PCR 모든 경우에 적용 됩니다.

프로토콜

1. 벡터 선택

1. 다운스트림 실험을 수행 하는 벡터를 선택 하십시오. 모든 벡터는이 2 및 3 단계 PCR 방법에 적용 됩니다.
2. 벡터의 선택에 따라 달라 집니다, 복제에 대 한 적절 한 제한 효소를 선택 합니다.

2. 뇌관 디자인 사이트에 대 한 감독 mutagenesis

1. 중 2 단계 또는 3 단계 PCR 전략 사이 결정 (2 단계는 돌연변이 < 200 bp의 DNA의 양쪽 끝에서). 2 단계 PCR를 위한 단계 2.2 이동한 3 단계 PCR를 위한 2.3 단계로 이동 합니다.
2. 2 단계 PCR를 위한 뇌관 디자인.
   1. 뇌관 1과 3의와 5' DNA 증폭을 돌출 하는 디자인 관련 제한 인식 사이트 선택한 벡터에 복제 하는 데 필요한 다음 4 뉴클레오티드 (예: ATAT 또는 AGCT)를 포함 합니다.
   2. 원하는 사이트에 mutation(s)를 소개 하 고 양쪽에 10-15 보완 뉴클레오티드와 돌연변이 측면 2 뇌관 디자인. 뇌관 역 돌연변이 5' 끝에 도입 하는 경우 또는 돌연변이 3' 끝에 도입 하는 경우 전달 합니다.
3. 3 단계 PCR를 위한 뇌관 디자인.
   1. 뇌관 1과 4의와 5' D....

결과

이중 벡터 설정 선택 되었다 csgD 의 post-transcriptional 규정에 관한 RNA 상호 작용을 조사 하기: 하나 csgD 표현 하 mRNA 및 다른 작은 비 코딩 RNA, McaS 표현 하. csgD pBAD33, 페니 저항 arabinose 유도할 수 있는 매체 복사 플라스는으로 복제 했다 및 McaS는 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 유도할 수 있는 낮은 사본 플라스 미드는 미니 R1 pNDM220으로 복제 했다와 암 피 실린 저항입니다. 야생 타입 csgD 는 PCR 뇌관 1A, 4A를 사용 하 여 증폭 (4A 플래그 시퀀스 포함) 동안 야생 타입 McaS PCR PCR 제품 IB를 뇌관 1B와 4B를 사용 하 여 증폭 PCR 제품 IA, 항복. 3 단계 PCR 전략 소개 csgD , McaS. 의 예측된 자료 페.......

토론

사이트 지시 된 mutagenesis는 광범위 한 다른 응용 프로그램, 그리고 여기, 대표는 vivo에서 그리고 생체 외에서 실험 결과 기술을 사용 하 여 생물학적 결론을 확인 하는 방법의 예제로 포함 했다. 사이트 지시 된 mutagenesis는 오랫동안 RNA 상호 작용 연구에 대 한 황금 표준 되었습니다. 기술의 강점 다운스트림 분석 실험 및 실험 (예를들면, 서쪽 오 점 또는 EMSA)에 유전자 제품의 기능에 특정 DNA 사이트 및 그들의 중요성에 대 한 결론과 관련 된 돌연변이 소개의 조합에 질문입니다. 프라이 머의 디자인 기술에서 가장 얻을 수 신중 하 게 계획 되어야 할 사이트 지시 된 mutagenesis 결정할 때 (예: 어떤 사이트를 변형); 반드시 올바른 돌출부 등 금지 사이트 뇌관/템플릿 특성에 주의 하 라.

이 프로토콜에서 설명 하는 실제 mutagenesis PCR에 의존 합니다. 프로토콜의 가장 중요 한 부분이입니다 따라서이 대 한 조건. PCR, Mg.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
토끼에서 생산된 Anti-GroEL 항체	Merck	G6532	1차 항체
Azure c200	Azure	NA	Gel 이미징 워크스테이션
맞춤형 DNA 올리고	Merck	VC00021
DeNovix DS-11	DeNovix	NA	분광 광도계
DNA Gel Loading Dye (6X)	Thermo Scientific	R0611
에티듐 브로마이드 용액 1 %	Carl Roth	2218.1
GeneJET 겔 추출 키트	Thermo Scientific	K0691
GeneRuler DNA Ladder Mix	Fermentas	SM0333
Gerard GeBAflex-tube Midi	Gerard Biotech	TO12	전기 용출용 투석 튜브
MEGAscript T7 전사 키트	Invitrogen	AM1334
Mini-Sub Cell GT Cell	Bio-Rad	1704406	수평 전기영동 시스템
마우스에서 생성된 단클론 ANTI-FLAG M2 항체	Merck	F3165	1차 항체
마우스 면역글로불린	Dako Cytomation	P0447	HRP conjucated secondary antibody
NucleoSpin miRNA	Macherey Nagel	740971	RNA purification
NuPAGE 4-12% Bis-Tris 단백질 겔		단백질 분리를 위한 Thermo Scientific NP0323BOX 단백질 분리를 위한 Bis-Tris 겔
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	New England Biolabs	M0531S	DNA polymerase
PowerPac HC 고전류 전원 공급 장치	Bio-Rad	1645052
Rabbit Immunoglobulins	Dako Cytomation	P0448	HRP conjucated 2 차 항체
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004
SigmaPlot	Systat Software Inc	NA	그래프 및 데이터 분석 소프트웨어 도구
T100 Thermal Cycler	Bio-Rad	1861096	PCR 기계
T4 DNA 리가제	New England Biolabs	M0202	Ligase
T4 폴리 뉴클레오티드 Kinase	New England Biolabs	M0201S
TAE 완충액(Tris-acetate-EDTA) (50X)	Thermo Scientific	B49

핵산 측정을 위한