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방법 논문

사이트 감독 Mutagenesis에 대 한 생체 외에서 그리고 Vivo 실험 대장균 RNA 상호 Exemplified에서

20.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/58996

⸱

2019년 2월 5일

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern Denmark

이 논문에서

요약

사이트 지시 된 mutagenesis deoxyribonucleic 산 (DNA) 특정 돌연변이 소개 하는 기술 이다. 이 프로토콜 사이트 감독 mutagenesis 2 스텝을 수행 하는 방법을 설명 하 고 3 단계 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 기반 접근, 관심의 모든 DNA 조각에 적용 됩니다.

초록

사이트 지시 된 mutagenesis은 작은 비 코딩 ribonucleic 산 (요 스르나.) 분자와 대상 메신저 RNAs (mRNAs) 간의 상호 작용을 조사 하기 위하여 DNA에 있는 특정 돌연변이 소개 하는 기술입니다. 또한, 사이트 지시 된 mutagenesis는 RNA를 특정 단백질 바인딩 사이트를 매핑하는 데 사용 됩니다. 돌연변이의 2 단계와 3 단계 PCR 기반 소개 설명 되어 있습니다. 접근은 모든 단백질-RNA와 RNA RNA 상호 작용 연구에 관련이 있다. 즉, 기술 설계 뇌관 원하는 mutation(s)와 돌연변이 PCR 제품을 합성 하는 PCR의 2 또는 3 단계를 통해 사용 합니다. PCR 제품은 복제에 사용 됩니다. 여기, 우리는 요 스르나., McaS, 그리고 mRNA, csgD, RNA RNA와 RNA-단백질 상호 작용을 조사 하는 돌연변이 소개 하는 두 2 및 3 단계 접근 방식으로 mutagenesis 사이트 감독을 수행 하는 방법을 설명 합니다. 우리 조사 RNA 상호 작용;이 기법을 적용 그러나, 기술은 모든 mutagenesis 연구 (예를 들어, DNA 단백질 상호 작용, 아미노 산 대체/삭제/추가)에 적용 됩니다. 비 자연 기지를 제외 하 고 돌연변이의 어떤 종류를 소개 수 있지만 기술은만 경우 적용 PCR 제품 다운스트림 응용 프로그램 (예: 복제 추가 PCR에 대 한 서식 파일)에 사용할 수 있습니다.

서론

DNA는 종종 라고 합니다 살아있는 세포의 청사진 때문에 모든 구조는 세포의 DNA의 순서에 인코딩됩니다. 정확한 복제 및 DNA 수리 메커니즘 코딩된 유전자의 정확한 기능 유지에 필수적입니다, 돌연변이의 매우 낮은 요금 발생 확인 합니다. DNA 순서의 변화 다음 (자료 쌍 complementarity 그리고 이차 구조 변경) RNA 및 단백질 (아미노산 DNA 전사 요소와 제한 효소 (인식)로 시작 하는 서로 다른 수준에서 연속 함수에 영향을 미칠 수 있습니다. 산 성 대체, 삭제, 추가 또는 프레임 교대). 많은 돌연변이 유전자 기능을 크게 미치지 않습니다, 그러나 일부 돌연변이 DNA에서 거 대 한 의미를 가질 수 있습니다. 따라서, 사이트 지시 된 mutagenesis 모든 수준에서 특정 DNA 사이트의 중요성을 공부 하기 위한 유용한 도구입니다.

이 프로토콜에는 특정 돌연변이 소개 하는 데 사용 하는 타겟된 mutagenesis 접근 방식을 설명 합니다. 두 개의 서로 다른 PCR 전략에 의존 하는 프로토콜: 2 단계 또는 3 단계 PCR. 2 단계 PCR는 적용 가능한 경우 원하는 돌연변이의 DNA의 3' 끝 또는 5' 끝은 (< 200 기본적인 쌍 (bp) 끝에서) 3 단계 PCR 모든 경우에 적용 됩니다.

2 단계 PCR 방법에서 3 프라이 머는, 있는 뇌관의 한 세트의 (뇌관 1, 3, 앞으로 및 역방향, 각각), DNA를 증폭 하도록 설계 되었습니다 및 단일 뇌관은 돌연변이 통합 하도록 설계 되었습니다. 뇌관 (뇌관 2)을 소개 하는 돌연변이 돌연변이 5' 끝과 앞으로 방향 경우 경우 돌연변이 3' 끝은 역 방향이 있어야 합니다. 첫 번째 PCR 단계에서 뇌관 1 + 2 또는 2 + 3 각각 5' 끝 또는 3' 끝, 가까이 작은 파편을 증폭 한다. 유래 PCR 제품은 뇌관 1 또는 3, 관심 (그림 1A)의 DNA에 돌연변이와 PCR 제품에 따라서 결과와 2 단계에서 뇌관으로 사용 됩니다.

3 단계 PCR에 있는 뇌관의 1 세트는 (뇌관 1, 4, 앞으로 및 역방향, 각각)의 DNA를 증폭 하도록 설계 되었습니다. 4 뇌관 설계는 뇌관의 1 세트는 겹치는 complementarity 특정 돌연변이 통합 하도록 설계 되었습니다. (2, 3, 뇌관 역 그리고 앞으로, 각각). 1 및 2 단계에서 뇌관 1 + 2 및 3 + 4 증폭 5'과 3' 끝. 3 단계에서 로부터 유래 PCR 제품 1 단계 고 2는 사용 뇌관 1 + 4와 증폭. 따라서, 결과 PCR 제품은 원하는 돌연변이 (그림 1B)에 대 한 관심의 DNA 이다.

돌연변이 DNA 모든 다운스트림 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다,이 프로토콜에 다시 클로닝 벡터에는 DNA를 결합 하는 방법을 설명 합니다. 클로닝 벡터의 사용 복제의 용이성 등 몇 가지 장점이 및 벡터의 기능에 따라 특정 실험적인 응용 프로그램. 이 기능은 RNA 상호 작용 연구를 위해 자주 사용 됩니다. RNA 상호 작용 연구에 대 한 또 다른 기술은 다른 RNA1,2 또는 단백질3,4단지에서 RNA의 구조 조사입니다. 그러나, 구조 조사만 수행 됩니다 생체 외에서 반면 사이트 지시 된 mutagenesis와 후속 복제 허용 상호 작용 연구에 대 한 vivo에서.

사이트 지시 된 mutagenesis는 광범위 하 게 사용 되었습니다 RNA 상호 작용 연구로 여기에 제시. 그러나, 주요 방법에 관한 2-또는 3-단계 PCR는 DNA의 어떤 조각에 적용 이며 따라서 RNA 상호 작용 연구에 제한 뿐만 아니라.

기술과 그것의 가능한 사용을 예증 하 지역에 mRNA, 대장균 (대장균)의 csgD 의 post-transcriptional 규제에 대 한 중요 한 특성은 사용 됩니다. 대장균, csgD에서 대상 이다 작은 비 코딩 RNA, McaS, 단백질, Hfq, CsgD2,,45의 단백질 발현을 억 누르기 위해 협력. 기술은은 돌연변이 csgD , McaS, 사이 베이스 페어링 지역 그리고 csgD의 Hfq 바인딩 사이트에 소개 하는 데 사용 됩니다. 얻은 DNA는 다음 후속 실험에 적합 한 벡터에 복제 됩니다. 기술은의 다운스트림 응용 프로그램에는 vivo에서 그리고 생체 외에서 실험 포함 됩니다. 이해를 돕기 위해 예제 1은 생체 조건 서쪽 오 점 분석 결과 사용 하 여 특징 하 고 예제 2 생체 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (EMSA)를 사용 하 여 특징입니다. 두 경우 모두, 그것은 그림된 어떻게 사이트 감독 mutagenesis 관심의 유전자에 대 한 생물 학적 결론을 다른 기술 함께에서 사용할 수 있습니다.

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프로토콜

1. 벡터 선택

  1. 다운스트림 실험을 수행 하는 벡터를 선택 하십시오. 모든 벡터는이 2 및 3 단계 PCR 방법에 적용 됩니다.
  2. 벡터의 선택에 따라 달라 집니다, 복제에 대 한 적절 한 제한 효소를 선택 합니다.

2. 뇌관 디자인 사이트에 대 한 감독 mutagenesis

  1. 중 2 단계 또는 3 단계 PCR 전략 사이 결정 (2 단계는 돌연변이 < 200 bp의 DNA의 양쪽 끝에서). 2 단계 PCR를 위한 단계 2.2 이동한 3 단계 PCR를 위한 2.3 단계로 이동 합니다.
  2. 2 단계 PCR를 위한 뇌관 디자인.
    1. 뇌관 1과 3의와 5' DNA 증폭을 돌출 하는 디자인 관련 제한 인식 사이트 선택한 벡터에 복제 하는 데 필요한 다음 4 뉴클레오티드 (예: ATAT 또는 AGCT)를 포함 합니다.
    2. 원하는 사이트에 mutation(s)를 소개 하 고 양쪽에 10-15 보완 뉴클레오티드와 돌연변이 측면 2 뇌관 디자인. 뇌관 역 돌연변이 5' 끝에 도입 하는 경우 또는 돌연변이 3' 끝에 도입 하는 경우 전달 합니다.
  3. 3 단계 PCR를 위한 뇌관 디자인.
    1. 뇌관 1과 4의와 5' DNA를 증폭 하는 돌출 하는 디자인 관련 제한 인식 사이트 선택한 벡터에 복제 하는 데 필요한 다음 4 뉴클레오티드 (예: ATAT 또는 AGCT)를 포함 합니다.
    2. 2와 3을 원하는 사이트에서 mutation(s)를 소개 하 고 양쪽에 10-15 보완 뉴클레오티드에 의해 돌연변이 측면 뇌관 디자인. 뇌관 2와 3는 무료 리버스.

3. PCR 증폭 야생 타입 DNA 복제의

참고:에 대 한 내용은 PCR,6참조.

  1. PCR6 뇌관 1 + 2 (2-단계 PCR) 또는 1 + 4 (3 단계 PCR)를 사용 하 여 수행 하 고 표 1에 PCR 프로그램 PCR 제품 I. 사용을 템플릿으로 야생 타입 DNA를 사용 하 여.
  2. Agarose 젤 전기 이동 법으로 PCR을 확인 합니다.
    1. 1 x 트리 아세테이트 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) (태) 버퍼의 100 mL 당 agarose의 2 세대를 추가 하 여는 agarose 젤 솔루션 (2%)을 확인 합니다. 렌지에 끓는 agarose를 녹. DNA 얼룩 염료 ethidium 평범한 사람 추가 (의 최종 농도에 ~ 0.5 µ g/mL)에 agarose 젤 시각화를 위한 솔루션.
    2. Agarose 젤을 캐스팅 하 고 전기 단위에 PCR (DNA 로드 염료와 혼합) 및 알려진된 크기의 DNA 사다리 로드. 때까지 밴드, 적절 하 게 구분 되 고 밴드는 자외선 (UV) 테이블에서 또는 젤 이미징 시스템을 시각화 75 W 45 분, 또는에서 샘플을 실행 합니다.
  3. 젤 추출 키트 (자료 테이블) PCR 제품을 정화 하 고 순화 된 DNA의 농도 측정 하는 분 광 광도 계 (자료 테이블)와.
  4. 5 단계에서 사용된까지 순화 된 DNA-20 ° c (에서 트리 스-EDTA (테) 버퍼-장기 저장) 또는 4 ° C (dH2O-단기 저장)를 저장 합니다.

4. PCR는 DNA에 돌연변이 사이트 감독을 소개 하

  1. 2 단계 PCR 위한 PCR (3 단계 PCR는 단계 4.2 참조)
    1. PCR6 돌연변이 5' 끝에 또는 2 + 3 변이 있는 3' 끝 및 PCR 제품 II를 템플릿으로 야생 타입 DNA를 사용 하 여 뇌관 1 + 2를 사용 하 여 수행 (PCR 프로그램 표 1 참조).
    2. 3.2.1, 3.2.2 단계에서 agarose 젤 전기 이동 법으로 PCR을 확인 합니다.
    3. 젤 추출 키트 (자료 테이블) PCR 제품을 정화 하 고 순화 된 DNA의 농도 측정 하는 분 광 광도 계 (자료 테이블)와.
    4. 스토어 정화 DNA (dH2O)에서 4 ° C 또는-20 ° C (테 버퍼)에서 5 단계에서 사용된까지.
    5. PCR6 돌연변이 뇌관 1 변이 3' 끝에 있으며 야생 타입 DNA PCR 제품 III를 템플릿으로 사용 하는 경우 또는 5' 끝에 경우 2 뇌관 3 함께 뇌관으로 PCR 제품을 사용 하 여 수행 (PCR 프로그램에 대 한 표 1 참조).
    6. 3.2.1, 3.2.2 단계에서 agarose 젤 전기 이동 법으로 PCR을 확인 합니다.
    7. 젤 추출 키트 (자료 테이블) PCR 제품을 정화 하 고 순화 된 DNA의 농도 측정 하는 분 광 광도 계 (자료 테이블)와.
    8. 스토어 정화 DNA (dH2O)에서 4 ° C 또는-20 ° C (테 버퍼)에서 5 단계까지.
  2. 3 단계 PCR 위한 PCR
    1. PCR6 별도 반응에서 1 + 2 및 3 + 4 뇌관을 사용 하 여 수행 하 고 PCR 제품을 템플릿으로 야생 타입 DNA를 사용 하 여 II 및 III (PCR 프로그램 표 1 참조).
    2. 3.2.1, 3.2.2 단계 에서처럼 agarose 젤 전기 이동 법에 의해 PCRs를 확인 합니다.
    3. 젤 추출 키트 (자료 테이블) PCR 제품을 정화 하 고 순화 된 DNA의 농도 측정 하는 분 광 광도 계 (자료 테이블)와.
    4. 저장소 (dH2O)에서 4 ° C 또는-20 ° C (테 버퍼)에서 DNA를 정화.
    5. PCR6 뇌관 1 + 4를 사용 하 여 수행 하 고 PCR 제품 4 세를 (같은 반응)에서 템플릿으로 두 PCR 제품 II 및 III의 2-5 ng를 사용 하 여 (PCR 프로그램 표 1 참조).
    6. 3.2.1, 3.2.2 단계에서 agarose 젤 전기 이동 법으로 PCR을 확인 합니다.
      참고: 그것은 (때때로 줄일 수 있습니다 더 적은 서식 파일을 사용 하 여) 여러 잘못 된 밴드를 예외적입니다. 그러나, 잘못 된 PCR 제품 올바른 크기의 밴드 excised 젤 추출 경우 무시할 수 있습니다.
    7. 경우 올바른, 젤 추출 키트 (자료 테이블) PCR 제품을 정화 하 고 순화 된 DNA의 농도 측정 하는 분 광 광도 계 (자료 테이블)와.
    8. 스토어 정화 DNA (dH2O)에서 4 ° C 또는-20 ° C (테 버퍼)에서 5 단계까지.

5. 야생 유형 및 선택한 벡터에 DNA의 돌연변이 체 버전의 재결합

참고: 다음 단계에서 자세한7참조.

  1. 다이제스트는 I 및 III (2 단계 PCR)에서 PCR 제품을 정화 및 관련 제한 효소를 사용 하 여 (에서 3 단계 PCR) 4.
    1. 각 제한 효소, 30-60 분 동안 37 ° C에서 PCR 제품의 다이제스트 200 ng의 1 µ L로 소화 버퍼 x 1의 20 µ L에서.
  2. 젤 추출 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 젤 추출 하 여 소화 PCR 제품을 정화, 순화 된 DNA의 DNA 농도 측정 (자료 테이블), 분 광 광도 계 또는 및 저장 (TE 버퍼)에-20 ° C에서 4 ° C (dH2 O) 단계 5.6 사용 될 때까지.
  3. 소화 관련 제한 효소 정화 벡터와 벡터 다시 결 찰 이벤트 감소 알칼리 성 인산 가수분해 효소와 함께. 알칼리 성 인산 가수분해 효소를 가진 PCR 제품을 취급 하지 않습니다.
    1. 소화 버퍼 1 µ L의 각 제한 효소와 알칼리 성 인산 가수분해 효소, 30-60 분 동안 37 ° C에서 벡터의 다이제스트 1000 ng의 1 µ L x 1의 30 µ L에서.
  4. (예: 포경된 벡터 및 컷 아웃 DNA) 폐기물 DNA에서 별도 소화 벡터 단계 3.2.1, 3.2.2에서 agarose 젤 전기 이동 법을 사용 하 여.
  5. 젤 추출 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 젤 추출 하 여 소화 벡터를 정화, 순화 된 DNA의 DNA 농도 측정 (자료 테이블), 분 광 광도 계 또는 및 저장 (TE 버퍼)에-20 ° C에서 4 ° C (dH2O) 때까지 단계 5.6 사용.
  6. 표 2에 지정 된 반응 소화 벡터에 소화 PCR 제품을 선.
  7. 2 시간에 16 ° c.에 하룻밤 실 온에서 품 어
  8. 결 찰 반응 받는 사람 부담 (예를 들면, 대장균 K12)를 변환 합니다.
    1. OD600스트레인 성장 = 0.3-0.5 및 전송 1 mL 리가 반응으로 많은 1.5 mL 튜브에 문화.
    2. 5 분 동안 3500 x g 에서 회전 시키십시오 그리고 상쾌한 삭제.
    3. 변환 버퍼 (10 mL의 0.1 g/mL 폴 리 에틸렌 글리콜 3350, 5% 디 메 틸 황산 염 및 20 m m MgCl2lysogeny 국물 (파운드))의 200 μ 셀 resuspend
    4. 결 찰 반응, 추가 하 고 30 분 동안 얼음에 튜브를 놓습니다.
    5. 2 분 42 ° c.에 대 한 열 충격
    6. 1.5 mL 튜브에 파운드의 1 mL을 추가 하 고 37 ° c.에 적어도 45 분 동안 항생제 내성의 phenotypic 식 수
    7. 3500 x g 5 분에 세포를 스핀, 상쾌한의 1 mL를 폐기 하 고 나머지 상쾌한 셀 resuspend.
    8. 적절 한 항생제와 함께 접시에 셀 접시 하 고 37 ° c.에서 밤새 품 어
  9. Transformants 벡터 DNA의 삽입 (예: 벡터 및 삽입 특정 뇌관을 사용 하 여 PCR)의 성공적인 통합을 은닉을 식별 합니다.
  10. 생어에 의해 DNA의 순서를 확인 연속.
    주의: 시퀀싱 단계 5.9에 사용 된 동일한 뇌관을 사용 하지 마십시오.

6. 사용 하 여 생성 된 벡터 생체 외에서 또는 vivo에서 실험에 대 한

  1. 생체 조건 실험
    참고:이 야생 타입/돌연변이 RNA post-transcriptional 레 귤 레이 션 특성을 표현 하는 벡터를 사용 하는 예제입니다. 에 대 한 자세한 내용은 서 부 럽,8을 참조 하십시오.
    1. 적절 한 매체에서 생성 된 벡터와 대장균 K12 긴장을 성장 하 고 필요한 경우 식을 유도. 원심 분리에 의해 샘플을 수확.
    2. SDS 샘플 버퍼 x 1 펠 릿 세포를 용 해 하 여 나트륨 라우릴 황산 염-polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)에 대 한 샘플을 준비 (62.5 mM Tris HCl pH 6.8, 2.5 %SDS, 0.002 %bromophenol 블루, β-mercaptoethanol 5%, 10% 글리세롤) 5 대 95 ° C에서 비등 하 고 분입니다.
      참고: 젤을 캐스팅 하거나 상업적으로 이용 가능한 캐스트 젤을 사용 하 여 가능 하다. 후자는 그림 3 (자료 테이블)에서 제시 하는 결과에 사용 되었다.
    3. 로드 107 셀 (단백질 사다리를 포함 하는) 별도 우물에 각 샘플의 고 단백질 (약 45 분) 분리 될 때까지 200 V에서 젤을 실행 합니다.
    4. 오 점 80에서 세미 드라이 송금으로 셀 루 로스 멤브레인에 단백질 1 h mA.
    5. 단백질 (예: 5%-분유 1 x Tween 20 Tris 버퍼 식 염 수 (TTBS) 버퍼에 녹아 있는)의 혼합물으로 막을 차단 합니다.
    6. 1 차적인 항 체 (1 x TTBS 버퍼에 녹아 있는) 대상 (예를 들어, GFP, 플래그 또는 HIS 태그 단백질) 관심사의 단백질을 부드러운 동요와 1 시간에 대 한 품 어를 추가 합니다.
    7. 언바운드 항 체를 제거 하는 10 분 1 x TTBS에 멤브레인을 씻어. 두 번 더 반복 합니다.
    8. 이차 항 체 (1 x TTBS 버퍼에 용 해)을 대상으로 1 차 항 체를 추가 하 고 검색을 허용 (예: 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)-2 차 항 체를 활용. 부드러운 동요와 1 시간에 품 어.
    9. 언바운드 항 체를 제거 하는 10 분 1 x TTBS에 막 씻으십시오. 두 번 더 반복 합니다.
    10. (예를 들어, HRP 활용 된 이차 항 체를 사용 하는 경우에 luminol 파생 된 화학으로 부 화 후 이미징)에 의해 2 차 항 체와 호환 기술로 막 시각화.
  2. 생체 외에서 실험
    참고:이 템플릿으로 사용 하 여 벡터는 RNA의 생체 외 녹음 방송을 위한 RNA-단백질 상호 작용의 특성의 예입니다. 에 대 한 자세한 내용은 EMSA,9을 참조 하십시오.
    1. 템플릿으로 생체 외 녹음 키트 (자료 테이블)에 5 단계에서 벡터 t 7을 사용 하 여 생체 외에서 성적을 확인 합니다.
    2. 4.5 %7 M 요소 젤, 변성 시키기에 페이지에 의해 RNA 사본 하 고 투 석 튜브 (자료 테이블)와 함께 전기 차입에 의해 RNA 젤에서 직접 추출 합니다.
    3. RNA를 레이블 (예: γ-32P-ATP radiolabeling T4 polynucleotide 키 (테이블의 재료)를 사용 하 여 고 열 (자료 테이블) 다시 정화.
      주의: 방사성 물질을 사용 하기 전에 로컬 방사선 안전 관리와 상담.
    4. 셔 서 RNA 바인딩 버퍼 (20 mM Tris, pH 8, 100 m KCl, 1 mM MgCl2, 1 m m dithiothreitol (DTT) m) x 1에 있는 별도 반응에 단백질의 농도 증가 함께 믹스.
      참고: 발표 결과 (그림 4), 2에서 mRNA 0 ~ 2 µ M Hfq 단백질 (단위체 농도)의 그라데이션으로 혼합 했다 방사선된 csgD의 nM.
    5. 단백질 및 RNA 비 변성 시키기 polyacrylamide 젤에 교 잡 믹스를 로드 하기 전에 교배 하 여 200 V 1.5 h를 위한 젤을 실행 하실 수 있습니다.
    6. 시각화 기술 단계 6.1.3에서에서 라벨 호환 젤. (예를 들어, 의해 phosphoimaging radiolabeling 적용 된 경우).
    7. 프로그램을 처리 하는 영상과 이동된 밴드의 상대 강도 계량 하 고 곡선 (자형) 그래프를 사용 하 여 데이터 및 데이터 분석 소프트웨어 (자료 테이블). 맞춤된 곡선에 따라 분리 상수 (Kd) 값 확인할 수 있습니다 자동으로 소프트웨어와 함께.

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결과

이중 벡터 설정 선택 되었다 csgD 의 post-transcriptional 규정에 관한 RNA 상호 작용을 조사 하기: 하나 csgD 표현 하 mRNA 및 다른 작은 비 코딩 RNA, McaS 표현 하. csgD pBAD33, 페니 저항 arabinose 유도할 수 있는 매체 복사 플라스는으로 복제 했다 및 McaS는 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 유도할 수 있는 낮은 사본 플라스 미드는 미니 R1 pNDM220으로 복제 했다와 암 피 실린 저항입니다. 야생 타입 csgD 는 PCR 뇌관 1A, 4A를 사용 하 여 증폭 (4A 플래그 시퀀스 포함) 동안 야생 타입 McaS PCR PCR 제품 IB를 뇌관 1B와 4B를 사용 하 여 증폭 PCR 제품 IA, 항복. 3 단계 PCR 전략 소개 csgD , McaS. 의 예측된 자료 페...

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토론

사이트 지시 된 mutagenesis는 광범위 한 다른 응용 프로그램, 그리고 여기, 대표는 vivo에서 그리고 생체 외에서 실험 결과 기술을 사용 하 여 생물학적 결론을 확인 하는 방법의 예제로 포함 했다. 사이트 지시 된 mutagenesis는 오랫동안 RNA 상호 작용 연구에 대 한 황금 표준 되었습니다. 기술의 강점 다운스트림 분석 실험 및 실험 (예를들면, 서쪽 오 점 또는 EMSA)에 유전자 제품의 기능에 특정 DNA 사이트 및 그들의 중요성에 대 한 결론과 관련 된 돌연변이 소개의 조합에 질문입니다. 프라이 머의 디자인 기술에서 가장 얻을 수 신중 하 게 계획 되어야 할 사이트 지시 된 mutagenesis 결정할 때 (예: 어떤 사이트를 변형); 반드시 올바른 돌출부 등 금지 사이트 뇌관/템플릿 특성에 주의 하 라.

이 프로토콜에서 설명 하는 실제 mutagenesis PCR에 의존 합니다. 프로토콜의 가장 중요 한 부분이입니다 따라서이 대 한 조건. PCR, Mg...

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공개 사항

저자 아무 경쟁 관심사를 선언합니다.

감사의 글

저자는 남쪽 덴마크의 대학 오픈 액세스 정책 보조금을 감사 하 고 싶습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
토끼에서 생산된 Anti-GroEL 항체MerckG65321차 항체
Azure c200AzureNAGel 이미징 워크스테이션
맞춤형 DNA 올리고MerckVC00021
DeNovix DS-11DeNovixNA분광 광도계
DNA Gel Loading Dye (6X)Thermo ScientificR0611
에티듐 브로마이드 용액 1 %Carl Roth2218.1
GeneJET 겔 추출 키트Thermo ScientificK0691
GeneRuler DNA Ladder MixFermentasSM0333
Gerard GeBAflex-tube MidiGerard BiotechTO12전기 용출용 투석 튜브
MEGAscript T7 전사 키트InvitrogenAM1334
Mini-Sub Cell GT CellBio-Rad1704406수평 전기영동 시스템
마우스에서 생성된 단클론 ANTI-FLAG M2 항체MerckF31651차 항체
마우스 면역글로불린Dako CytomationP0447HRP conjucated secondary antibody
NucleoSpin miRNAMacherey Nagel740971RNA purification
NuPAGE 4-12% Bis-Tris 단백질 겔단백질 분리를 위한 Thermo Scientific NP0323BOX 단백질 분리를 위한 Bis-Tris 겔
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF BufferNew England BiolabsM0531SDNA polymerase
PowerPac HC 고전류 전원 공급 장치Bio-Rad1645052
Rabbit ImmunoglobulinsDako CytomationP0448HRP conjucated 2 차 항체
SeaKem LE AgaroseLonza50004
SigmaPlotSystat Software IncNA그래프 및 데이터 분석 소프트웨어 도구
T100 Thermal CyclerBio-Rad1861096PCR 기계
T4 DNA 리가제New England BiolabsM0202Ligase
T4 폴리 뉴클레오티드 KinaseNew England BiolabsM0201S
TAE 완충액(Tris-acetate-EDTA) (50X)Thermo ScientificB49
핵산 측정을 위한

참고문헌

  1. Bouvier, M., et al. Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation. Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).
  2. Jorgensen, M. G., et al. Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
  3. Antal, M., et al. A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter. The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).
  4. Andreassen, P. R., et al. sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA. Nucleic Acids Research. , (2018).
  5. Thomason, M. K., et al. A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
  6. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).
  7. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
  8. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).
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