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방법 논문

물 유지와 울트라입니다 미세 칩을 사용 하 여 라이브 꼬마 선 충 의 동원 정지

7.5K 조회수

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DOI:

10.3791/59008

⸱

2019년 3월 19일

 ,  , 

이 논문에서

요약

일련의 동원 정지 메서드를 라이브 꼬마 선 충 의 대상된 조사 수 있도록 설립 되었습니다 최근 개발한 초박형입니다 미세를 사용 하 여 개인 물 유지와 칩. 이 새로운 칩에 동원 정지 관측 이미징에 대 한 적절 한 이기도 합니다. 자세한 치료 및 칩의 응용 프로그램 예제는 설명 했다.

초록

방사선은 생물 학적 응용 프로그램 및 이온 빔 번 식, 널리 사용 되 고 이러한 방법 중 microbeam 방사선 생명체에 radiosensitive 사이트를 식별 하는 강력한 수단을 나타냅니다. 이 문서는 일련을의 온 칩 immobilization 메서드 꼬마 선 충의 라이브 개인 대상된 microbeam 방사선에 대 한 개발에 대해 설명 합니다. 특히, 우리가 이전 마 취는 자세히 설명 되어에 대 한 필요 없이 선 충 C. 개인을 무력화 하기 위해 개발입니다 (PDMS) 미세 칩의 치료. 웜 시트 라고 하는이 칩은 탄력 미세 채널 확장 될 수 있도록 하며 탄성 동물 부드럽게 덮여 또한,는 PDMS의 자기 흡착 용량 때문 동물 수 봉인 채널에 없는 동물 하지 올려집니다 채널에 위한 인클로저 얇은 커버 필름으로 벌레 시트의 표면을 커버 하는 여. 회전 표지에 영화, 하 여 우리 쉽게 동물을 수집할 수 있습니다. 또한, 웜 시트 물 보존을 보여줍니다 및 선 충 C. 개인이 라이브 조건에서 오랜 기간 동안 현미경 관찰 대상이 될 수 있습니다. 또한, 시트가입니다만 300 µ m 두께, 탄소 이온 이온 입자 감지 되므로 동물을 포함 하는 시트를 통과 같은 무거운 이온과 적용된 방사선 복용량을 정확 하 게 측정할 수 있도록. 다양 한 동물을 둘러싸는 사용 커버 영화 성공적인 장기 동원 정지에 대 한 매우 중요 하기 때문에, 우리 적당 한 커버 영화의 선택을 실시 하 고 일부 영화 중 하나를 권장된 했다. 응용 프로그램의 예로 칩, 웜 시트 microbeam 방사선의 미세 채널을 포함 하는 동물의 근육 활동의 영상 관측을 소개 했습니다. 이 예제에서는 웜 시트 생물학 실험에 대 한 가능성을 크게 확대 했습니다 나타냅니다.

서론

방사선, 엑스레이, 감마선, 무거운 이온 빔 등 암 진단 및 치료에서 같은 생물 학적 응용 및 이온 빔 사육에 널리 사용 됩니다. 수많은 연구와 기술 개발은 현재 방사선1,2,3의 효과에 집중 됩니다. Microbeam 방사선은 생활에 radiosensitive 사이트를 식별 하는 강력한 수단 유기 체4. 다카사키 고급 방사선 연구소의 국립 연구소 양자 방사선 과학 및 기술 (QST-다카사키)에 대 한 무거운 이온을 사용 하 여 현미경 관찰에서 개별 셀을 비추는 기술 개발 microbeams5, 선 충 류 꼬마 선 충4,6, 누7, Oryzias 등 여러 모델 동물의 방사선 조사 대상된 microbeam를 사용 하는 방법을 설립 했다 latipes (일본 메 다카)8. 선 충 C. 선 충 의 타겟된 micr....

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프로토콜

1. 긴장 및 유지 보수

  1. 실험의 목적에 따라 C. 선 충 및 대장균 (음식)의 적당 한 긴장을 선택 합니다.
    참고: 현재 신문에서 야생-타입 N210C. 선 충 (그림 2A)는 일반적으로 사용, 및 HBR4:goeIs3 [pmyo-3::GCamP3.35::unc-54-3' utr, unc-119(+)] V11 만 이미징 분석 결과 대 한 고용. 대장균 OP50 C. 선 충에 대 한 음식으로 사용 되었다. 일부 돌연변이 코일 모양 (그림 2B), unc-119(e2498) III 돌연변이 같은 비정상적인 신체 모양, 또한 수 묶어야 직선 미세 채널 (그림 2C).
  2. C. 선 충 선 충 성장 매체 (NGM) 하룻밤 incubated (37 ° c) 대장균

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결과

활성 C. 선 충 개인은 초박형, wettable PDMS, 미세 칩 (웜 시트)를 사용 하 여 성공적으로 움직일 수 있습니다. 우리는 프로토콜 섹션 3에에서 설명 된 대로 웜 시트를 씰링을 위한 다른 커버 영화의 적합성을 조사. 커버 영화의 씰링 효과 평가 하려면 우리는 커버 유리를 사용 하 여 칩에 동원 정지 후 동물 3 h의 운동 성 결정 (두께: 130-170 µ m), 애완 동물 필름 (두께: 125 µ m), 및 PS 필름 (두께: ~ 130 µ m), 각각. 그림 5에서 보듯이 3 h 및 동물 PS 영화 웜 시트에 자유롭게 움직일 수 제어 동물 사이 운동 (바디 벤드)에 상당한 차이가 있었습니다. 반면, 운동 성 동물 동봉 하는 커버 유리 아래에 크게 감소 되었다. 일부 동물 등장, 건조는 커버 유리는 물방울 격퇴 하는 것을 건의 가까운 인감을 방지 하 고 동물 들을 수 있도록 부분적으로 .......

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토론

Wettable PDMS 미세 칩을 사용 하 여 라이브 조건 C. 선 충 의 온 칩 immobilization 여러 동물의 효율적인 타겟된 microbeam 조사를 수 있습니다. 처리 및 건조 방지 기능을 추가의 용이성 microbeam 방사선, 뿐만 아니라 여러 행동 분석에서이 시스템을 응용 프로그램에 적합 하 게. 이러한 웜 시트 이미 상용화 하 고 쉽게 얻어질 수 있다. 후 각 칩 등 기존의 미세 칩에 연결 된 동물, 동물, 수집 하 고 어려운 닫힌된 미세 채널에서 계란의 막힘을 포함 하 여 문제 및 따라서 이러한 칩 따라서 일회용, 수 하는 경향이 있다 비용을 증가. 반면, 현재 웜 시트에 미세 채널은 열려, 동물 수집을 쉽게. 이러한 웜 시트 사용할 수 있습니다 따라서 반복적으로, 그들을 더 경제에 게 하.

PDMS 미세 칩에서 최근 기술 혁신 구조적 복잡성과 많은16,,<.......

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

저자 박사 아츠 시 Higashitani 귀중 한 토론에 대 한 C. 선 충 과 박사 유야 핫토리, 유이치로 요코타, 야스히코 고바야시의 치료에 관한 친절 상담 감사. 저자는 꼬마 유전 센터 C. 선 충 및 대장균의 긴장을 제공 하기 위한 감사 합니다. 우리는 방사선 실험 그들의 종류에 대해 QST 다카사키에서 티아라의 싸이 클 로트 론의 승무원을 감사합니다. 우리는이 원고 초안을 편집 하기 위해 박사 수잔 퍼니스를 감사 합니다. 이 연구는 일부 KAKENHI (보조금 번호 JP15K11921 및 JP18K18839)에 의해에서 지원 JSP 석사

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
C. elegans wild-type strainCaenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USAN2이 연구에서 일반적으로 사용되는 야생형 C. elegans 균주
C. elegans unc-119(e2498) III mutant strainCaenorhabditis Genetics Center (CGC), Minnesota, USACB4845C. elegans 균주는 비정상적인 체형을 가진 돌연변이의 예로만 사용됩니다 
C. elegans 형질전환 균주 HBR4Caenorhabditis Genetics Center (CGC), Minnesota, USAHBR4이 형질전환 C. elegans 균주의 유전자형은 HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54– 3' utr, unc-119(+)]V. 이 균주는 이미징 관찰에만 사용되었습니다.
E. coli strainCaenorhabditis Genetics Center (CGC), Minnesota, USAOP50E. coli strain used as food for C. elegans
Worm Sheet IR (50/60)Biocosm, Inc., Hyogo, JapanBCM17-000125 스트레이트 50/60-µ의 미세유체 칩; 이 논문의 모든 실험 및 관찰에 사용된 m 너비 채널 
웜 시트 60Biocosm, Inc., 효고, 일본BCM18-000120 스트레이트 60 &마이크로와 미세 유체 칩; M 너비 채널. 이것은 20°C에서 부화한 후 3-5일 후에 성인에게 적합합니다.
웜 시트 50Biocosm, Inc., 효고, 일본BCM18-000220 스트레이트 50 &마이크로와 미세 유체 칩; M 너비 채널. 이것은 20°C에서 부화한 후 ~3일 후에 성인에게 적합합니다. 
마이크로 커버 유리MATSUNAMI GLASS IND. LTD.C030401커버 유리 (두께 : 130-170 &마이크로; m) Protocol 3
Polystyrene FilmBiocosm, Inc., Hyogo, JapanBCM18-0001/ BCM18-0002웜 시트 번들 품목의 운동 분석에 사용됩니다. PS 필림 (두께: ~130 & 마이크로; m)을 사용하여 프로토콜 3의 운동 분석에 사용할 수 있습니다.
폴리 에스테르 필름Lumirror TORAY INDUSTRIES, INC., Tokyo, JapanLumirror T60 (t 125 µ m)PET filim (두께 : 125 µ m) 프로토콜 3
IWAKI 60mm/비처리 접시AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan)1010-060의 C. elegans의 주입에 사용되는 비처리 접시
).1010-035프로토콜 3
Milli-QMerck, FranceUltrapure water
Kimwipe S-200Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Japan62020120 mm x 215 mm; 200 sheets/ box
WormStuff Worm PickGenesee Scientific Corporation, CA, USA)59-AWPPlatina picker C. elegans
Research Stereo Microscope SystemOLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japan논문의 모든 실험 및 관찰에 사용된 SZX16 Micriscope
SZX16OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, JapanSZX2-ILLB프로토콜 3-8의 명시야 관찰에 사용되었습니다.
오브젝티브 렌즈 (× 1)OLYMPUS CORPORATION, 일본 도쿄SDFPLAPO1× PFNA : 0.15; 폭경: 60mm. 이 렌드는 프로토콜 3-8에서 명시야 관측에 사용되었습니다.
오브젝티브 렌즈 (× 2)OLYMPUS CORPORATION, 일본 도쿄SDFPLAPO2XPFCNA : 0.3; W.D.: 20 밀리미터. 이  Lends는 이미징 관찰에 사용되었습니다.
Mercury Light SourceOLYMPUS CORPORATION, Tokyo, JapanU-LH100HG넓은 방출 스펙트럼을 통해 모든 일반적인 형광단을 사용하여 다양한 형광 이미징 실험을 수행할 수 있습니다.
SZX16 형광 필터 장치(YFP용 고성능)OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, JapanSZX2-FYFPHQEx: 490-500 nm; 엠: 510-560. 이것은 HBR4 균주의 이미징 관찰에 사용되었습니다.
디지털 카메라 고속 EXILIMCASIO COMPUTER Co., Ltd, Tokyo, JapanEX-F1 그림 1B, 1E, 1F, 그림 2A-C 및 비디오 1은 이 디지털 카메라를 사용하여 얻었습니다.
Office 2013Microsoft Co. Ltd, Redmond, WA, USAEXCEL 통계 분석에 사용되는 소프트웨어
의 운동 분석에 사용됨). 프로토콜 1 IWAKI 35mm/비처리 접시 AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan 이

참고문헌

  1. Funayama, T., Hamada, N., Sakashita, T., Kobayashi, Y. Heavy-Ion microbeams-development and applications in biological studies. IEEE Transactions on Plasma Science. 36 (4), 1432-1440 (2008).
  2. Tanaka, A., Shikazono, N., Hase, Y.

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