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방법 논문

세포 기반 분석 결과 의해 인간의 혈 청 안티-aquaporin-4 면역 글로불린 G 검출

23.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/59014

⸱

2019년 4월 5일

 ,  , 
1Department of Neurology and Neuroscience Center, The First Hospital of Jilin University

이 논문에서

요약

세포 기반 분석 결과 세럼 안티-aquaporin-4 면역 글로불린 g.를 검출 하기 위하여 널리 사용 방법은 이 메서드는 임상 진단 및 neuromyelitis 광학 스펙트럼 장애의 과학적 연구에 적용할 수 있습니다.

초록

안티-aquaporin-4 (AQP4) 면역 글로불린 G (IgG) neuromyelitis optica 스펙트럼 장애 (NMOSD)에 대 한 핵심 진단 바이오 마커 이다. 세포 기반 분석 결과 (CBA) 높은 감도와 특이성 인간 혈 청에 안티 AQP4 IgG를 감지 하는 널리 사용 되는 방법 이다. 간단히, 세럼 안티 AQP4 IgG AQP4 페 셀은 바이오 칩에 고정 후 fluorescein 붙인 이차 항 체에 의해 감지에 의해 캡처됩니다. 형광 현미경 검사 법은 형광, 시각화를 활용 하 고 형광의 강도 두 개 이상의 경험이 풍부한 임상에서 평가. NMOSD의 최종 진단 안티 AQP4 IgG 검출 결과, 임상 발현 및 neuroradiological 발견의 조합에 따라 만들 수 있습니다. 이전 연구에 따르면 CBA는 더 과민 하 고 특정 다른 안티 AQP4 IgG 탐지 방법 보다 그리고 임상 진단 및 NMOSD의 연구에 적용할 수 있습니다. 메서드는 제한; 예를 들어 세럼 안티 AQP4 IgG titers를 평가 하는 국제 규모는 여전히 부족 합니다. 여기, 인간 혈 청 안티 AQP4 IgG 감지 CBA를 사용 하 여 상세한 프로토콜을 설명 합니다.

서론

혈 청 AQP4 IgG neuromyelitis optica 스펙트럼 장애 (NMOSD)1코어 진단 바이오 마커 이다. 세포 기반 분석 결과 (CBA)은 높은 감도와 특이성 널리 안티-AQP4 IgG 감지 방법입니다. 여기, CBA에 대 한 상세한 프로토콜 소개 된다.

AQP4, 물 채널 단백질 막에 걸친 6 단위 있으며 수성 하나를 둘러싼 두 개의 헬리컬 도메인2기 공. 안티 AQP4 IgG를 대상 주로 이다3의 endfeet에 있는 AQP4 바인딩을 통해 NMOSD의 병 인에서 포함 된다. 그것은 안티-AQP4 IgG는 긍정적인 NMOSD 환자4의 약 2/3에 표시 되었습니다. NMOSD에 대 한 가장 최근의 국제 진단 기준, 안티-AQP4 IgG 코어 진단 바이오 마커5간주 됩니다. 이와 관련, 그것은 인간의 혈 청을 감지 하는 신뢰할 수 있는 프로토콜을 설정 하는 중요 한 안티-AQP4 IgG NMOSD의 임상 진단을 용이 하 게 하 고.

현재, 다양 한 안티-AQP4 IgG 탐지 방법 CBA, 조직 기반 분석 결과, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과, 흐름 cytometry6,7등 사용할 수 있습니다. CBA 안티 AQP4 IgG를 잡으려고 인간의 AQP4와 페 EU90 셀을 사용 합니다. 캡처된 안티-AQP4 IgG 형광 이차 항 체에 의해 감지 하 고 이후에 현미경 검사 법에 의해 시각. 증거를 축적 하는 것은 CBA는 더 과민 하 고 다른 안티 AQP4 IgG 감지 방법6,7보다 구체적인 것을 보이고 있다. 메타 분석에 따르면 민감도 특이성 CBA의 76%와 99%, 조직 기반 보다 높은 표시 했다 하 고 효소 연결 된 immunosorbent 분석 실험6. 또한, 안티 AQP4 IgG의 진단 분석 실험의 되 비교가 했다 실시7. 15 유럽 진단 센터에서 과목은 193 연구 총 등록7. 4 가지 방법은 세럼 안티 AQP4 IgG7검색을 활용 했다. 그것은 CBA는 더 과민 하 고 특정 다른 방법7보다 시연 했다. AQP4 (AQP4-m 1과 AQP4-M23) 두 주요 isoforms로 표현 이다, 안티-AQP4 IgG 캡처 셀 AQP4 M1 또는 AQP4-M23 페입니다. 그러나, 어떤 유형의 캡처 셀 더 남아 논란입니다. 한 조사는 AQP4-M1 기반의 지원 CBA8, 다른 AQP4-M23 CBA를 기반으로 표명 하는 동안은 더 나은7,,910. 그러나, AQP4-M23 기반 CBA 난다 IgG 바인딩8거짓 긍정적인 결과 얻을 수 있습니다. Jarius 외입니다. 11 AQP4-m 1와 AQP4-M23 기반 CBAs 안티 AQP4 IgG 검출 률에 큰 차이 보도 했다.

요약, 세럼 안티-AQP4에 IgG는 NMOSD에 대 한 핵심 바이오 마커. CBA는 높은 특이성 및 다른 안티 AQP4 IgG 탐지 방법 보다 감도 있습니다. AQP4-M1-또는 AQP4-M23-CBA는 더 나은 여부 논란이 남아 있다. 이 문서에서는, CBA AQP4-M1-기반에 대 한 상세한 프로토콜 설명, 임상 진단 및 NMOSD의 연구에 적용할 수 있는 합니다.

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프로토콜

이 절차의 첫 번째 병원 길 림 대학 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 고 약 1500 과목에서 수행 되었다.

1. 환자 등록 및 혈액 샘플 컬렉션

  1. 아래 열거 된 수석 불만과 증상 병원 환자에 게 안티 AQP4 IgG 혈 청의 실험실 탐지를 적용 합니다. 또한 검 진을 수행 합니다.

    광학 신경 염: 환자 시각 필드의 손실 및 시력의 감소와 같은 시각적인 적자와 고통을.
    급성 척 수염: 환자 마비, 감각 적자와 자율 기능 장애가 발생할 수 있습니다.
    지역 postrema 증후군: 환자의 설명할 수 없는 딸 꾹 질, 구역 질 또는 구 토 증상이 있을 수 있습니다.
    급성 brainstem 증후군: Brainstem 병 변 다른 증상과 병 변의 위치에 따라 실제 표시 될 수 있습니다.
    증상 narcolepsy 또는 NMOSD-전형적인 diencephalic MRI 병 변과 급성 diencephalic 임상 증후군.
    NMOSD-전형적인 뇌 병 변과 증상이 뇌 증후군.

    참고: NMOSD5에 대 한 국제 합의 진단 기준에 따라 NMOSD의 진단 할 수 있다 경우에 환자는 혈 청 안티-AQP4 igg가 양성 및 핵심 임상 특성 중 적어도 하나 위에서 언급 한 했다. 그러나, 안티 AQP4 IgG만 광학 신경 염 환자에서의 테스트 하지 않는 것이 좋습니다.
  2. 혈액 샘플 컬렉션
    참고:     환자 금식 할 필요가 없습니다.
    1. 4 mL 진공 혈액 컬렉션 튜브에 정 맥 혈액의 2-3 mL를 그립니다.
    2. 실 온 (RT)에서 30 분 동안 응고 혈 청을 수 있습니다.
      참고: 머리말을 붙인 응고 혈소판에서 누설 때문에 혈 청 수준을 높일 수 있습니다.
    3. 2100 x g 에서 원심 분리기는 5 분에 대 한 신중 하 게 새로운 튜브에 혈 청을 전송 합니다.
    4. 혈 청을 즉시 또는 약 수를 분석 하 고-20에서 저장 또는-80 ° C
      참고: -20 ° C에서 저장-80 ° C는 년의 저장에 대 한 개월, 저장을 위해 이다.

2. 안티-AQP4 항 체 검출

주의: 환자 샘플 및 사용된 키트 시 약 전염 물질을 고려 한다. 나트륨 아 지 드 포함 시 약 키트에 독성이 있다. 프로토콜의 흐름 차트는 그림 1에 제공 됩니다.

  1. 준비
    1. RT를 사용 하기 전에 키트를가지고.
      참고: 2-8 ° c.에 키트를 저장
    2. 0.2%를 포함 하는 PBS 워시 버퍼의 적어도 200 mL 준비 트윈 20. 워시 버퍼의 100 mL 500 mL 비 커에 붓으십시오.
    3. 혈 청 샘플 워시 버퍼 10 배 희석. 배포자의 지시에 따라 긍정적이 고 부정적인 컨트롤을 준비 합니다.
  2. 샘플 부 화
    1. 시 약 트레이 (그림 2)의 반응 분야에 미리 희석된 샘플, 긍정적인 통제, 또는 부정적인 컨트롤의 30 µ L를 추가 합니다.
      참고: 공기 방울을 피하십시오.
    2. 바이오 칩 슬라이드에 보호 커버를 제거 합니다.
      참고: 분리 및 고정된 셀의 오염을 방지 하기 위해 봄에는 만지지 마십시오. 덮개를 제거 하기 전에 슬라이드 사이드-의해-측면을 잡으십시오.
    3. 바이오 칩 슬라이드 시 약 트레이 (그림 2)에 적용 됩니다. 실시간에서 30 분 부 화를 시작
      참고: 모든 샘플은 다른 방울과 혼합 하지 않고 해당 바이오 칩에 연결 된 개별 방울 이어야 한다.
    4. 부드럽게 린스 워시 버퍼와 한번 바이오 슬라이드. 바이오 칩 슬라이드 가득한 적어도 5 분 자리 가능 하면 통에 비 커에 대 한 워시 버퍼의 100 mL 500 mL 비 커에 담가.
    5. 바이오 칩 슬라이드 워시 버퍼에서 꺼내 주세요. 신중 하 게 멀리 종이 타월로 반응 분야 이외의 잔여 워시 버퍼를 닦으십시오. 반응 분야에 잔여 워시 버퍼를 증발을 1-2 분 동안 야외에서 바이오 슬라이드를 표시 합니다.
      참고: 반응 분야에 밖으로 건조 하지 마십시오. 종이 타월로 봄에는 만지지 마십시오.
  3. 이차 항 체 외피
    1. 배포자의 지시에 따라 이차 항 체 솔루션을 준비 합니다.
    2. 깨끗 한 시 약 트레이의 반응 분야에 형광 이차 항 체의 25 µ L를 추가 합니다.
    3. 이차 항 체와 함께 로드 시 약 트레이 바이오 슬라이드를 적용 합니다. 실시간에서 30 분 동안 품 어
  4. 장착
    1. 사용된 워시 버퍼에 밖으로 부 어과 신선한 워시 버퍼의 100 mL 비 커에 추가. 2.2.4, 2.2.5 단계에 설명 된 대로 세척을 반복 합니다.
    2. 신중 하 게 바이오 슬라이드 (한 방울 반응 필드)에 반응 필드에 포함 매체를 추가 합니다. 커버 글라스의 한 조각으로 바이오 칩 슬라이드 인감. 공기 방울을 피하십시오.
  5. 형광 검출
    1. 현미경 및 15 분 선택 488 nm 필터에 대 한 사전 열 형광 램프를 켭니다.
    2. 오픈 사진 소프트웨어입니다. 다른 확대와 함께 모든 반응 분야의 transfected와 untransfected 지역에서 사진을 찍을. 먼저, 4 배 확대에 대 한 개요와 함께 한 사진의 찍을 다음 10 x 20 x 확대와 더 많은 사진을 찍어.
      참고: 자세한 프로토콜은 표 1에 표시 됩니다. 해석 결과의 대표적인 결과 섹션에 설명 되어 있습니다.

3입니다. 환자의 진단

  1. 경우 환자는 혈 청 안티-AQP4 IgG-긍정적인 NMOSD의 적어도 하나의 코어 임상 특성을 보여줍니다 (토론 섹션 참조), NMSOD5환자를 진단. 그러나, 환자는 안티-AQP4 경우 IgG-부정, NMOSD의 진단 배제 하지 않을 수 있습니다.

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결과

여기에 설명 된 절차를 사용 하 여, 혈 청 igg가 특정 안티-AQP4 감지입니다. 절차 동안, 미리 희석된 샘플, 긍정적인 통제 및 부정적인 제어 transfected untransfected 영역 (그림 2)를 포함 하는 반응 필드에 추가 되었습니다. Transfected 지역에 부정적인 컨트롤의 형광은 주로 봄에는 (그림 3)에 transfected 세포에 이차 항 체의 불특정 바인딩 표시. 균질 약한 형광 표시 (그림 3) 했다. 긍정적인 컨트롤, 안티-AQP4 항 체 반응 필드에 추가 되었습니다. (그림 4)의 transfected 세포에 AQP4-m 1에 안티 AQP4 IgG의 특정 바인딩 표시 transfected 영역에서 강한 형광 관찰 되었다...

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토론

우리는 안티-AQP4 IgG 인간의 혈 청에서 검출 하는 광범위 하 게 액세스할 수 방법을 설명 했습니다. 안티 AQP4 IgG는 밀접 하 게 관련이 NMOSD, 그리고 신뢰할 수 있는 안티-AQP4 IgG 탐지 방법을 구축 하는 것는 NMOSD의 임상 진단에 대 한 중요 한. 첫째, 안티-AQP4 IgG NMOSD에 대 한 특정 이다. 다 발성 경화 증 또한 중앙 신경의 면역 중재 하는 질병 이며, NMOSD12와 많은 유사점을 공유. 그러나, 안티-AQP4 IgG만 NMOSD13에 긍정적 이다. 둘째, 안티-AQP4 IgG NMOSD 환자 중 일반적 이다. NMOSD 환자의 약 2/3는 세럼 안티 AQP4 igg가 양성4. 셋째, 가장 최근의 진단 기준 NMOSD 세럼 안티-AQP4 기반에 대 한 IgG 테스트5. 함께 찍은, 세럼 안티 AQP4 IgG 탐...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

저자는 국립 과학 재단의 중국 (No. 31600820)는 건강 및 가족계획 위원회의 지린 (번호 2016Q036), 그리고 과학 기술 계획 프로젝트의 지린 (No.에서 보조금에서 지원에 대 한 감사 20180520110JH)입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Anti-aquaporin-4 IIFTEuroimmunFA 1128-2005-50AQP4-M1 transfected 및 untransfected EU 90 세포로 코팅된 바이오칩 슬라이드, 플루오레세인 표지된 anti-human IgG, 양성 대조군으로서의 anti-AQP4 항체, 항체 음성 샘플, PBS pH 7.2, Tween 20 및 임베딩 배지용 염을 포함합니다.
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개선

참고문헌

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