쥐 Adrenocortical 셀 및 Steroidogenic 기능의 분석 실험의 기본 문화

요약

부 신 피 질에서 분 비 하는 호르몬은 스트레스와 질병에 대 한 동물에 대 한 중요 합니다. 여기, 우리는 문화 기본 쥐 프로토콜 부 신 셀을 제시. 그것은 부 신 steroidogenesis와 지질 생 합성의 약의 메커니즘을 조사 하기 위한 좋은 생체 외에서 플랫폼을 수 있습니다.

초록

부 신 피 질에서 분 비 하는 호르몬은 스트레스와 질병에 대 한 동물에 대 한 중요 합니다. 여기에 설명 된 메서드는 기본 교양된 쥐 부 신 세포와 관련 된 기능 분석 실험 (corticosterone 분석 뿐 아니라 지질 작은 물방울 표면 단백질, 면역 형광 얼룩)의. Vivo에서 모델과 달리 단층 부 신 문화에 interexperiments의 변이 덜 이며 실험 조건을 제어 하기 쉽습니다. 게다가, 쥐의 소스 소 것 들과 같은 다른 동물 보다 더 안정적 이기도합니다. 또한 부 신 연구에 사용할 수 있는 여러 인간의 부 신 셀 라인 (NCI H295, NCI-H295R, SW13, 등)이 있다. 그러나,이 선의 스테로이드 생산 여전히 혈 청 로트 번호, 통로 번호, 돌연변이/손실 고유 유전자 등의 수많은 요인에 의해 좌우 됩니다. 17α-hydroxylase 부족, 제외한 쥐 adrenocortical 셀의 기본 문화 부 신 생리학을 공부 하는 더 편리 하 고 더 나은 기술 이다. 요약 하자면, 기본 쥐 부 신 문화 연구자 조사 부 신 시스템에 대 한 관심의 시 약의 메커니즘에 대 한 좋은 생체 외에서 플랫폼 수 있습니다.

서론

내 분 비 시스템은 생리 활동 및 항상성¹규제에 대 한 책임. 두개골의 장 대는 신장에 있는 부 신 땀 샘 분 비 mineralocorticoids, 스테로이드 제제, 그리고 안 드로 겐^2,3주요 내 분 비 장기 중 하나입니다. 부 신 동맥의 2 개의 명백한 부품이 있다: 피 질 하 고 모 수. 부 신 피 질은 3 개의 층으로 이루어져: 외부 glomerulosa, 중간 fasciculata 및 내부 reticularis³. Zona glomerulosa 호르몬, reabsorbing 나트륨 이온과 신장³물에서 에이즈는 mineralocorticoid의 원래 은닉 사이트입니다. Zona fasciculata 주로 정상적인 생리 적인 조건³스테로이드 제제의 기초 수준을 생성합니다. 설치류에서 코르 티 코 스테로이드 및 인 간에 있는 코 티 솔 통제 혈액 포도 당³스트레스 대처에 시체를 돕기 위해 행동. 어느 정도까지, 그들은 선 동적인 응답을 억제 하 고 면역 시스템^4,5조절 수 있습니다. 다른 포유류, 쥐 및 쥐와 달리 필요가 없습니다 기능 zona reticularis 17α-hydroxylase 식의 부족으로 인해 부 신^6,7. 따라서, 쥐 및 쥐에서 adrenals 없는 부 신 C-19 스테로이드 (코 티 솔 그리고 부 신 안 드로 겐)의 분 비는.

기본 교양된 adrenocortical 셀 부 신 생리학⁸제어 메커니즘을 조사 하는 데 유용 해야 표시 되었습니다. Steroidogenic 다른 조직 처럼 각 부 신 존 무료 콜레스테롤⁹에서 스테로이드 합성. Adrenocorticotropic 호르몬 (ACTH) 자극, 무료 콜레스테롤 고장 지질 작은 물방울에서 출시 고, 따라서, fasciculata 및 reticularis¹⁰스테로이드 생산을 향상 시킵니다.

많은 그룹은 adrenocortical carcinomas에서 안정적인 셀 라인을 설정 하려고 했습니다. 그러나, 몇 가지 우려 체 외 모델⁸에서 adrenocortical 셀 라인의 사용을 제한 했다. 세포의 스테로이드 응답 구절, 혈 청의 많은 수와 혈 청, 등의 품질 간에 달라질 수 있습니다. 또한, 상업 부 신 셀 라인 (y 1과 SW13) corticosterone, 부 신 steroidogenesis⁸공부 하기 더 어렵게 만드는 분 비 하지 않습니다. 사용 소 및 말 adrenals ex vivo 모델 좋은 선택이 될 수 있습니다 비록 조직이이 시장에서 몇 가지 알 수 없는 위험 모호한 수 있습니다. 그들에 비해, 쥐 아드레날린 관리 쉽게 이며 소스는 상대적으로 더 안정 되 고 병원 체-무료. 함께 찍은, 여기 설명 하는 현재 방법은 corticosterone 합성 쥐 부 신 fasciculata 세포에서의 관련된 메커니즘을 조사 하 사용 될 수 있습니다.

프로토콜

동물 주제를 포함 하 여 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 가오슝 의학 대학에 의해 승인 되었습니다.

1. 실험 절차

1. CO₂ 안락사에 의해 성인 (8 12 주 오래 된) 여성/남성 SD 쥐를 희생.
2. 70% 에탄올을 적용 하 고, 피부에 흡수 되 고는 티슈로 피부를 닦아 보자.
3. 부정사 위치에 깨끗 한 플라스틱 접시에 쥐를 넣어.
4. "외부" 곡선된 겸 자는 중간에와 피부를 들어올리고 (subcostal 각도에 허벅지의 수준)에서 "Y" 모양 만들어 둔 해 부를 수행 합니다.
   1. 70% 에탄올과가 위를 헹 구 고, 다음, "Y" 모양 만드는 근육을 잘라.
5. 위장 뒤에 왼쪽된 부 신 샘을 찾아.
   참고: 오른쪽 신장 간 뒤에 깊이 찾을 수 있습니다.
   1. 한 쌍의 집게를 사용 하 여 위 또는 간 고와 다른 곡선된 겸 자는 adrenals 분리.
6. 메 마른 그릇에 아드레날린 후, 조심 스럽게 잘 집게와 부 신 캡슐 제거.
7. 가 위는 섬세 한 쌍, 작은 작은 조각으로는 adrenals 잘라 혈 청 무료 Dulbecco의 비트의이 글의 중간 (DMEM)을 수정 / F-12 매체.
8. 3 다른 기 공 크기의 파스퇴르 pipets를 준비 하 고 첫 번째 파스퇴르 피펫으로 콜라 II (~0.5–0.8 mg/mL)와 매체를 포함 하는 50 mL 원뿔 관으로 모든 부 신 조각 발음을 사용 하 여.
   1. 부드럽게 triturate 조직 조각 약 10 배. pipets의 나머지를 사용 하 고 모든 조각을 더 작게 될 때까지 위의 단계를 반복 합니다.
      참고: 파스퇴르 pipets의 다른 기 공 크기는 그들을 불으로가 열 하 여 만들 수 있습니다. 첫 번째 피펫으로 원래 크기 (약 1 m m), 두 번째의 기 공 크기는 약 0.8 m m 이며 세 번째 파스퇴르 피펫으로 약 0.5 m m 이다. 소화, 하는 동안 부 신 조각 작은 될 것입니다. 따라서, 기계적 절차를 통해는 adrenals 수 수 소화 더 많은 완료. (37 ° C)에서 물 욕조에 튜브를 품 어 및 5 분 마다 흔들어 총에서 4 배.
9. 20 분 부 화 후 (겹 볼륨; 예를 들어 조직의 5 mL + 멋진 DMEM/F-12 매체의 25 mL) 신선 하 고 차가운 매체 포함 2.5% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 5% 말 혈 청 효소 효과 중지를 추가 합니다.
10. 10 분 동안 800 x g 에서 원심 분리에 의해 셀 알 약을 수집 합니다.
11. 셀을 일시 중단 하는 매체의 적절 한 볼륨을 추가 합니다.
    참고: 각 선 약 3 ~ 10 배를 만들 수 있습니다⁵ ~ 10⁵ 셀 x 4.
12. 성장 매체와 함께 원하는 격판덮개 또는 접시에 셀 접시 (DMEM 그리고 햄의 F-12 매체의 1:1 [v/v] 혼합 25 mM HEPES 및 1% 페니실린과 스 보충) 95% 공기와 5% CO₂의 습도 환경에서 37 ° C에서 하룻밤 (0 일).
    참고: 일반적으로, 우리 접시 24-잘 접시 (4 개의 샘/접시)에 셀 corticosterone 분석 결과 대 한 고 35에서 m m 요리 (요리 한 선/약 1 ~ 2) 서쪽 오 점 분석.
13. 신중 하 게 씻어 2 셀 세럼 무료 따뜻한 DMEM/F-12 매체 (주 1)와 x. 새로운 성장 매체를 교체 합니다.
14. 3 일까지 95% 공기와 5% CO₂ 의 습도 환경에서 37 ° C에서 세포를 유지 합니다.

결과

여기에 설명 된 절차를 사용 하 여, 기본 교양된 부 신 세포 단계 대조 현미경 (그림 1A) 구별 될 수 있습니다. 더 확인 하려면 소포 세포질 내의 지질 작은 물방울은, 지방 분화 관련 단백질 (ADRP)의 면역 형광 염색 3 일 문화 (그림 1B)에 실시 수 있습니다. 세포는 유리 coverslips에 성장 했다. 셀 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)로 세 번 세척 하 고 4 %paraformaldehyde 고정 했다. PBS로 3 회 세척, 후 셀 차단 하 고 permeabilized 0.1%와 5% 탈지 우유에 트라이 톤 X-100. 기본 ADRP 항 체 5% 탈지 우유에 희석된 (1:50) 고 밤새 껏 알을 품는. 후 세 번의 PBS 세척, 셀 염소 안티 토끼 알 렉 사 Fluor 488 2 차 항 체 (1: 100)와 incubated 했다. 세척 단...

토론

아드레날린은 환경 적응³에서 핵심 역할을 한다. 부 신 피 질에서 분 비는 호르몬 조절 하 고 생리 기능 및 항상성³조정 수 있습니다. Vivo에서 모델 본문에 진짜 생리 적 효과 반영 한다. 그러나, 그것은 여전히 실험에서 불안정 한 효과 일으키는 많은 복잡 한 요인에 의해 좌우 된다. 대조적으로, 생체 외 세포 모델 때문에 동물 모델에 비교할 수 없는 이점이 있다. 첫째, 환경 조건이 생체 외에서 시스템에서 제어 하기 쉬운입니다. 호르몬은 어떤 자극에 의해 영향을 받을 것. 생체 조건 실험 동물 조 난 하는 경향이 있기 때문에 일반적인 반응에 이내 결과입니다. 둘째, 물질은 본문에 모니터링 하기 쉽지 않다 하지만 경작된 시스템에 책임 있다. 셋째, 생체 외에서 시스템 각 독립적인 실험 사이 차이 줄일 수 있습니다. 많은 과학적 보고서 표시 프로토콜 여기에 제시 된 반면 10%-20% FBS¹²

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
암컷/수컷, SD/Wistar 쥐(8-12주)	BioLASCO		수컷 또는 페말 쥐가 실험에 적합합니다. 암컷의 부신은 수컷 쥐보다 크지만 암컷 쥐는 실험에 영향을 미칠 수 있는 발정 주기를 소유
콜라겐 분해 효소, 유형 II	시그마	C-6885	부신 세포 분리
DMEM	ThermoFisher	12800-017	부신 세포용 분말 매체
Ham's F12	ThermoFisher	21700-075	부신 세포용 분말 매체
HEPES	JT.baker	4018	완충액(분말)
NaHCO3	JT.baker	3506-1
호스 세럼	Hyclone	16050014
소 태아 혈청	SAFC	12103C
페니실린(10,000 U)-스트렙토마이신(10,000 ug/mL)Corning		30-002-Cl	항생제
곡선 집게		BRAUN BD343R
집게		BRAUN BD331R
가위	BRAUN	BC224R	컷 쥐 피부와 근육
섬세한 가위	BRAUN	BC101R	컷 부신
지방 분화 관련 단백질	Abcam	ab108323	항체 지질 방울 관련 단백질
코르티코스테론 ELISA 키트	케이맨	500655	코르티코스테론 합성
분석 도립광 현미경 라이	카
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