작은 분자 조사를 시험관 및 셀 모양을 사용 하 여 사전 mRNA 구조 변화 유도

요약

둘 다 생체 외에서 그리고 세포에서 선택적 2'-히 드 록 acylation 뇌관 연장 (모양) 실험 사전 mRNA 시퀀스는 RNA를 대상으로 작은 분자의 존재의 2 차 구조를 결정 하 여 분석에 대 한 자세한 프로토콜은 이 문서에서 제시 하는.

초록

RNA를 대상으로 작은 분자의 약 개발, 과정 대상 RNA 순서와 그들의 상호 작용에 구조적인 변화를 elucidating는 원한다. 우리 여기는 상세한 생체 외에서 제공 하 고 셀 선택 2'-히 드 록 acylation 뇌관 연장에 의해 척수 근육 위축 증 (SMA)의 생존에 대 한 실험 약물의 RNA 구조 변화 연구 (모양) 프로토콜 분석 모터 신경 (SMN)-c 2를 사전-SMN2 유전자의 mRNA의 exon 7에서. 생체 외에서 모양, SMN2 exon 7 포함 된 140 뉴클레오티드는 RNA 순서 T7 RNA 중 합 효소에 의해 복사할 SMN-C2, 존재 접혀 이며 가벼운 2'-OH acylation 시 약, 2-methylnicotinic 산 imidazolide (NAI)에 의해 연속적으로 수정. 이 2'-오-NAI adduct 추가 ³²P 표시 된 뇌관 연장에 의해 조사 되 고 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지)에 의해 해결. 반대로, 2'-OH acylation 셀 모양에서 일어난다 SMN-C2 바인딩된 세포질 RNA와 현장에서 살아있는 세포에서. 뇌관 연장에 모양 유발 돌연변이와 SMN2 유전자에서 exon 7의 사전 mRNA 순서는 다음 차세대 시퀀싱 및 PCR에 의해 증폭 됩니다. 두 가지 방법론을 비교, 생체 외에서 모양을 더 비용 효율적인 방법 이며 결과 시각화 하는 컴퓨팅 파워를 필요로 하지 않습니다. 그러나, 생체 외에서 모양을 파생 RNA 모델은 때때로 RNA 의무적인 단백질에와 함께 모든 상호 작용의 손실로 인해 가능성이 셀룰러 맥락에서 이차 구조에서 일탈 한다. 셀 모양 방사성 소재 직장을 필요 하지 않습니다 고 세포질 문맥에서 더 정확한 RNA 이차 구조를 생성 합니다. 또한, 셀에 형태는 일반적으로 해당 페이지 분석에 의존 하는 체 외에 비해 차세대 시퀀싱을 활용 하 여 더 큰 범위의 RNA 시퀀스 (~ 1000 뉴클레오티드) 모양 (~ 200 뉴클레오티드)는 일반적으로 대 한. SMN2 사전-mRNA에 exon 7의 생체 외에서 그리고에서 셀 모양 파생 하는 경우에 RNA 모델은 서로 비슷합니다.

서론

선택 2'-히 드 록 acylation 뇌관 연장 (모양)에 의해 분석은 관심사의 RNA 순서에 있는 각 뉴클레오티드의 활동을 측정 하 고 단일 뉴클레오티드 해상도¹에서 이차 구조를 elucidating 방법입니다. 생체 조건^2,,34 (정의 된 버퍼 시스템에서 정화 RNA)에 둘 다 모양 방법론 및 보조를 조사 하기 위해 개발 되었습니다 생활 포유류 세포^5,6, 중간 길이가 RNA의 구조 (일반적으로 < 셀 모양에 대 한 1000 뉴클레오티드와 < 생체 외에서 모양에 대 한 200 뉴클레오티드). 특히 유용 바인딩 상호 작용 하는 RNA 분자 대사 산물^2,4,7,8 시 수용 체 RNA에에서 구조적인 변화를 평가 하 고 기계 작업을 공부 하 약 개발

프로토콜

1. 시험관 모양에서

참고: 프로토콜 게시 프로토콜¹에서 수정 됩니다.

1. RNA 서식 파일 준비
   참고: T7 전사에 대 한 서식 파일 합성 이중 가닥 DNA (dsDNA) 고 중 삽입 대장균 벡터에 의해 증폭 된 EcoRI/BamHI 금지 endonuclease, pET28a, 또는 PCR에 의하여의 독특한 쌍으로 명령 했다. PCR 확대를 위한 프로토콜은 아래 나와 있습니다.
   1. 다음 자료를 믹스: PCR 마스터의 50 μ 믹스 ( 재료의 표참조), 10 μ M에 각 뇌관을 위해 2 μ (시퀀스 표 1 참조), 200 2 μ 및 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 3 μ H₂두 개의 PCR로 약 수 오의 41 μ dsDNA 템플릿의 ng 튜브 (각 튜브 포함 반응 혼합물의 50 μ).
   2. 다음과 같이 열 cycler 설정: 단계 1) 95 ° C 30에 대 한 s; 2 단계) 20 95 ° C s; 3 단계) 20 56 ° C s; 4 단계) 20 72 ° C....

결과

우리는 이전 변조기를 접합 하는 RNA, SMN-C2, SMN2 유전자의 사전-mRNA의 exon 7에 AGGAAG 모티브로 작용을 SMN C2⁶존재 RNA 구조 변화를 평가 하기 위해 모양 사용 설명 했다. SMN-c 2의 바인딩 사이트는 FDA 승인 센스 oligonucleotide (아소) SMA, 바인딩하고 차단 intronic 접합 소음 기 (ISS) intron 7^27,28 (그림 1A)에 nusinersen에 대 한 구분 이다. 가장 알려진된 접합 레 귤 레이 터 SMN2 exon 7의 범위 내에 있는 ~ 100 뉴클레오티드의 exon 7 사전 mRNA²⁹; 따라서,는 140과 276 뉴클레오티드 긴 RNA 시퀀스 사.......

토론

생체 외에서 모양, 그것이 고품질 동종 RNA 서식 파일을 사용 하 여 중요 합니다. 그러나 T7 전사,, 종종 다른 유형의 시퀀스³⁶을 생성합니다. 특히, ± 1에는 3'-무시할 수 없는 수익률³⁶ 와 뉴클레오티드와 시퀀스는 일반적으로 polyacrylamide 젤 정화에 의해 제거 될 어렵다. 유형이 다른 RNA 템플릿을 때로는 어려운 결과 해석 하는 뇌관 확장 제품의 시퀀싱 젤 프로 파일링 신호 하나 이상의 집합에 발생할 수 있습니다. Ribozyme에서 모두 5'-3'-끝 RNA 템플릿 식 카세트의 양쪽 균일 할 것입니다.

생체 외에서 그리고에서 셀 모양, 2'-오 수정 시 약의 부 화 시간은 또 다른 중요 한 요소 이다. 그것은 적어도 5 배 하프 라이프 2'-OH acylation 물 냉각 하는 시 약의 사용된¹이어야 한다 주 그룹에 의해 제.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
>200 bp DNA 합성을 위한	DNA 올리고뉴클레오티드	IDT
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR 마스터 믹스	Thermo Fisher	F566S
NucleoSpin 겔 및 PCR 클린업 키트	Takara	740609.50
MegaScript T7 전사 키트	Thermo Fisher	AM1333	10x 반응 버퍼, T7 효소, NTP 및 Turbo DNase 포함
DEPC 처리된 물	Thermo Fisher	750023
2x TBE-urea 샘플 버퍼	Thermo Fisher	LC6876
40% 아크릴아미드/비사아크릴아미드 용액 (29:1)	Bio-Rad	1610146
10x TBE 버퍼	Thermo Fisher	15581044
Nalgene Rapid-Flow™ 필터 유닛	Thermo Fisher	166-0045
Kimwipe	Kimberly-Clark	34133
TEMED	Thermo Fisher	17919
SYBR-Safe dye	Thermo Fisher	S33102
6% TBE-urea mini-gel	Thermo Fisher	EC6865BOX
ChemiDoc	Bio-Rad
T4 PNK	NEB	M0201S
γ-32P-ATP	Perkin Elmer	NEG035C005MC
하이퍼스크린&트레이드; 강화 스크린	GE 헬스케어	RPN1669	칼슘 텅스텐 산염 형광체
스크린 형광체 저장 스크린	분자 역학	BAS-IP MS 3543 E
아머샴 태풍	GE 헬스케어
NAI (2M)	EMD 밀리포어	03-310
글리코블루	써모 피셔	AM9515
SuperScript IV Reverse 전사 효소	Thermo Fisher	18090010	5x RT 버퍼, SuperScript IV
dNTP 믹스 (10 mM)	Thermo Fisher	R0192
ddNTP 세트 (5 mM)	Sigma	GE27-2045-01
대형 여과지	Whatman	1001-917
젤 건조기	Hoefer	GD 2000
QIAamp DNA Blood Mini Kit	Qiagen	51104	RNase A 및 프로테아제 K
SMN2 minigene34	Addgene	포함72287
열 비활성화 FBS	Thermo Fisher	10438026
Pen-Strep	Thermo Fisher	15140122
Opti-MEM I	Thermo Fisher	31985062
FuGene HD	Promega	E2311
TrpLE	Thermo Fisher	12605010
DPBS (Ca/mg 제외	Thermo Fisher	14190250
TRIzol	Thermo Fisher	15596018
RNeasy 미니 컬럼	Qiagen	74104	RW1, RPE 완충액
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254	DNase I 및 RDD 완충액
포함 탈이온화 포름아미드	Thermo Fisher	AM9342
MnCl2• 4H2O	Sigma-Aldrich	M3634
랜덤 노나머	Sigma-Aldrich	R7647
SuperScript First-Strand Synthesis System	Thermo Fisher	11904-018	10x RT 완충액, SuperScript II 역전사효소
AccuPrime pfx DNA polymerse	Thermo Fisher	12344024
NextSeq500	Illumina	포함
NucAway 컬럼	Thermo Fisher	AM10070	탈염 목적

gBlock 포함)