향상 된 높은 처리량 호흡 Syncytial 바이러스 (RSV) 마이크로 중화 분석 결과

요약

높은 처리량,이 연구에 설명 합니다 호흡 syncytial 바이러스 (RSV)에 대 한 특정 중화 항 체 titer를 확인 하려면 이미징 기반 마이크로 중화 분석 결과. 이 분석 결과 형식은 다른 샘플 형식에 대해 테스트 되었습니다.

초록

호흡 syncytial 바이러스는 특정 중화 항 체 (RSV NAbs)는 RSV에 대 한 보호의 중요 한 표식. 다른 분석 결과 형식의 번호에에서는 현재 전세계 사용 이므로 RSV NAbs 측정 하기 위한 정확 하 고 높은 처리 방법에 대 한 필요. 여기는 영상 기반 마이크로 중화 분석 결과 RSV 하위 그룹 A에서 테스트 되었습니다와 RSV 하위 그룹 B 및 서로 다른 샘플에 대 한 또한 적응 수 있습니다 설명 합니다. 이 방법은 매우 재현성, 참조 원으로 10% 미만 대 한 상호 분석 결과 유사 합니다. 우리는이 분석 결과 많은 실험실에서 상대적으로 저렴 한 비용으로 전세계에 쉽게 설치 될 수 있다 믿습니다. RSV NAbs 측정 개선, 높은 처리량 분석 결과의 개발 뿐만 아니라 소설 RSV 백신 후보자의 평가 미래에 대 한 중요 한 되 고 국제적으로이 방법의 표준화에 대 한 중요 한 단계를 앞으로 나타냅니다.

서론

호흡 syncytial 바이러스 (RSV) 소아 인구 세계¹에 더 낮은 호흡 기관 감염의 주요 원인입니다. 그것의 높은 부담에도 불구 하 고 아직 아무 백신 이나 치료 가능한 있다. 2013 년 이후 세계 보건 기구 (WHO)는 주요 연구 우선 순위, 연간 WHO 상담 회의^2,3로 RSV 백신 개발을 선언 했다. WHO는 RSV 중화 항 체 (NAb) 측정 모니터를 사용 하 백신 immunogenicity로 보호⁴의 주요 혈 청 학적인 감 적으로 인식 되 고이에 동의 했다. NAbs 안티-RSV 단일 클론 항 체 palivizumab, 현재만 예방 전략 사용 가능한⁴의 임상 시험 연구의 숫자에 가혹한 RSV 감염 으로부터 보호 하기 위해 표시 되었습니다.

^5,6,,78도전 표준화 노력 ....

프로토콜

참고: 모든 단계는 다르게 명시 하지 않는 한 BSL2 후드에서 수행 해야 합니다. 바이러스 성 적정이 PRN 분석 결과에 사용 되는 최적의 RSV 농도 결정 하는 PRN 분석 결과 사전 필요 합니다. 약 수를 한 번 해 동 되 고 각 NAb 분석 결과 대 한 사용 되는 작은 볼륨에서 바이러스 주식 추천 된다. 모든 NAb 분석 한 연구에서 모든 샘플에 대 한 수행에 대 한 같은 바이러스 성 주식을 사용 하 여 또한 것이 좋습니다. 문화 미디어와 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 셀 접시에 추가 하기 전에 37 ° C에서 예 열이 다는 것을 확인 하십시오.

1. RSV 바이러스 성 적정

참고: 바이러스 주식 수와 중복의 수에 따라 분석 결과 접시 그림 1에 따라 설정할 수 있습니다. 각 바이러스 주식 분석 결과 플레이트, 높은 바이러스 농도 (즉, 1:10)부터 아래로 3 중에서 적정 한다. 일반적으로 직렬 titrations 수 1시 10분. RSV 문화 절차 뿐만 아니라 A549 세포 배양 및 유지 보수 할 수 있습니다 표준 절차를 사용 하 고이 프로토콜에 포함 되지 않습니다.<....

결과

바이러스 주식의 적정 1:10 1시 10분에서 수행한 PRN 분석 결과 (대표 결과 그림5) 전에 바이러스 재고 농도 결정 하기 위해⁸ 희석. 그림 5, PFU 계산 될 수 있는 안정적으로 1:10 희석에⁴ 와 1시 10분⁵. PFU에서 같은 희석 triplicate 우물에서의 평균 수를 계산 했다. 1 10⁵ 희석은 14에 관광 명소의 평균 수, 이후이 바이러스의 바이러스 titer는 다음과 같이 결정 했다.:

14 (반점의 평균 수) / [10^-5 (희석) x 0.1 mL (inoculum 볼륨)] = 1.4 x 10⁷ PFU/mL

.......

토론

우리가 개발 하 고 최적화는 간단 하 고 효율적인 RSV 마이크로 중화 분석 결과 대부분 실험실에서 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 분석 결과 컴퓨터 이미지 검색을 사용 하 여 세포 수준에서 NAb 바이러스 성 감염의 억제를 측정 뿐만 아니라 바이러스 감염 능력을 측정할 수 있다. 이미징 기반 플랫폼 및 특정 항 체 기반 시스템을 사용 하 여 특이성 및 전통적인 패 감지 방법^6,7에 비해 자리 탐지의 감도 증가 했다. 이로써 RSV의 낮은 infectivity와 변종 및 또한 PRN 분석 결과에서 사용 하기 전에 RSV의 정확한 정량화를 제공 합니다.

바이러스 성 주식의 동일한 배치 RSV 주식 사이 어떤 일괄 배치 변화를 최소화 하기 위해 각 연구에 사용 되도록 하는 것이 좋습니다. 분석 결과의 다른 중요 한 측면의 바이러스 입력, 무결성 A549 세포 단층 및 분석 결과 일.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Cell line
A549		ATCC CCL-185	by Dr Keith Chappell, University of Queensland
Viral srains
RSV A2	ATCC	VR-1540	로트 번호 60430286
Reagents
Acetone	Merck	1000142511
Alexa-Fluor 당나귀 안티 염소 IgG (4 ° C)	Life Technologies	A11055
CMC 나트륨 염 분말	Sigma-Aldrich	C5678-500G
DMEM (혈청 없음, 3.7 g / L NaHC, P / S) (4 °C에서 저장; C)	과학 서비스 – 조직 배양		MCRI in house 공급
태아 송아 혈청 (-20 °에서 50 mL 부분 표본에 보관; C)	Interpath	SFBS-F
Goat X RSV 항체	Merck	AB1128
호흡기 세포융합 바이러스(RSV)에 대한 인간 다클론 항혈청 (45 µ에 저장; L 부분 표본 -20 ° C)	BEI Resources	NR-4022	등록 시 BEI Resources를 통해 무료 주문. 이 혈청은 RSV (NR-32832)
M199 분말	Life Technologies	31100035
우유 희석제 차단 용액 (4 °C에 저장)에 대한 인간 항혈청 및 면역 글로불린 패널에 속합니다. C)	Australian Biosearch	50-82-01
페니실린 / 스트렙토 마이신 (-20 °에서 6mL 부분 표본에 저장됨; C)	Life Technologies	15140122
Milli-Q 디스펜서의 s.d.H2O	Merck		사내 분배
배양용 멸균 1x PBS(4°C에서 보관; C)	과학 서비스 – 조직 배양		MCRI in house supply
트윈 20 폴리소르베이트	Sigma-Aldrich	9005-64-5
General Consumables
Conical Falcon tubes (50 mL)	Invitro Technologies	FAL352070
Filter unit 0.22 μ m (500 mL)	Thermo Fisher	NAL5660020
Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL)	Australia PL	AM12400
Sterile flat-bottom plates (96-well with lid)	Interpath	655180
sterile U-bottom plates (96-well with lid)	Interpath	650180
5 mL 혈청 피펫	Sigma-Aldrich	CLS4487-200EA
10 mL 혈청학 피펫	Interpath	607180
25 mL 혈청학 피펫	Sigma-Aldrich	CLS4251-200EA
팁 피펫 1-200 µ L Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960	Fisher Biotec	TF-200-L-R-S
팁 피펫 5-20 µ L Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960	Fisher Biotec	TF-20-L-R-S
팁 피펫 100-1,000 µ LClear Maxymum Recovery 랙 사전 멸균 10RACKS x 100TIPS PKG1000	Fisher Biotec	TF-1000-L-R-S
팁 피펫 1-10 µ L Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001	Fisher Biotec	TXLF-10-L-R-S
Equipments and softwares
ELISpot reader system	AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany
AID ELISpot software version 5.0	AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany
마이크로소프트 엑셀 2007

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