공간 분석 및 쥐 상자 테스트 매달려의 저가 프로토콜 적용 구속 만성 스트레스

요약

저가 프로토콜 발자국 분석의 구성 및 구속 스트레스 마우스 모델의 운동 장애를 평가 하는 데 유용 후 상자 테스트를 거

초록

걸음 걸이 장애 운동 장애를 가진 환자에서 자주 관찰 됩니다. 운동 장애에 대 한 사용 되는 마우스 모델, 걸음 걸이 분석에서는 쥐 환자의 증상을 모방 여부를 결정 하는 중요 한 행동 테스트입니다. 아무 자발적인 모터 형 마우스 모델에서 관찰 하는 때 모터 적자는 자주 스트레스에 의해 유발 됩니다. 따라서, 걸음 걸이 분석 스트레스 로드 다음 마우스 모델에서 모터 형을 평가 하기 위한 중요 한 방법 것입니다. 그러나, 연구원은 걸음 걸이 분석에서 정량 결과 자동으로 받도록 비싼 기구 필요가 얼굴. 스트레스, 스트레스 비싼 기구 전기 충격에 대 한 필요 및 실행 없이 간단한 방법으로 로드 바람직합니다. 따라서, 우리는 상자 테스트 모터 기능을 평가 하 거 종이와 잉크, 공간 분석의 구성 된 간단 하 고 저가 프로토콜 소개 하 고 스트레스 로드 원뿔 튜브와 구속에 의해 정의 된. 쥐의 모터 적자가이 프로토콜에 의해 성공적으로 감지 했다.

서론

운동 장애는 초과 또는 자발적 또는 자동 운동¹의 소수를 보여주는 신 경계의 소요로 정의 됩니다. 특히, 걸음 걸이 장애 운동 장애^2,,34환자 중 자주 설명 되어 있습니다. 따라서, 걸음 걸이 분석 운동 질환의 동물 모델의 유효성 검사에 대 한 적합 한 행동 테스트입니다. 쥐, 자동화 된 걸음 걸이 분석 디딜 방 아^6,7에 의해 자연 속도⁵ 및 조정 가능한 속도에서 걷기를 위해 수행 되었습니다. 이러한 분석은 자동으로 걸음 걸이의 정량 결과 제공합니다. 걸음 걸이 장애를 감지 하는 다른 방법은 발자국 분석을 이라고 합니다. 잉크와 피트의 바닥 라벨, 후 쥐 종이에 고 발자국 분석. 처음에, 바 셀 린 그리고 가루 숯⁸발자국 시각화 하는 데 사용 했다 다음 거짓말 탐지기 종이⁹ 에 잉크 및 인화지¹⁰사진 개발자에 의해 대체 되었다. 잉크를 사용 하 여 종이 다른 방법 보다 저렴 하 고 덜 독성 방법¹¹현재까지 남아 있다. 발자국 분석과 자동된 분석^5,,67 에 비해 덜 비싼은 풍부한 연구 자금 없이 연구원에 대 한 마우스 모델에 운동 장애를 평가 하기 위해 유용할 것 이다 .

교수형 상자 테스트 와이어 케이지 뚜껑¹² 를 사용 하 여 4 개의 다리 걸려 테스트의 일종 이며 와이어 메쉬 스크린¹³. 상자는 상자 센터 바에 따라 정상 회전 메쉬 뚜껑 기구 이다. 걸음 걸이 분석 뿐만 아니라 테스트 수 있습니다 저렴 하 고 쉽게 수행. 따라서, 우리는 교수형을 실시 평가 그립 강도와 균형, 또한이 프로토콜에 발자국 분석 하기 상자 테스트.

스트레스는 운동 장애^14,15의 증상을 유도합니다. 아무 자발적인 모터 형 운동 장애^16,,1718의 마우스 모델에서 관찰 하는 경우에 모터 적자는 종종 여러 가지 만성 스트레스에 의해 유발 됩니다. 구속은 스트레스 때문에 동물 육체적으로 무사 히¹⁹ 이며 비용 덜 전용된 기구와 전기 충격 같은 다른 방법에 비해 쥐, 로드에 대 한 일반적으로 사용 되는 방법의 하나 이며 디딜 방 아의 사용과 실행 강제. 구속 수감 숨어 50 mL 원뿔 튜브에 마우스에 의해 수행 되는 관으로 와이어 같은 다른 방법을 메쉬 스 트레이너, 녹화 사지, 거 즈 (검토²⁰)와 동물의 포장 보다 쉽습니다. 이 문서에 요약 하는 면적의 프로토콜 분석 및 교수형 상자 튜브에 의해 구속 후 테스트. 이 프로토콜 자발적인 모터 형 없이 운동 장애의 마우스 모델을 사용 하 여 우리를 도울 것입니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 인간적 인 방식으로 실시 했다. 기관 동물 실험 위원회의: Jichi 의료 대학 연구 승인. 연구 기관 규정에 따라 동물 실험 및 기본 지침에 대 한 동물 실험의 적절 한 수행과 학술 연구 기관에서 관련 활동에 대 한 일본의 문 부 과학성의. 이 프로토콜에서 사용 하는 마우스 되었습니다²¹위에서 설명한.

1. 교수형 상자 테스트

1. 각 마우스의 무게를 기록 합니다. 개별 차별에 대 한 표시 펜으로 꼬리를 표시 (예:., 는, 더블 라인, 라인과 트리플 라인).
   참고: 성장 곡선의 일반적인 건강²²인덱스에 사용 됩니다.
2. 행동 테스트 하기 전에 실험 실 적어도 30 분에는 마우스를 놓습니다. (그림 1) 위에 회전 메쉬 뚜껑 분명 상자 (25 x 25 x 40 c m³)로 구성 되어 교수형 상자 설정. 메쉬 뚜껑 상단 180도 뒤집혀 있도록 중앙 막대를 따라 회전할 수 있습니다.
3. 메쉬 뚜껑의 중앙에 마우스를 넣어. 조심 스럽게 측면을 메쉬 뚜껑 거절.
4. 가 대기 시간 (시간 걸려) 메쉬 뚜껑에서 마우스를 측정 합니다.
   참고: 마우스 5 분 이내가 하지 않는 경우 5 분으로 대기 시간을 기록 합니다.
5. 홈 케이지를 마우스를 반환 합니다. 모든 테스트 후 70% 에탄올과 교수형 상자를 청소 합니다.

2. 공간 분석

참고: 교수형 상자 다음 테스트, 공간 분석을 수행.

1. 설정 는 활주로 (그림 2A)입니다.
   1. 흰 종이의 한 조각 잘라 (29.7 cm x 42 cm x 0.09 m m) 동등한 폭의 3 개의 길이에 경도. 테이블에 흰 종이 (9.9 c m x 42 cm)를 설정 합니다.
   2. 종이의 원심 끝에 어두운 목표 상자를 넣어. 넣어 다른 쥐의 탈출 방지 활주로의 양쪽에 벽 (약 그는 종이의 동일한 길이) 상자.
   3. 별도 접시 (지름 35 m m)에 검정 잉크와 빨간 잉크를 넣어.
2. 교육 세션입니다.
   참고: 나이의 4 주에만 훈련을 수행 합니다.
   1. 종이 (얼굴 목표 상자 쪽으로 머리)의 근 위 끝에 마우스를 넣어. 목표 상자를 근 위 끝에서 도보 마우스를 하자. 목표 상자에서 마우스를 제거 합니다. 마우스는 종이에 중지, 가볍게 눌러 마우스 목표 상자를 손가락.
   2. 앞 발 움직임을 제한 하는 엄지와 집게 손가락 사이 아저씨를 파악 하 여 마우스를 잡아. 다음, 뒤 및 꼬리는 엄지손가락의 공과 hindlimbs의 움직임을 제한 하는 다른 손가락 사이 파악.
      참고: 옷에 잉크도 말에서 마우스 결과의 부족 들고.
   3. 앞 발에 빨간 잉크의 바닥 및 검정 잉크에 hindlimbs의 바닥을 담가. 바로 종이 (얼굴 목표 상자 쪽으로 머리)의 근 위 끝에 마우스를 넣어. 목표 상자를 근 위 끝에서 도보 마우스를 하자. 마우스는 종이에 중지, 가볍게 눌러 마우스 목표 상자를 손가락.
   4. 목표 상자에서 마우스를 제거 합니다. 테스트 세션으로 이동 합니다.
3. 세션을 테스트 합니다.
   1. 훈련 세션을 다음 흰 종이의 새로운 커트 조각으로 발자국에 대 한 활주로를 설정 합니다.
   2. 앞 발 움직임을 제한 하는 엄지와 집게 손가락 사이 아저씨를 파악 하 여 마우스를 잡아. 다음, 뒤 및 꼬리는 엄지손가락의 공과 hindlimbs의 움직임을 제한 하는 다른 손가락 사이 파악.
   3. 앞 발에 빨간 잉크의 바닥 및 검정 잉크에 hindlimbs의 바닥을 담가. 바로 종이의 근 위 끝에 마우스를 넣어. 목표 상자를 근 위 끝에서 도보 마우스를 하자.
      참고: 어둠을 선호 하는 쥐, 때문에 꾸준한 마우스 접근 어두운 목표 상자 됩니다 산책. 마우스는 종이에 중지, 가볍게 눌러 마우스 목표 상자를 손가락. 다음, 분석에 대 한 신뢰할 수 있는 발자국 얻지 (단계 2.4을 참조 하십시오. 대 한 발자국의 분석 내용을) 마우스 중지 때문에 다시 테스트 세션을 시도 합니다.
   4. 홈 케이지를 목표 상자에서 마우스를 반환 합니다. 각 테스트 세션 후 70% 에탄올과 목표 상자를 청소 합니다. 발 인쇄 종이 건조
4. 발자국의 분석
   1. 각 매개 변수의 3 측정을 얻기 (앞 발과 hindlimbs, 전면 및 뒷 다리 기본 너비의 길이 보 폭, forelimb hindlimb, 그림 2B사이 오버랩) 발 인쇄 종이에서 통치자와.
      참고: 때문에 인접 하 고 원심 끝의 발자국 자주 중지 때문에 큰 변화를 표시 또는 발자국의 꾸준한 걸음 걸이 패턴 부분을 선택, 실행. 발 인쇄 종이의 가운데 부분 일반적으로 분석에 적합 것입니다.
      1. 보 폭 길이 대 한 발 (예를들면, 발 패드 또는 발가락)의 동일한 부분 사이의 거리를 측정 합니다.
      2. 전면 기본 너비에 대 한 연속 오른쪽 (또는 왼쪽) 앞 발자국 사이 선을 그립니다. 그런 다음에 오른쪽 (또는 왼쪽) 발자국 사이 그린 선 왼쪽 (또는 오른쪽)의 앞 면적의 패드에서 수직 라인의 길이 측정 합니다.
      3. 뒷 기본 너비에 대 한 연속 오른쪽 (또는 왼쪽) 뒷 발자국 사이 선을 그립니다. 그런 다음에 오른쪽 (또는 왼쪽) 발자국 사이 그린 선 왼쪽 (또는 오른쪽) 뒷 발자국의 패드에서 수직 라인의 길이 측정 합니다.
      4. 오버랩, 패드 왼쪽 (또는 오른쪽)의 앞과 뒷 발자국 사이의 거리를 측정 합니다.
   2. 각 개인에 대 한 세 가지 측정 평균. 개별 평균 각 매개 변수를 사용 하 여 통계 분석을 위해.
      1. 보 폭 길이 대 한 왼쪽 및 오른쪽 진보의 개별 평균 평균을 사용 합니다.
      2. 다리 길이의 비대칭에 대 한 개별 평균 왼쪽된 다리와 오른쪽 다리 보 폭 길이 차이의 절대 값을 사용 합니다.
      3. 다른 매개 변수 (앞 기본 너비, 뒷 기본 너비 및 중복)의 통계 분석에 대 한 직접 개별 평균을 사용 합니다.

3. 구속 스트레스 로드

1. 감 관의 준비입니다.
   1. 눈금 표시를 따라 16 구멍 (직경 약 2 m m) 50 ml 원뿔 튜브 (지름 x 115 mm 길이 30 m m)에 게 (5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 mL)와 평방 드릴 (그림 3)에 의해 표시 하는 각 규모의 뒷면. 팁을 절단 하 여 호흡에 대 한 50 mL 원뿔 튜브 (지름 약 5 m m)의 끝에 구멍을 확인 합니다. 쥐의 꼬리를 통과 관 뚜껑에 구멍 (직경 약 4 m m)를 확인 합니다.
2. 스트레스 로드
   1. 실험 실에서 쥐를 놓습니다.
   2. 엄지와 집게 손가락 사이 아저씨를 파악 하 여 마우스를 잡아. 머리에서 구속 튜브에 마우스를 입력 합니다. 뚜껑에 구멍을 통해 꼬리를 전달 합니다. 뚜껑을 닫습니다.
      참고: Forelimb 운동 제한 마우스 앞 발에 의해 튜브를 입력 거부 때문에.
   3. 실 온에서 책상에 2 h에 대 한 동봉 하는 마우스를 유지. 감 관에서 마우스를 제거 하 고 홈 케이지 돌아갑니다.
      참고: 세척 후, 건조 감 튜브를 다시 수 있습니다.

4. 실험 일정 (그림 4).

1. 교수형을 수행 테스트 및 공간 분석의 4 주에 같은 날에 상자 (1 단계 참조 하십시오. 매달려 상자 테스트 및 2 단계. 자세한 내용은 발자국 분석) '스트레스 그룹'과 '비 스트레스 그룹'으로 그룹화 하기 전에 모든 쥐에 기준선 측정으로.
   참고: 약 8-10에 2-3 새끼 쥐 실험에서 사용에 적합 있을 수 있습니다. 학습 및 테스트 세션 4 주 나이의 공간 분석에 의하여 이루어져 있다.
2. 임의로 나눌 쥐 '스트레스 그룹'과 '비 스트레스 그룹'.
   참고: 쥐를 사용 하는 구성 된 여러 새끼 때 두 그룹으로 littermates 균일 하 게 나눕니다. 각 그룹에 번호 구성에 대해 4-5 쥐.
3. 그룹에 적용할 구속 스트레스는 ' 스트레스 ' 6 번 (3 단계 참조 2 주에 걸쳐. 구속 스트레스 자세한 내용은 로드)입니다.
   참고: 6 번 구속의 적용 됩니다 매 2 주 뒤에 매달려 나이의 6-12 주에서 테스트 및 공간 분석을 상자. 교수형의 시험 당일에 구속 스트레스를 적용 하지 마십시오 테스트 및 공간 분석.
4. 교수형을 수행 테스트 및 6, 8, 10, 같은 날에 발자국 분석 테스트 세션 및 나이의 12 주.

결과

Atp1a3 의 heterozygous 남성 쥐 (Atp1a3^{+ / −})는 마우스 모델 빠른 발병 dystonia 위한 parkinsonism 및 야생-타입 littermates이이 프로토콜에 사용 되었다. Atp1a3^{+ / −} 나이 (그림 5A 와 그림 5B, 원을 열고 광장)의 4 주 보다 야생 타입의 forelimb와 hindlimb 상당히 짧은 보 폭 길이 보였다. '스트레스' Atp1a3^{+ / −} ' 비 스트레스 ' 보다 두 사지의 상당히 짧은 보 폭 길이 보여 Atp1a3^{+ / −} (그림 5A와 5B 그림...

토론

공간 분석 및 테스트 교수형 상자는 마우스의 모터 기능에 대 한 간단 하 고 저렴 한 행동 테스트. 여러 마우스 모델에서 neurobehavioral 고기가이 테스트에 의해 성공적으로 발견 되었습니다. 예를 들어 루 경화 증²⁴, 증 telangiectasia²⁵, Huntington의 질병²⁶ 및 dystonia²⁷, 중복의 증가 길이에 비대칭 보 폭의 증가 길이 보 폭 길이 단축 하 고 넓히고 기지 증^28,29, Angelman 증후군³⁰ dystonia³¹ 발자국 분석에 의해 설명 되었다. 또한, 컨트롤 마우스의 그것 보다 짧은 거 시간 듀 켄 씨 근이 영양 증

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
매달려 상자	O' 하라 & 공동.	http://ohara-time.co.jp/products/wire-hanging-test/
마킹 펜	ZEBRA	MO-120-MC-BK
골 박스	O' 하라 & 공동.	http://ohara-time.co.jp/products/balanced-beam-test/	밸런스 빔 테스트
박스	O' 장치용 액세서리 하라 & 공동.	-	활주로 측벽
검정 잉크	Shin-asahi-Red
ink	마루야마 공업	BC-6
일회용 페트리 접시	코닝	351008	페트리 접시 (직경 35mm)
Askul Multipaper Super White J Monochrome A3	Askul	701-712	White paper (29.7 cm x 42 cm x 0.09mm)
50 mL 원뿔 관	코닝
스퀘어 드릴	주식회사 카쿠리	DIY 팩토리 (K32-0313)