완전히 자치 특성화 및 생물학 고분자의 결정에서 데이터 수집

Summary

여기, 우리는 일부 싱크 로트 론 beamlines에 자동화 심사 및 사용할 수 있는 데이터 수집 옵션을 사용 하는 방법을 설명 합니다. 과학자는 싱크 로트 론 cryocooled 샘플 보내기 회절 속성은 상영, 데이터 세트는 수집 처리 그리고, 구조 솔루션은 실행 가능한-모든 인간의 개입 없이.

Abstract

높은 광택 x 선 광선 자동화와 결합 구조 생물학에서 가장 어려운 프로젝트도 싱크 로트 론 기반 고분자 엑스레이 결정학 (MX) beamlines 사용 하 여 끌고있다. 그러나, 대부분의 시설이 아직도 실험을 수행 하기 위해 사이트에 과학자의 존재를 요구 한다. 완전 자동 특성, 및 데이터 수집, 자동화 된 beamlines의 새로운 세대 생물 고분자의 결정은 최근 개발 되었다. 이러한 beamlines 사용자는 beamline 스스로 제어 하는 것 없이 초기 결정 화 실험 회절 데이터 세트의 큰 숫자의 컬렉션의 결과 화면에 구조상 생물학을 위한 새로운 도구를 나타냅니다. 여기 우리가 자동 심사 및 데이터 수집에 대 한 실험을 설정 하는 방법을 보여줍니다는 beamline에 실험을 수행 하는 방법 결과 데이터 집합 처리 방법, 그리고 어떻게, 가능한 경우, 생물 고분자의 결정 구조는 해결 된다.

Introduction

특정 단백질의 3 차원 구조를 결정 하는 것은 생물학에서 중요 합니다. 일에서 파생 된 정보 그래서 생물학 기능에서 및 모양 및 연구 분자에 포함 된 활성 및 바인딩 사이트의 특이성에 빛이 나. 많은 경우에, 이로써 결정 또는 적절 한 행동의 메커니즘 잠재적인 치료 분자 개발. MX 구조 정보를 얻기 위해 가장 일반적으로 사용 되는 기술 이지만 병목은 잘 diffracting 결정을 얻기 위해 최적 조건의 결정. 따라서, 결정 화 실험 수많은 다른 조건에서 실시 하 고 최고의 결정 회절 데이터 수집을 위해 사용할 수를 찾을 다음 상영. 결정 화 실험¹ 의 설정의 자동화 명확 하 게이 점에서 도움이. 그러나, (즉, 크리스탈 장착, 회절 심사 및 회절 데이터 수집) 이후 단계는 일반적으로 수행 수동으로, 시간, 노력, 및 리소스를 많이 차지. 회절 심사 및 데이터 수집의 자동화, 따라서 뜻 시간과 효율에 엄청난 이득입니다.

MX에서 회절 심사 및 데이터 수집 싱크 로트 론 MX beamlines를 자동화는 크게 용이 하 게이 과정에서 가장 자주 수행 됩니다. 그러나, 대부분의 경우, 그것은 실험 동안에 beamline에 있어야 또는 원격으로 작동 하는 과학자에 필요한. 최근, 완전히 자동화 된 MX beamlines의 새로운 세대의 개발된²되었습니다. 여기, 사용자 수, 육체적으로 또는 원격으로 실험 세션 동안 필요가 없습니다. 밤, 심사 결정 및 회절 데이터 수집 과학자 보다는 지출 전체 일, 그리고 종종 덜 일상적인 작업에 더 많은 시간을 보낼 수 있습니다. 세계 최초의 완전 자동화 된 beamline 대규모 자동화 샘플 선택 통합 시설 (대산괴-1, ID30A-1)^2,3 유럽 싱크 로트 론 방사선 시설 (ESRF)에 이다. 그것은 높은-용량 샘플 포함 dewar beamline의 각도^4,5역할도 로봇 샘플 교환기와 연동에서 운영 하 독특한 샘플 환경. 대산괴-1은 갖춘 단일 광자 계산 하이브리드 픽셀 검출기⁶, 0.969의 고정된 파장에서 작동 하는 undulator beamline Å (12.84 keV) 강렬한 엑스레이 광속 (2 x 10¹² 광자/s)와 함께. 100 µ m x 65 µ m (수직 빔 크기 가로) 최대 10 µ m (라운드 빔)의 최소 사이 샘플 위치에서 빔 크기를 조정할 수 있습니다. 평균,는 beamline 처리할 수 있는, 완전히 자동에 24 시간에 (아래 참조), 120 크리스탈 패션. beamline 작업 워크플로⁷, 각각의 연구 샘플에서 최고의 데이터 측정을 보장 하기 위해 지능형 결정 워크플로에 있는 이전 단계의 결과에 따라 소요의 시리즈를 기반으로 합니다. 특히, 개별 샘플의 회절 특성의 평가 계정 크리스탈 볼륨 및 유출에 걸리고, 크리스탈은 크리스탈만 최고의 지역 후속 데이터에 사용 되는 x 선 빔 보다 더 큰 보장 컬렉션입니다. 회절 데이터 세트, 따라서, 최소화 된 방사선 손상^2,3최대 해상도 최적화 되어 있습니다. 모두 네이티브 및 단일 파장 변칙 회절 (슬픈) 데이터 컬렉션에 대 한 의사 헬리컬 (다중 위치) 데이터 수집 전략 등의 까다로운 데이터 수집 프로토콜 사용할 수⁸있습니다.

대산괴-1에서 완전히 자동 실험 cryocooling를 포함 하 고 척추⁹, 원하는 실험 매개 변수 입력 핀 결정 원하는 beamline 장비 표준에 대 한 적합 한 자석 샘플 마운트에 장착 된 ' 회절 계획 ' 단백질 결정학 beamlines (ISPyB)¹⁰, MX 실험에 대 한 웹 기반 정보 관리 시스템 통합 시스템에서 표 고는 beamline에 샘플을 보내는. ESRF 에서/는 beamline에서 샘플의 수송의 모든 비용 ESRF 사용자 사무소에 의해 지원 됩니다 (자세한 내용은 ESRF¹¹ 의 웹사이트를 참조 하십시오). 대산괴-1, 제한이 루프 크기에 배치 됩니다 또는 크리스탈 품질. 주어진된 크리스탈에 대 한 회절 계획을 선택할 때 사용자 수 중 기본 설정을 사용 하거나 각 샘플에 대 한 사용자 정의할 수 있는 특정 워크플로를 선택 하십시오. 여러 사전 프로그래밍된 워크플로 사용할 수 있습니다. MXPressE³ 워크플로에서 포함 하는 샘플 루프 처음 광 중심을 사용 하 여 샘플 위치에 정렬 됩니다. 그런 다음, X 레이 기반을 중심으로 x 선 빔에 크리스탈의 최고의 지역 중심은 보장 합니다. 데이터 수집 전략 다음 eEDNA, 특히 계정 크리스탈 볼륨과 beamline에 실시간 유량으로 x-선 실험 분야에서 온라인 데이터 분석에 대 한 플러그인 기반 응용 프로그램을 개발 하기 위한 프레임 워크를 사용 하 여 계산 됩니다. 전체 회절 데이터 집합의 컬렉션, 다음이 다음 자동 데이터 처리 파이프라인¹² 의 시리즈를 사용 하 여 처리 하 고 결과 ISPyB에서 검사 및 다운로드에 사용할 수 있는 만들어집니다. MXPressE 슬픈³ 워크플로 대상 단백질의 selenomethionine를 포함 하는 결정을 겨냥 하 고 대산괴-1의 작동 에너지 바로 Se K 가장자리 위에 사실 악용. 슬픈 데이터 수집을 위해 MXPressE eEDNA 데이터 수집 전략 최적화, (즉, 높은 중복, 및 Bijvoet 쌍 사이의 R_병합 이 5% 미만의 설정 해상도). 후속 데이터 수집 없이 결정의 일련의 회절 속성 화면을 MXScore³ 워크플로 결정 분석의 전체 품질 평가 생산 하기 위해 사용할 수 있습니다. MXPressI³ 워크플로에서 180 ° 회전 데이터의 0.2 ° 진동 사용 하 고 시작 피 각도 해상도 eEDNA 전략에 의해 결정을 사용 하 여 수집 됩니다. MXPressO ³ 포함 하는 워크플로로 preobserved 해상도 (기본값: d_분 = 2 Å). 재판 결정에서 발생 하는 결정의 초기 평가 하려면, MXPressM³ 워크플로 제공 합니다. 이 높은 복용량 메쉬 수행 없이 데이터 컬렉션 샘플 지원의 넓은 방향을 통해 스캔 또는 중심. 최근에, 2 개의 새로운 실험 워크플로, MXPressP 및 MXPressP_SAD, pseudohelical 데이터 컬렉션을 수행 하는 구현된⁸되었습니다. 온라인 및 실시간으로 모든 워크플로에서 모든 단계의 실행 지켜질 수 있다 ISPyB 통해 사용자.

여기 우리가 대산괴-1에서 완전 자동화 된 MX 실험을 준비 하는 방법과 검색 실험에서 결과 데이터를 분석 하는 방법을 보여줍니다. 예를 들어, 우리 인간의 미토 콘 드 리아 글리신 분열 체계 단백질 H (GCSH)를 사용합니다. 이 리 포 산이 포함 된 단백질 글리신 분열 체계 글리신의 저하에 대 한 책임의 일부입니다. 이 시스템 더 P 단백질, pyridoxal 인산 염 의존 글리신 decarboxylase, T 단백질, tetrahydrofolate 필요한 효소 및 L 단백질, lipoamide 효소 포함 됩니다. GCSH T 단백질 P 단백질에서 글리신의 methylamine 그룹을 전송합니다. H 단백질에 결함 인간¹³에 nonketotic hyperglycinemia (NKH)의 원인입니다.

Protocol

참고: 생산, 정화, 및 GCSH의 결정 화 보조 파일 1에서 설명 합니다.

1. 간략 한 오프 라인 준비와 크리스탈 장착 설명

1. 위치는 나일론 루프 또는 다른 크리스탈 장착 지원 이미 하나 이상의 결정 아래 척추 핀에 고정 하 고 강수량 솔루션 (단백질 해결책의 0.5 M 나트륨 편대 pH 4.0 + 25 µ L의 20 µ L)에서 그들을 리프트.
   1. 모든 초과 액체를 빨 아 종이 심지와 함께 산으로는 crystal(s) 주위 대량 액체를 제거 합니다.
2. 강 수 솔루션 플러스 30% 글리세롤;를 포함 하는 cryoprotective 솔루션에는 crystal(s)를 담근 다 그런 다음, 크리스탈 지원 및 crystal(s)는 모두 제거 합니다.
   1. 모든 초과 액체를 빨 아 종이 심지와 함께 산으로는 crystal(s) 주위 대량 액체를 제거 합니다.
3. 액체 질소로 채워진 척추 유리병에 마운트를 빠지게 하 고 유사 하 게, 유럽 분자 생물학 실험실 (EMBL)에 준비 하는 다른 결정 함께 저장 / ESRF 샘플 체인저 퍽⁹ 액체 질소 온도에.
   참고:는 crystal(s)는 beamtime 사용할 때까지이 조건에서 안정 되어 있습니다.

2. 요청 대산괴-1 beamtime

1. ESRF 홈페이지 (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying)에 가능한 한 빨리 beamtime를 요청 합니다.
   참고: ESRF MX beamlines 액세스 가능한 모드의 수가 있다. 실험실의 블록 할당 그룹 (가방), 2 년 동안 할당 된 beamtime를 일부로 공동으로 적용할 수 있습니다. 그룹은 개별적으로 적용 하려면, 그들은 피어 검토 후 빠른 액세스는 beamlines 수 있는 액세스를 압 연에 대 한 적용할 수 있습니다. 그룹의 제안은 검토 하 고 추가 정보를 요청할 수 있습니다 ESRF 안전 그룹에 의해 허가 됩니다. 제안을 수락 하는 경우는 실험 번호와 비밀 번호를 전달 됩니다. Beamtime를 구입 하 여 독자적인 연구를 수행할 수 있습니다.
2. 필요한 안전 교육 온라인 (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/SafetyTraining)에 완료.
3. Beamtime 대산괴-1 달력에 예약.
   참고: 교대 당 분석할 샘플 홀더 50 최대 예약 가능 하다.
4. 샘플 측정을 위해 필요한 안전 정보 메일에 실험 (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form) 선언 -양식 입력 합니다.

3. ISPyB에서 회절 계획의 창조

참고: 회절 계획 ISPyB에서 샘플에 필요한 모든 정보를 보유 하 고 각 샘플에 대 한 수행 하는 실험에 맞게 추가 정보를 포함할 수 있습니다.

1. (Https://exi.esrf.fr/)에서 ISPyB를 엽니다.
2. MX 실험를 선택 합니다.
3. 실험 번호와 비밀 번호는 로그인.
4. 선적 을 클릭 | 새로운 추가 하 고 필요한 정보를 제공. 저장을 클릭 합니다.
5. 추가 소포 를 클릭 하 고 요청 된 정보 채웁니다. 저장을 클릭 합니다.
6. 클릭 추가 컨테이너이름으로 퍽 바코드 주고 척추 퍽을 선택. 저장을 클릭 합니다.
7. 편집, 및 컨테이너 기호 클릭 하 고 입력 단백질 이름 처럼 필요한 정보 기본 워크플로, 퍽, 등, 크리스탈 위치는 샘플에 관한.
8. ESRF 안전 그룹에 의해 승인 되었습니다 단백질 (예: GCSH 또는 lysozyme)을 선택 합니다.
9. 각 개별 샘플을 식별 하는 고유한 샘플 이름을 입력 합니다. 그것은 선택적으로 핀 바코드를 스캔 수 있습니다. 나머지 아래의 정보는 선택 사항입니다.
10. 선택적 정보를 입력 합니다.
    1. 각 개별 샘플에 대 한 실험 유형을 입력 (즉, MXPressE_SAD, 점수, 또는 MXPressO, 등등, 기본 MXPressE) exp. 종류에서. 이 정의 자동 워크플로 각 결정을 처리 하는 데 사용 됩니다. GCSH 크리스탈 바늘은 주어진 MXPressP를 선택 합니다.
    2. 알려진 공간 그룹 (예를 들어 P1, C2, 또는 p 2₁2₁2₁)을 입력 합니다. 있는 경우이 데이터 수집 전략 계산 하 고 사용할 수 있는 자동 데이터 처리 파이프라인에 의해 사용 됩니다.
    3. 원하는 해상도 입력 (기본: d_분 = 2.0 Å). 이 초기 메쉬 검사, 특성화 및 기본 데이터 컬렉션에 대 한 크리스탈-검출기 거리를 정의합니다.
    4. 이 제한에 diffract 하지 않는 결정에서 전체 데이터 집합의 컬렉션을 방지 하기 위해 원하는 임계값 해상도 (예: 1.5 Å 또는 2.3Å)을 설정 합니다. 이 데이터 저장 공간 및 분석 시간을 절약할 수 있습니다.
    5. 필요한 완전성을 설정 (기본값: 0.99). 필요한 복합성을 설정 (기본값: 4). 하나 이상의 크리스탈 샘플 지원에 포함 되어, 결정 분석의 최대 수를 설정. 기본 값은 1 또는 MXPressP에 대 한 5.
    6. 적절 한 빔 크기 선택 (기본: 50 µ m). 특정 값을 선택 하지 않은 경우 X 레이 중심 및 데이터 수집 전략 계산 50 µ m의 빔 크기와 함께 수행 됩니다.
       참고: 완전 한 데이터 집합의 모든 후속 컬렉션, 동안 빔 크기 것입니다 적응 시킬 자동으로.
    7. 공간 그룹에 넣어 강제로 공간 그룹 열에 알려진 경우. (1의 기본 값으로 낮은 높은 감도 위한 0.5-2.0) 결정의 방사선 민감도 설정 합니다.
11. 원하는 경우, 전체 데이터 집합 컬렉션에 대 한 수집을 총 회전 각도 설정 (기본값: eEDNA에 의해 결정 하는 총 회전 각도).
12. 값을 저장 합니다. 선적에 반환클릭 하십시오. ESRF 선적 보내기를 누릅니다.
13. 배송 라벨을 인쇄 하 고 샘플을 보내. 사용자는 ESRF 계정 세부 사항을 사용 하 여, 택배와 함께 픽업을 정렬 해야 합니다.
    참고: 샘플 (https://www.esrf.eu/MXDewarReimbursement 참조)의 원활한 복귀를 허용 하도록 포함 반환 레이블 선택 매우 중요 하다.

4. 데이터 수집, 보기 및 검색

참고: 실험 당일, 샘플은 대산괴-1 높은 용량 Dewar (HCD)에 전송 됩니다. Beamline 과학자는 다음 사용자가 원격으로 지켜질 수 있다 데이터 수집을 시작 합니다. 각 다른 샘플 형식에 대 한 사용자 데이터 수집을 시작 했다 그들을 알리는 전자 메일을 받습니다. 이전 지적, 온라인 및 실시간으로 모든 워크플로에서 모든 단계의 실행을 따라 할 수 있는 사용자 를 통해 ISPyB에서 결과 수 있습니다 볼 수 및 다운로드 하 여.

1. 분석 하는 각 샘플에 대 한 ISPyB (https://exi.esrf.fr/)에 자동 실험의 결과 검사 합니다.
   1. 실험 번호 및 암호를 사용 하 여 로그인 하 고 ID30A-1에서 원하는 실험 세션 클릭 하십시오.
   2. 기본 설정된 (최고 점수) autoprocessing 파이프라인 (수류탄 또는 XDS_APP 등)을 선택 하 고 마지막 수집 결과 클릭 하 여 가장 높은 완성도 높은 해상도와 정확한 공간 그룹에 밖으로 기록 되는 데이터를 다운로드 하 고, 그런 다음, 다운로드.
      참고: 모든 메쉬, 선 및 특성화 이미지 /MXPressE_01 라고 하는 각 샘플에 대 한 하위 디렉터리에 있습니다. ESRF는 자동으로 즉 EDNA_proc¹², 수류탄¹², XDS_APP¹⁴, autoPROC¹⁵및 XIA2¹⁶, 5 별도 처리 패키지를 실행합니다. 데이터 통합 XDS, 다이얼에 근거 하는 XIA2 예외를 기반으로 합니다. 모든 패키지 또한 슬픈 단계적 프로토콜에에서 사용 되는 데이터에 있는 경우는 비정상적인 신호를 자동으로 감지를 허용 하는 변칙 및 nonanomalous 모드로 실행 됩니다. 각 패키지는 다른 매개 변수 및 의미를 일부 패키지 실행 특정 예제와 함께 더 나은 의사 결정 트리를 사용 합니다. 그러나,이 결과의 많은 수에 대 한 패키지 및 가능한 공간 그룹의 수가 차지 하는 경우 만들 수 있습니다. 결과, 따라서, 대략 해상도 최저 해상도 껍질, CC(1/2), 그리고 완전성에 R_병합 같은 다른 품질 통계에 따라 평가 됩니다. 이것은 최고의 데이터 집합, 사용자 안내 겨냥 하지만 모든 가능한 공간 그룹 및 결과 신중 하 게 검사 해야 합니다.
2. 모든 로그 파일 및 병합 되지 않은 XDS_ASCII 포함 됩니다 다운로드 폴더를 압축을 풉니다. HKL 고 병합 하며, 크기.mtz 파일입니다.
   참고: 경우 관심 또는 가까운 체의 단백질의 PDB 형식의 구조 실험의 시작에 ISPyB에 업로드 된, autoprocessing 파이프라인 ESRF에 자동으로 수행 합니다 분자 교체 (MR)으로이 구조를 사용 하 여 실행 합니다 검색 모델 솔루션을 득점 하는 최고에. 미스터 파이프라인의 결과 ISPyB에 표시 되 고 처리 된 데이터 폴더 (예를 들어 /data/visitor/mx2112/id30a1/20180711/PROCESSED_DATA/GCSH/GCSH-x5/autoprocessing_GCSH-x5_run1_1/grenades_fastproc/user_nohet.pdb_에서에서 찾을 수 있습니다. mrpipe_dir /). 여기, 최종 모델 coot1.pdb 및 반사 데이터 sidechains.mtz 라는 것입니다. Note는 파이프라인 해결책을 찾아내기의 가능성을 증가 하기 위하여 세포 (원시 세포 감소)의 대칭을 줄일 수 있습니다. 여기의 경우, 미스터 파이프라인 솔루션 orthorhombic 셀 (C222₁) 보다는 오히려 단사 셀 (C2)에 썼다. 분자 대체를 수행 하는 방법에 수동으로 실행 (두 번째 최고 득점 autoprocessing 솔루션 exemplified) 보충 파일에 포함 되어 있습니다.

Results

MXPressP 워크플로 완전히 자동으로 마운트, x-선 빔에서 센터, 특성, 및 인간 GCSH의 결정의 시리즈에서 전체 회절 데이터 집합을 수집 ESRF beamline 대산괴-1에서 사용 되었다. 샘플 장착 했다 고 루프 (그림 1, 왼쪽)를 검색 하는 영역에 대 한 분석. 회절 분석 후 4 포인트 데이터 수집 (그림 1, 오른쪽) 크리스탈 내에서 선정 됐다. 이후 미스터 솔루션을 발견에 대 한 높은-품질 데이터 집합 (표 1)를 나왔고 미스터 파이프라인을 포함 하 여 자동화 된 데이터 분석 파이프라인에 의해 처리. 후자는 빠르게 획득된 데이터 집합 및 사용된 검색 모델 분자 교체에 의해 단계적으로 적합 한지 여부를 평가 하는 사용자 수 있습니다. 또한, ligands의 존재 수 판단, 따라서 추가 분석에 대 한 가장 유망한 데이터 집합에만 초점을 사용자 허용. 씨에 의해 수동 구조 결정 후 단일 자동 수정 주기 (그림 2a) 높은-품질 전자 밀도 지도를 얻지 못했다. 이 데이터 집합에 대 한 자동화 된 파이프라인 가공 데이터는 1.32 Å 해결책; 그러나, 사용자가 여전히 높은 해상도 셸에서 다른 품질 통계 (CC_1/2, < I/σ(I) > R_meas)에 도착 하는 더 낮은 해상도에서 데이터를 잘라 결정할 수 있습니다. 인간 GCSH 구조체의 결정 구조는 소 단백질 (3KlR)¹⁶의 비슷합니다.

지속적인 전자 밀도 N 맨끝 히스티딘 태그를 제외 하 고 전체 아미노산 체인에 대 한 표시 됩니다. 인간과 소 GCSH를 구별 하는 4 개의 대체의 3 개는 쉽게 식별 전자 밀도 (일/Val66, Asp/Glu98, 그리고 레이/Phe149; 그림 2b -d)입니다. 이것은 Asp/Lys125 대체는 사이드 체인의 전자 밀도 유연성 (그림 1e)으로 인해 부분적 으로만 해결 한다 보다 적게 명확 하다. 현재 획득된 모델 R_작업 및 R_무료 값 20.4%와 23.8%, 각각, 있으며 더 사이클의 자동 및 수동 모델 구축 및 수정 하 여 더 최적화할 수 있습니다.

	수류탄 파이프라인	XDS_APP 파이프라인
데이터 수집 및 처리
소스를 x-선 빔 라인 /	ESRF / 대산괴-1
파장 (Å)	0.966
해상도 (Å)	41.88-1.48 (1.53-1.48)	41.86-1.32 (1.39-1.32)
총/고유 반사	127670 / 28644	177332 40134 /
	(12178 / 2775)	(23772 / 5714)
인덱싱, 스케일링 및 병합을 위해 공간 그룹	C222	C2221
셀 크기
a, b의 c (Å)	42.20, 83.75 95.85	42.19 83.72, 95,82
Mosaicity	0.05	0.05
Rmeas (%)	10.0 (110.7)	11.1 (198.2)
< I/σ(I) >	9.6 (1.3)	7.6 (0.7)
참조1/2 (%)	99.7 (53.9)	99.7 (19.1)
완성도 (%)	99.6 (99.6)	99.5 (98.6)
다중성	4.5 (4.4)	4.4 (4.2)
분자 교체 및 예비 모델 구체화
단계적으로 조정 공간 그룹	C2	C2221
셀 크기
a, b의 c (Å)	83.74, 42.18 95.82	42.19 83.72, 95,82
Α, Β, Γ (°)	90, 90.03, 90	90, 90, 90
검색 모델 씨 (PDB)에 대 한	3KLR	3KLR
단백질 분자 / 애리조나 주립대	2	1
단백질 잔류물	250	125
R작업/R무료 (%) 1 수정 후	24.3 26.5 /	20.4 / 23.8
1 수정 후 RMSD 본드 길이 (Å)	0.01	0.01
1 수정 후 RMSD 본드 각도 (°)	1.2	1.83
Rotamer 국외 자 (%) 1 수정 후	1.07	4.29
야 Ramachandran 선호/허용/허용 되지 않습니다 (%) 1 수정 후	95.93 4.07 / / 0	95.12 4.88 / / 0

표 1: x 선 회절 데이터 수집, 수정, 및 유효성 검사 통계. 높은 해상도 쉘에 대 한 값은 괄호에 부여 됩니다.

그림 1: 샘플 분석 데이터 수집 전에. (A) 빨간 상자에 의해 표시 됩니다 검색을 위해 선택한 지역. (B) 회절 이미지의 분석 지도 열으로 표시 됩니다. 위치 결정 내에서 4 개의 위치는 데이터 수집을 위해 선정 됐다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 수정 후 얻은 전자 밀도 지도의 시각적 확인. 전자 밀도 지도 (인간의 GCSH에 Asp) r.m.s. 수준 (는) Trp143, (b) Val66 주위에 인간 GCSH (일), 및 (c) Glu98 x 2 및 지도에 contoured contoured r.m.s 수준 (d) Phe149의 주위 (에 인간 GCSH 레 우) 및 (e) x 1 Lys125 (인간 GCSH에 Asp). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

완전 자동 beamlines 요구 되는 beamline에 또는 원격으로 과학자의 존재 없이 고분자 결정의 큰 숫자에서 자동화 된 특성화 및 데이터 컬렉션을 제공 합니다. 완전히 자동화 된 beamlines를 사용 하 여 수동 작업에 비해 많은 이점이 있다. X 선 메시를 기반으로 하는 예를 중심으로, 자동된 샘플 및 라인 스캔, 수행으로 인간의 눈으로 보다 더 정확한 그것은 영향을 받지 열 또는 광학 효과. 실제로,이 메쉬 및 라인 스캔 제공 데이터 수집에 사용할 올바른 빔 크기를 결정 중요 한 추가 데이터 (즉, 크리스탈과 크리스탈의 지역 diffracting 최고의 자세한 치수)-작은 결정을 위해 특히 ¹⁸-고 얻은 회절 데이터의 품질 향상된에 자주 발생. 또한, 활용 함으로써 사용자 정의 매개 변수 자동 실험의 설치에서 특정 워크플로 단계 가장 연구, 따라서 실험 성공률을 더 최적화 시스템에 맞게 맞출 수 있습니다.

함께 복용 beamline (사용자가 자체 일정, 캘린더 [위 참조]를 사용 하 여), 그리고 대산괴-1의 완전 자동화 된 접근에 대 한 간단한 액세스 제공 엄격한, 사용할 수 있는 워크플로의 신뢰성 높은 처리량 및 시간 절약 클래식 체험 MX 실험 및 가능성이 더 고급 절차 및 자동 워크플로로 응용 프로그램을 구현 하는 대안. 가까운 장래에, 3D¹⁹ 지도 제작 크리스탈 x 선 중심, 크리스탈 탈수 실험²⁰와 같은 더 복잡 한 프로토콜을 자동화할 것입니다 하는 동안의 정확도 개선 하기 위해 구현 됩니다. 그것은 완전 자율 데이터 수집 MX, 작은 분자 조각 스크린에 대 한 높은-품질 데이터를 제공 최적화 제대로 결정 diffracting 자동으로 단계를 제공 하 고 다 수의 심사에서에서 표준 방법 될 것 기대 크리스탈 구조 드 노 보를 해결 하기 위해 정보입니다. 함께 결정²¹의 자동된 수확에서 개발, 자동화 된 서비스로 단백질 결정 구조 솔루션의 가능성 잘 현실을 될 수 있습니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beamline MASSIF-1	ESRF
BL21DE3	New England Biolabs	C2527I
chloramphenicol	Roth	3886.1
농축기: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K	Merck Millipore	UFC803024
투석막	Spectrumlabs	132655
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Dnase	Roche	11284932001
DTT	Euromedex	EU0006-B
EDTA- 무료 프로테아제 억제제	Roche	4,693,159,001
글리세롤	VWR 화학 물질 Prolabo	14388.29T
His-trap HP	GE 헬스케어	17-5247-01
이미다졸	시그마-알드리치	56750-500G
IPTG,	Euromedex	EU0008-B
LB 매체	시그마-알드리치	L3022
리포산	, 시그마-알드리치	T5625
루프	, 햄튼 리서치	HR8-124
라이소자임	로슈	10, 837, 059, 001
MonoQ, 5/50, GL	GE, 헬스케어	17-5166-01
NaCl	Fisher Chemical	S/3160/60
Sonicator vibra cell 75/15	SONICS
SPINE pucks	MiTeGen	SKU: M-CSM003-0001A
Tris base	Euromedex	26-128-3094-B
포름산나트륨	Sigma-Aldrich	1064430500
GCSH 정제 버퍼	20 mM TRIS pH 8, 200 mM NaCl
GCSH 극저온 보호 버퍼	0.25 M 포름산나트륨 pH 4, 30% 글리세롤
<강>프로그램:
MxCube		Gabadinho, J. et al. MxCuBE : 고분자 결정학 실험을 위해 맞춤화된 싱크로트론 빔라인 제어 환경. 싱크로트론 방사선 저널(Journal of Synchrotron Radiation). 17 (5), 700-707, DOI: 10.1107/S0909049510020005 (2010)	로컬 개발
ISPyB	ESRF	Solange Delageniè re, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, Sté 파니 베이리어, 조스&이큐트; 가바디뉴, 엘스페스 J. 고든, 사무엘 D. 존스, 칼 에릭 레빅, 세아큐트; n M. 맥스위니, Sté 파니 모나코, 맥스 나나오, 대런 스프루스, 올로프 스벤손, 마틴 A. 월시, 고든 A. 레너드; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 2011년 11월 15일, Pages 3186-3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535	local development
MXCube2	ESRF	Gabadinho, J. et al. MxCuBE : 고분자 결정학 실험을 위해 맞춤화된 싱크로트론 빔라인 제어 환경. Journal of Synchrotron(싱크로트론 저널) 방사선 < / em>. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone, Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24-226 (2014).	지역 개발
BES 워크플로우 서버		Brockhauser, S. et al. 고분자 결정학에서 복잡한 실험의 설계 및 구현에 워크플로우 사용. Acta Crystallographica 섹션 D 생물학적 결정학. 68 (8), 975-984, DOI: 10.1107/S090744491201863X (2012).
DOZOR	ESRF	Bourenkov 및 Popov, 미공개	로컬 개발
BLISS 빔라인 제어		Guijarro, M. et al. BLISS - ESRF EBS 빔라인에 대한 실험 제어. Proceedings of the 16th Int. Conf. on Accelerator and Large Experimental Control Systems, ICALEPCS2017, 바르셀로나, 스페인. 도이: 10.18429/jacow-icalepcs2017-webpl05 (2018).	지역 개발
이미지의		Monaco, S. et al. ESRF에서 고분자 결정학 X 선 회절 데이터의 자동 처리. 응용 결정학 저널(Journal of Applied Crystallography). 46 (3), 804-810, doi: 10.1107/S0021889813006195 (2013)	local development
BEST and EDNA		Incardona, M.-F., Bourenkov, G.P., Levik, K., Pieritz, R.A., Popov, A.N., Svensson, O. EDNA : X-ray 실험 온라인 데이터 분석에 적용되는 플러그인 기반 애플리케이션용 프레임워크. 싱크로트론 방사선 저널(Journal of Synchrotron Radiation). 16 (6), 872-879, doi: 10.1107/S0909049509036681 (2009).	지역 개발
CCP4		Winn, M.D. et al. CCP 4 제품군 개요 및 현재 개발. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 235-242, doi: 10.1107/S0907444910045749 (2011).
Phaser MR		McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Winn, M.D., Storoni, L.C., Read, R.J. Phaser 결정학 소프트웨어.Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674, doi: 10.1107/S0021889807021206 (2007).
Coot		Emsley, P., Cowtan, K. Coot: 분자 그래픽을 위한 모델 구축 도구.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2126-32 (2004).
refmac5		Murshudov, G.N., Vagin, A.A., Dodson, E.J. 최대 가능성 방법에 의한 고분자 구조의 정제.Acta Crystallographica 섹션 D. 53, 240--255 (1997).
Matthews		Matthews, B.W. 단백질 결정의 용매 함량. 분자 생물학 저널. 33 (2), 491-497 (1968).