경도 형광 현미경 검사 법을 통해 신경 생존 모니터링

요약

여기, 선물이 단일 셀 기준 생존을 모니터링 하 고 크게 세포 죽음을 예측 하는 변수를 식별 하는 프로토콜.

초록

표준 세포 독성 분석 실험, 여러 시간 점에서 고정된 세포 lysates의 필요, 감도 및 신경 운명에 영향을 주는 요소를 평가 하는 능력을 제한 했다. 이 분석 실험 개별 시간 포인트에서 세포의 별도 인구의 관찰을 해야합니다. 그 결과, 개별 셀 지켜질 수 없다 prospectively subcellular 이벤트, puncta 형성 등 단백질 mislocalization, 질병, 병원 성 드라이버 homeostatic 응답 인지를 구별할 수 있는 능력을 가혹 하 게 제한 하는 시간이 지남에 또는 단순히 우연 현상입니다. 단일 셀 경도 현미경 연구원 인구 사이 생존에 차이 확인 하 여 향상 된 감도와 인과 관계를 그릴 수 있도록 이러한 한계를 극복 한다. 이 비디오 가이드는 형광 단백질 마커를 표현 하는 쥐 주 대뇌 피 질의 뉴런의 단일 세포 생존을 측정 하는 실험에 대 한 대표적인 워크플로 개요 것입니다. 뷰어는 transfections 높은 효율을 달성, 수집 및 개별 셀의 예비 추적을 사용 하면 이미지를 처리 하는 방법을 배울 것 이다 고 신경 인구 콕스 비례 위험 분석을 사용 하 여의 상대 생존 됩니다.

서론

비정상적인 세포 죽음은 암, 뇌졸중¹, neurodegeneration, 등 많은 질병에 영향을 미치는. 세포 죽음에 대 한 강력 하 고 중요 한 분석 확장 하거나 세포 생존을 감소 시키기 위한 치료 전략의 개발으로 서 이러한 장애의 특성에 필수적입니다. 현재 직접 또는 대리 마커²세포 죽음을 측정 하기 위한 기법의 수십 있습니다. 예를 들어 세포 죽음 평가 될 수 있다 시각적으로 또는 특정 인지질 원형질 막^{4,5,6의 모습을 모니터링 하 여 중요 한 염료를 선택적으로 죽 었 거 나 살아있는 세포3, 얼룩의 도움으로} . 측정 세포내 구성 요소 또는 셀룰러 산시 미디어로 출시 세포 대사 산물의 세포 죽음^7,8에 대 한 프록시 사용할 수 있습니다. 또는, 세포 생존 수 수 직선 근사 줄 대사 활동^9,10를 평가 하 여. 비록 이러한 방법을 세포 생존 평가의 빠른 수단을 제공, 그들은 경고 없이 되지 않습니다. 각 기술은 단일 인구, 개별 셀 및 생존의 그들의 독특한 속도 사이의 구별을 불가능 렌더링으로 문화를 관찰 합니다. 또한, 이러한 인구 기반 분석 실험 세포 형태학, 단백질 표정, 또는 지역화를 포함 하 여 세포의 죽음에 대 한 중요 한 될 수 있는 요소를 측정할 수 없습니다. 대부분의 경우에서 이러한 분석 개별 시간 포인트 제한 되며 시간이 지남에 셀의 연속 관측에 대 한 허용 하지 않습니다.

대조적으로, 경도 형광 현미경 검사 법은 직접 그리고 지속적으로 단일 셀 기준¹¹에 죽음의 위험을 모니터링 하는 매우 유연한 방법입니다. 간단히, 경도 형광 현미경 세포 죽음 및 강화 하거나 세포 죽음 억제 하는 요인의 정확한 결심을 허용 하는 시간의 연장된 기간에 대 한 정기적 추적을 개별 셀의 수천 수 있습니다. 그것의 기초에는 방법은 형광 단백질을 인코딩 벡터와 과도 transfection 또는 셀의 변환 포함 한다. 고유한 신탁 설립 다음 하며이 랜드마크에 관하여 각 transfected 세포의 위치 이미지를 시간, 일, 또는 주에 걸쳐 개별 셀을 추적 하는 사용자 보면 이러한 이미지는 순차적으로, 형광, 형태학, 및 각 셀에 대 한 죽음의 시간 할당을 사용 하면 세포 체의 분열에서 세포 죽음 특성 변화에 의해 표시 됩니다. 죽음, 위험 함수에 의해 결정의 계산된 속도 수 있습니다 다음 양적 조건 사이의 비교 또는 일변량 또는 복수 콕스 비례 위험 분석¹²를 사용 하 여 셀룰러 특징 선택 관련. 함께, 이러한 접근 세포 인구 가운데 세포 죽음의 비율 그리고 크게 세포 죽음 및 생존 (그림 1)를 예측 하는 변수 식별의 정확 하 고 객관적인 차별 가능

이 메서드는 형식 도금의 다양 한 모든 포스트 mitotic 세포 종류에 생존을 모니터링 하는 데 사용할 수 있습니다, 하지만이 프로토콜 transfecting 및 쥐 대뇌 피 질의 뉴런 96 잘 접시에 배양 이미징에 대 한 조건을 설명 합니다.

프로토콜

모든 척추 동물 작업 사용 및 미시간 대학 (프로토콜 # PRO00007096)에서 관리 동물에 위원회에 의해 승인 되었다. 실험 동물 희생의 수를 최소화 하기 위해 신중 하 게 계획 된다. 임신 여성 야생-타입 (WT), 유전자 변형 비 긴 에반스 쥐 (Rattus norvegicus)는 실 환경 풍부 및에 단위에 대 한 실험 동물 의학 (ULAM) 미시간 대학에 의해를 걱정에서 홀로 지 내게 따라 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 게 NIH 지원 가이드 모든 쥐 안락사, 안락사의 미국 수의 의학 협회 그리고 미시간 대학에 대 한 지침의 권고와 일치 하기 전에 가능한 짧은 시간에 의해 안락사의 방법 하우징 루틴에 보관 했다 종 지침입니다.

1. 재료 준비

1. 19-20 쥐 새끼와 문화^{13,14, 이전에 설명 된 대로 x 106 셀 4 일에서 생체 외에서폴 리-D-리 코팅된 판에 밀리 리터 당 0.5에서 대뇌 피 질의 뉴런 쥐 배아 일에서 대뇌 피 질의 신경 해 부 15,,1617,,1819}.
2. 내 무료 플라스 미드 DNA 분리 하 여 설명 하는 단계에 따라 관심의 DNA 플라스 미드 준비 키트 ( 재료의 표참조). 분 광 광도 계를 사용 하 여 결과 DNA 계량.
3. 생체 외에서 날 4 (DIV4), aliquot, 필터, 소독 하 고 37 ° c: 6 mL에 다음 미디어를 품 어 감소 (RSM; 예를 들어., OptiMEM), 혈 청 미디어 25 mL 신경 기저 미디어 (NBM) 40 mL NBKY (NBM + 1 mM kynurenic 산 + 10 m m MgCl₂, 7의 pH를 조정 합니다. 4) 10 mL NBC (NBM + 1 x 신경 세포 문화 보충 + L-글루타민 보충 x 1 + 1 x 펜 Strep).
   참고: 나열 된 볼륨은 transfecting 한 96 잘 접시에 대 한 충분 한. 특정 약에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.

2입니다. 쥐 대뇌 피 질의 신경 세포의 transfection

1. 제공 된 예제 transfection 시트 수정 ( 추가 파일 1참조) 판형, 플레이트 지도, DNAs, 수를 조정 하 여 DNA 농도 및 우물 (녹색 상자)의 수.
   참고: 여부 한 총 DNA의 관계 없이 잘, 당 0.2 µ g을 요약 (예:., DNA A) 이상의 (예를 들어, DNA B와 C) DNA 구조 추가 됩니다 각 잘 하.
2. 스프레드시트에서 작업 한 튜브에 RSM 및 DNA의 적절 한 금액을 결합 합니다. RSM 및 transfection 시 약 (예, Lipofectamine)는 별도 관에서의 적절 한 금액을 결합 합니다.
3. 5 분 동안 실 온 (RT)에서 품 어.
4. DNA와 transfection 시 RSM 혼합물을 결합 하 고 20 분 동안 RT에서 품 어.
5. 멀티 채널 피 펫 사용이 인큐베이션 단계 및 세척 살 균 플라스틱 골짜기 셀 NBM의 당 100 µ L 2 x. 바른된 미디어 (CM)를 예약 하 고 37 ° c.에 저장 이 다음 단계에 대 한 뉴런 공기에 노출 되는 시간을 최소화 하기 위해 주의.
6. NBM 미디어를 제거 하 고 NBKY의 당 100 µ L를 바꿉니다.
7. 20 분 후에 각 잘 transfection 시 약/DNA 혼합물의 50 µ L dropwise 추가 합니다.
8. Transfection 시 약/DNA 단지 37 ° c.에 20 분에 대 한 셀을 품 어
9. NBKY 2 x 린스와 CM의 100 µ L와 잘 당 NBC의 100 µ L를 바꿉니다.
10. 성공적으로 transfected 세포 transfection의 16-24 h 안에 형광 현미경 검사 법에 의해 표시 되어야 합니다. 효율성을 측정 하기 위해를 사용 하 여 형광 현미경 transfection 37 ° c.에 하룻밤 부 화 후
    참고: 이 기술은 5 ~ 10%의 전반적인 transfection 효율 발생합니다.

3입니다. 영상

1. 자동화 한 무대, 형광 현미경에 접시를 놓고 접시 몇 군데는 각 시간에 맞게 사용자 수 있도록 수 탁자 (예: 접시의 하단에 표시)을 설정 합니다. 이 참조에 대 한 수 탁자의 이미지를 저장 합니다.
2. 이동의 관심 분야 하 고는 탁자에 상대적인 x y 좌표를 참고.
3. 형광 라벨 표현 transfected 세포에 초점.
4. 수동으로 또는 자동화 된 방식으로 적절 한 채널 또는 채널 (예: 빨간색 형광 단백질 [RFP] 녹색 형광 단백질 [GFP], 4, 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), 형광 이미지를 가져가 라. 정기적으로 간격으로 여러 개의 이미지를 복용 하 여 우물의 몽타주 이미지 처리 하는 동안 조립 될 수 있다 (4 단계 참조).
   참고: 간격 확대, 광학 현미경, 및 감지기 크기 등 여러 가지 요인에 따라 달라 집니다. 일반적으로, 인접 한 이미지의 광학 간격 작은 정도의 이미지 중복 허용 및 정렬 기능을 각 개별 이미지의 크기의 90-95% 사이 여야 합니다.
5. 이 프로세스는 필요한, 원래 수 탁자에 정렬 자주 때마다 반복 합니다. 생존 분석, 이미징 일어난다 셀 종류와 실험의 목적에 따라 모든 6-24 h.

4. 이미지 처리

참고: 이미지 수집, 다음 단계 처리의 시리즈는 이미지 분석 전 필요한. 이 포함 되지만, 바느질, 스택 및 배경 빼기 (그림 1)에 국한 되지 않습니다. 이 단계의 목표 이미지 스택, 또는 시계열, 셀 하 명확 하 게 그들의 배경에서 인지할 수 하 고 여러 시간 점에 따라 하기 쉬운입니다. 전용된 피지 매크로 (Image_Processing.ijm, 보충 파일 2참조), 기본 바느질, 스태킹, 수행 및 배경 빼기. 이미지 처리를 수행할 때 고려해 야 할 매개 변수 및 각 단계에 대 한 설명은 토론 섹션에서 제공 됩니다.

1. 그림 2에 표시 된 형식에 맞게 입력된 디렉터리 또는 원시 데이터를 조정 합니다.
2. 시간 포인트는 연속 하는 경우 (즉, T1, T2, T3), 이름을이 폴더를. 이 단계는 Image_Processing 매크로 충돌 하지 않습니다 보장 하기 위해 중요 한 누적 하는 동안.
3. 프로그램을 열고 다음 클릭 하 고 피지 바 Image_Processing 매크로 끌어 피지 아이콘 두 번 누릅니다. 이 피지 내에서 매크로 열 것 이다.
4. 2-7 개의 이미지, 봉합 및 스택 이미지에 대 한 원하는 출력 디렉터리, 이미징 timepoints의 수, 형광 채널 및 플레이트 형식 수를 포함 하는 입력된 디렉터리를 지정 하려면 Image_Processing 매크로 조정 합니다.
5. 이미지 인수 했다 순서를 결정 합니다. 이 테스트 하려면 수동으로 플러그인 드롭다운 메뉴 | 를 기동 하 여 피지에 이미지의 몽타주를 스티치 바느질 | 그리드/컬렉션 바느질. 정확 하 게 맞춘된 이미지 생성 됩니다 때까지 드롭다운 메뉴 유형 및 순서 내에서 설정을 조정 합니다.
6. 8, 9이이 선택에 맞게 Image_Processing 매크로의 라인에서 GRID_TYPE 및 STITCH_ORDER 변수를 조정 합니다.
7. Image_Processing 매크로에 선 10을 조정 하 여 잘 당 이미지 수를 지정 합니다.
   참고: 이미지의 2 x 2 몽타주에 대 한이 줄 DIM 읽을 것 = 2.
8. 배경 빼기 필요한 경우 조정 BGSUB Image_Processing 매크로에 선 14 = true.
9. Image_Processing 매크로에 선 15를 조정 하 여 롤링 볼 반지름을 설정 합니다.
   참고: 최적의 결과 얻으려면, 적어도로 반지름 설정 이미지에서 가장 큰 전경 개체의 직경.
10. Image_Processing 매크로 시작 하려면 실행 을 클릭 합니다. 일단 시작 하 고, Image_Processing 자동으로 바느질, 스택 및 배경 빼기를 통해 사전 것입니다.

5. 점수 세포 죽음

참고: 득점 세포 죽음 및 검열 데이터에 대 한 자세한 토론 섹션 참조.

1. Image_Processing 스크립트에 의해 생성 하는 이미지 스택을 찾습니다. 피지에서 엽니다.
2. 개별적으로 각 셀 번호와 분류 하는 도구를 가리킨 피지 내를 사용 합니다. T 를 누르면 각 포인트 ROI (지역 관심) 관리자에 셀 식별자를 추가 합니다.
   참고: 식별자는 ROI 관리자에서 레이블 및 모두 표시 확인란을 클릭 하 여 구상 될 수 있다.
3. 각 이미지 스택과 기록 timepoint 각 세포 사망 또는 파일 Survival_spreadsheet.csv (보조 파일 3 참조)에서 검열을 요구 하는 경우에 timepoints 통해 진행.
   1. 각 셀 스프레드시트, 잘 대응을 잘 내 투자 수익 번호 각 셀에 대 한 고유 식별자 (ID)로 구성 되어 단일 행을 차지 합니다. tp_death 셀 살아있을, time_death 시간에 죽음의 실제 시간을 나타냅니다 동안 관찰은 마지막 시간입니다. 각 셀에 대 한 이러한 데이터를 입력 합니다. 그것은 생존을 사용 하 여 후속 분석을 위해이 구조를 유지 하기 위해 중요 한입니다. R ( 보조 파일 4참조).
      참고: 세포 죽음을 결정 하기 위한 기준을 중요 한와 셀 유형에 따라 다를 수 있습니다. 세 가지 주요 기준 죽은 신경^11,20 (그림 3)의 식별에 사용 됩니다: 형광 강도 (예: 신경 1 69 h)의 손실의 셀 (예: 신경 2 188 h), 몸과 neurite의 손실 무결성 또는 blebbing (예: 신경 2 188 h).
4. 마지막 열에 있는 셀의 검열 상태를 기록 합니다.
   참고: 여기에, 독특한 방법에의 한 검열은 처리 R에 의해 검열 된 셀에 의해 표시 된다 0, 무수정된 셀 1에 의해 표시 되는 동안. Note는 마지막 시간 포인트 사는 모든 셀 검열, 고 따라서 0로 표시.

6. 수행 콕스 비례 위험 분석 및 시각화 결과

1. 필요한 경우, https://cran.r-project.org/mirrors.html에서 R 스튜디오를 다운로드 합니다.
2. 연구 스튜디오를 열고 생존에 대 한 아이콘을 두 번 클릭 합니다. R 스크립트.
3. 생존의 2 줄에 커서를 놓습니다. R 생존 라이브러리를 로드 하려면 주요 R 스튜디오 창에서 실행 버튼을 클릭 합니다.
4. 생존의 5 줄을 변경 합니다. R 스크립트 파일의 위치를 일치 하도록 Survival_spreadsheet.csv. dataframe로 생존 데이터 로드를 실행 을 클릭 하십시오.
5. 8-9 라인을 강조 하 고 콕스 비례 위험 분석을 수행 하기 위해 R 스튜디오 콘솔 창에서 실행 버튼을 클릭 합니다. 결과 및 출력 통계 R 스튜디오의 콘솔 창에 나타납니다.
6. 12-16 생존의 라인을 강조 표시 합니다. R R 스튜디오에서 플롯 탭에 표시 됩니다 죽음 플롯의 누적 위험을 생성 하기 위해 실행 버튼을 누르십시오. 작 위에 있는 내보내기 단추를 클릭 하 여이 파일을 저장할 수 있습니다.
7. 카 플 란-마이어 곡선으로 생존 데이터를 플롯 하는 것이 바람직합니다, 19-24 생존의 라인을 강조 표시 합니다. R 실행 버튼을 누르십시오.

결과

여기 설명 된 transfection 절차를 사용 하 여, DIV4 쥐 대뇌 피 질의 뉴런 형광 단백질 mApple 인코딩 플라스 미드와 페 했다. 시작 24 시간 후 transfection, 세포 했다 몇 군데 형광 현미경 검사 법 모든 24 h에 의해 10 일 연속. 결과 이미지 다음 그림 2에 표시 된 대로 구성 했다 물 렸 다, 스택, 및 세포 죽음 (그림 1)에 대 한 득점. 그림 3 은 시간 코스 3 대표 뉴런에 대 한 세 번째 동안 실험 (신경 1과 2)의 과정을 다이의 두 통과 (신경 3).

생존 데이터 (생존 제공 하는 R 스크립트를 사용 하 여 분석 했다. R), 그리고 ...

토론

여기, 직접 단일 셀 기준 신경 생존을 모니터링 하는 방법론을 제시 합니다. 이 방법은 다양 한 세포 형태학, 단백질 표정, 지역화 등 요인의 지속적인 평가 대 한 수 있는 전통적인 분석 실험 세포 죽음에 대 한 개별 시간 포인트 및 셀의 전체 인구는, 달리 고 어떻게 각 요소 잠재 방식으로 세포 생존에 영향을 확인할 수 있습니다.

이 방법론은 다양 한 실험적인 요구에 맞게 수정할 수 있습니다. 주파수 및 이미징의 기간 쉽게 조정 될 수 있다, 그리고 관심의 모든 단백질 단백질 기능^{13,,1415, 조사 하거나 질병 상태를 형광 표시와 함께 공동 transfected 수 16,17...}

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Neurobasal 매체	GIBCO	21103-049
Opti-MEM	GIBCO	31985-070
CompactPrep 플라스미드 맥시 키트	Qiagen	12863
염화마그네슘 육수화물	시그마	M9272
Kynurenic Acid Hydrate	TCI	H0303
폴리 D-Lysine	Millipore	A-003-E
Glutamax	GIBCO	35050-061
Lipofectamine 2000	Invitrogen	52887
B27 보충제	Thermo Fisher	A3582801
Penicillin/Streptomycin	GIBCO	15140122
96 웰 플레이트	TPP	0876