자동된 라이브 셀 이미징 사용 하 여 간단한 마이그레이션/침공 워크플로

요약

현재 프로토콜 암 세포 마이그레이션 및 실시간으로 단일 플랫폼에서 침입을 조사 하 고, 세포 이동성 및 형태학 연구를 쉽게 재현할 수 및 시간 효율적인 옵션을 제공 하는 통합된 방법을 설명 합니다.

초록

암 세포 이동성은 전이의 개시에 대 한 중요 합니다. 따라서, 셀 이동 및 침략 적 능력의 큰 의미입니다. 마이그레이션 분석 침공 분석 실험은 더 순수 관련, 원래 사이트에서 vivo에서 암 세포 dislodgment를 흉내 낸 고 세포 외 매트릭스를 통해 침입 하는 반면 2D 수준에서 셀 이동의 기본적인 통찰력을 제공 합니다. 현재 프로토콜 마이그레이션 및 침입 분석 실험에 대 한 단일 워크플로우를 제공합니다. 실시간 HD 이미지와 내장 된 분석 모듈에 대 한 통합된 자동화 된 미세한 카메라를 함께 연구 한 시간 효율, 간단 하 고 재현성 실험 옵션을 제공합니다. 이 프로토콜은 사용자가 선택할 다른 분석 방법과 소모품에 대 한 대체도 포함 됩니다.

서론

셀 이동 및 침략 상처 폐쇄, 자 궁과 유선 morphogenesis^1,2,3태의 침공 등 인체의 정상적인 기능을 사용할 수 있는 중요 한 생물 학적 과정이 있습니다. 인간의 몸은 이러한 생물 학적 이벤트;의 정확 하 고 엄격한 통제 그러나, 몇 가지 예외가 있다. 악성 종양, 예를 들어이 보호를 탈출, 비정상적인 증식을 전시 전 이라고 인접 조직으로 침범을 수 있습니다. 전이 암 관련 사망률⁴의 주요 원인입니다.

유방암은 가장 일반적으로 여성, 암 진단 이며 여성 암 관련 된 죽음의 두 번째로 높은 원인이 선진국 전세계⁵. 유 방 암 덕트 또는 lobules 상피 세포의 하나 이상의 계층으로 구성 된에서 유래 했다. 정상적인 유 방 상피 세포 서로 전자 cadherin 및 integrins⁶같은 막 단백질을 통해 지하실 막에 준수합니다. 그러나, 침 습 유방암 세포 그들의 극성 및 세포 세포 접착, 잃 었 고전적인 상피 엽 전환 (응급)를 받아야 하....

프로토콜

참고: 두 셀 라인은 별도로 처리 합니다. 다음 절차에서는 해야 될 하나의 단일 셀 라인에 적용 경우 지정 하지 됩니다.

1. 부상 이전 셀 밀도 최적화

1. 약 80% T75 cm² 조직 배양 플라스 크에 부착 세포 문화 합류에 페 놀 레드 무료 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 200 mM L-글루타민, 5% CO₂ (37 ° C에서 2 µ g/mL 인슐린 보충 표준 보육 대부분 암 세포 선, 문화 정립에 대 한 조건은 세포 라인에 따라 다릅니다)입니다.
2. 폐기물 용기에 떨어져 pipetting 문화 미디어를 제거 합니다. 짧게 씻어 셀 단층 및 피펫으로를 미리 데워 0.1% 트립 신-EDTA의 2 개 mL를 피펫으로. 0.1% 트립 신-EDTA의 또 다른 2 개 mL를 추가 하 고 5 분 동안 37 ° C에서 표준 외피 조건 하에서 플라스 크를 놓습니다.
3. 부드럽게 셀의 분리를 보장 하기 위해 플라스 크를 누르고 분해 반응을 중지를 미리 데워 진된 문화 미디어의 10 mL를 추가 합니다.
4. 세포 현 탁 액 15 mL 원심 분리기 튜브 및 실 온 (RT)에서....

결과

이 마이그레이션/침입 분석 결과 상처 치유 분석 결과, 96 핀 스크래치 도구에 의해 만들어진 셀 자유로운 지역으로 이동 하는 셀의 속도 계산 하는 기반으로 합니다. 마이그레이션 및 침입 분석 실험의 차이 마이그레이션 분석 측정 셀 조직 문화 취급 플라스틱 표면 및 침략 측정값 셀에 ECM 젤 이동 이동 실험.

스크래치 도구는 지정 된 격판덮개에 일관 된 스크래치 상처를 만들기 위해 설계 되었습니다 그리고 라이브 셀 영상 중간에 스크래치 상처와 실시간 고해상도 이미지를가지고 하도록 설계 되었습니다. 두 유 방 암 세포 라인 현재 프로토콜에 사용 되는 ZR75-1 및 MDA-MB-231, luminal B로 분류 하 고 트리플 부정적인 하위 각각⁹. 96 핀 스크래치 도구에 의해 생성 된 스크래치 상처 700-900 µ m.......

토론

마이그레이션 및 침략 암 세포의 이동성을 평가 하기 위해 중요 한 매개 변수가 있습니다. 96 핀 스크래치 도구를 사용 하 여 2D 및 3D에서 분석 실험을 동시에 치유 하는 상처를 수행 가능 하다. 자동 스캐닝을 촉진, 떨어져 최소 중단, 안정적인 셀 문화 환경을 제공 96 핀 스크래치 도구를 사용 하 여 실시 하는 스크래치 분석 결과 제공 일관 된 스크래치 상처, 더 강력한 실험을 사용 하 고 재현 가능. 96 잘 접시 형식은 세포 선 또는 다른 약물 치료의 수를 증가의 추가 옵션을 제공 합니다. 또한, 추가 분석을 위해 셀 형태 변화와 동적 움직임을 기록할 수 있습니다.

마이그레이션/침입 분석 결과 몇 가지 필수 구성 요소와 쉽게 적용할 수 있도록 설계 되었습니다. Confluent 셀 단층 간격으로 감독된 셀 이동 되도록 부상 전에 중요 하다. 그것은 따라서 매우 권장 셀 밀도, 시드를 최적화 하 고 6-18 h 사이 기간 일반적으로 이상적 이다. 표면 및 확산 속도에 연.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.5% 트립신-EDTA 용액 (10x)	ThermoFisher Scientific	30028-02
Countess II FL 자동 세포 계수기	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000	자동 세포 계수
세제 1 (Alconox)	Sigma-Aldrich	242985	0.5% 작동 농도
세제 2 (Virkon S)	VetProduct DIRECT		1% 작동 집중
Dulbecco' s Modified Eagle Medium, 페놀-레드	없음 ThermoFisher Scientific	21063-045	10% FBS, 200 mM L-글루타민, 2 &mu 공급; g/ml 인슐린
ECM 젤(마트리겔)	Sigma-Aldrich	E6909	성장 인자 감소, 페놀 레드 무료
Essen ImageLock 96-웰 플레이트, 평평한 바닥	Essen	4379
EVE 카운팅 슬라이드	BioTools	EVS-50
소 태아 혈청(FBS)	Bovogen Biologicals	SFBS-F-500ml
IncuCyte 96-웰 스크래치 상처 세포 침입 액세서리	Essen	4444	CoolBox, 2x CoolSink
IncuCyte 세포 마이그레이션 키트	포함 Essen	4493	96웰 핀 블록, 2x 세척 보트 및
IncuCyte ZOOM	소프트웨어 포함 Essen		라이브 세포 분석 시스템
인슐린 용액 인간	Sigma-Aldrich	19278-5ML
L-글루타민 용액(100x)	ThermoFisher Scientific	25030-091
조직 배양 플라스크, 75cm2 성장 면적	Greiner Bio-One	658175

DPBS 에서 2배로 희석 기