자동된 라이브 셀 이미징 사용 하 여 간단한 마이그레이션/침공 워크플로

요약

현재 프로토콜 암 세포 마이그레이션 및 실시간으로 단일 플랫폼에서 침입을 조사 하 고, 세포 이동성 및 형태학 연구를 쉽게 재현할 수 및 시간 효율적인 옵션을 제공 하는 통합된 방법을 설명 합니다.

초록

암 세포 이동성은 전이의 개시에 대 한 중요 합니다. 따라서, 셀 이동 및 침략 적 능력의 큰 의미입니다. 마이그레이션 분석 침공 분석 실험은 더 순수 관련, 원래 사이트에서 vivo에서 암 세포 dislodgment를 흉내 낸 고 세포 외 매트릭스를 통해 침입 하는 반면 2D 수준에서 셀 이동의 기본적인 통찰력을 제공 합니다. 현재 프로토콜 마이그레이션 및 침입 분석 실험에 대 한 단일 워크플로우를 제공합니다. 실시간 HD 이미지와 내장 된 분석 모듈에 대 한 통합된 자동화 된 미세한 카메라를 함께 연구 한 시간 효율, 간단 하 고 재현성 실험 옵션을 제공합니다. 이 프로토콜은 사용자가 선택할 다른 분석 방법과 소모품에 대 한 대체도 포함 됩니다.

서론

셀 이동 및 침략 상처 폐쇄, 자 궁과 유선 morphogenesis^1,2,3태의 침공 등 인체의 정상적인 기능을 사용할 수 있는 중요 한 생물 학적 과정이 있습니다. 인간의 몸은 이러한 생물 학적 이벤트;의 정확 하 고 엄격한 통제 그러나, 몇 가지 예외가 있다. 악성 종양, 예를 들어이 보호를 탈출, 비정상적인 증식을 전시 전 이라고 인접 조직으로 침범을 수 있습니다. 전이 암 관련 사망률⁴의 주요 원인입니다.

유방암은 가장 일반적으로 여성, 암 진단 이며 여성 암 관련 된 죽음의 두 번째로 높은 원인이 선진국 전세계⁵. 유 방 암 덕트 또는 lobules 상피 세포의 하나 이상의 계층으로 구성 된에서 유래 했다. 정상적인 유 방 상피 세포 서로 전자 cadherin 및 integrins⁶같은 막 단백질을 통해 지하실 막에 준수합니다. 그러나, 침 습 유방암 세포 그들의 극성 및 세포 세포 접착, 잃 었 고전적인 상피 엽 전환 (응급)를 받아야 하 고 이동 하는 기능을 얻을. 넘쳐 흐름, 후이 세포는 세포 외 기질 (ECM)에 걸쳐 이동 하 고 혈관 또는 임 파 액 체계, intravasation 및 전이성 성장⁷다음 다음을 입력 합니다. 큰 의미는이 발생 하는 메커니즘을 이해, 때문에 전이 암 관련 mortalities의 가장 흔한 원인은 암 밀접 하 게 관련 된 세포 마이그레이션/침공. 암 세포의 움직임을 시각화, 마이그레이션 및 침입 분석 실험 이상적인 모델을 각각 2D 및 3D 셀 운동, 공부는. 마이그레이션 침공은 microenvironment와 생물 학적 장벽을 저하 능력 상호 작용을 포함 하는 반면 세포의 움직임을 직접 평가 합니다. 마이그레이션 침공의 요구 사항으로 두 개의 프로세스가 서로 완전히 독립적 되지 않습니다.

여러 가지 방법은 마이그레이션 침공을 공부 하 고 개발 되었습니다. 울타리와 마이크로 캐리어 분석 영역;의 변화 평가를, 셀 수 있도록 셀 무료 영역 생성 Kramer 연구진이, 상처 치유, 같은 마이그레이션 분석 검토 반면, transwell 및 모 세관 분석 유인⁸쪽으로 이동 하는 셀의 수를 기반으로 합니다. 침공 분석 실험, 대 한 ECM 환경 예를 들어, ECM 젤 또는 콜라겐 설정할 수 있으며 3D 이동 침공 지역, 거리 및 셀 수 (예: transwell 분석 결과, 오리너구리 분석 결과)를 모니터링 하 여 평가 될 수 있다⁸. 비-침략 적 세포로 침입 셀을 결합 하 고 침입 세포의 행동을 평가 하는 것입니다 침공 분석 결과의 다른 유형 (예: 회전 타원 체 분석 실험). 위의 방법은 그들의 프로 죄수, 그리고 쉽게 접근, 쉽게, 반복 하 고 마이그레이션 분석 결과 결합 하는 방식으로 있고 비슷한 워크플로 분석 결과 침공은 실험적인 디자인에 우선.

이 프로토콜 셀 마이그레이션 및 라이브 셀 이미징 사용 하 여 침입의 측정을 설명 합니다. 그것은 표준 셀 문화 인큐베이터에 설치 하는 시스템을 모니터링 하는 실시간 셀입니다. 그것은 높은 정의 이미지 검색과 간격 측정 셀 또는 형광 목표에 적절 한 마스크를 적용 하 여 설정에 따라 걸립니다. 분석 결과 마이그레이션/침략의 모듈 96 잘 접시에 셀 단층에 균질 스크래치 상처를 만들기에 적합은 96 핀 스크래치 도구 사용 하 여 포함 되어 있습니다. 메커니즘은 생체 외에서 상처 치유 분석 실험, 플라스틱 또는 코팅된 표면에 2D 셀 이동 모니터링을 기반으로 합니다. 침공 또는 스크래치 상처 내 추가 ECM에 걸쳐 3D 이동 평가 수 있습니다. 간단한 워크플로 그림 1에 나와 있습니다.

프로토콜

참고: 두 셀 라인은 별도로 처리 합니다. 다음 절차에서는 해야 될 하나의 단일 셀 라인에 적용 경우 지정 하지 됩니다.

1. 부상 이전 셀 밀도 최적화

1. 약 80% T75 cm² 조직 배양 플라스 크에 부착 세포 문화 합류에 페 놀 레드 무료 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 200 mM L-글루타민, 5% CO₂ (37 ° C에서 2 µ g/mL 인슐린 보충 표준 보육 대부분 암 세포 선, 문화 정립에 대 한 조건은 세포 라인에 따라 다릅니다)입니다.
2. 폐기물 용기에 떨어져 pipetting 문화 미디어를 제거 합니다. 짧게 씻어 셀 단층 및 피펫으로를 미리 데워 0.1% 트립 신-EDTA의 2 개 mL를 피펫으로. 0.1% 트립 신-EDTA의 또 다른 2 개 mL를 추가 하 고 5 분 동안 37 ° C에서 표준 외피 조건 하에서 플라스 크를 놓습니다.
3. 부드럽게 셀의 분리를 보장 하기 위해 플라스 크를 누르고 분해 반응을 중지를 미리 데워 진된 문화 미디어의 10 mL를 추가 합니다.
4. 세포 현 탁 액 15 mL 원심 분리기 튜브 및 실 온 (RT)에서 5 분 동안 200 x g 에 아래로 회전으로 전송 합니다. 조심 스럽게 셀 펠 릿을 교 반 하지 않고는 상쾌한을 제거 하 고 다른 10 mL 미리 데워 진 문화 미디어 resuspend.

2. 자동된 셀 카운터 (또는 어떤 계산 방법)를 사용 하 여 셀 수를 계산

1. Dulbecco의 인산 염 x 1의 800 µ L와 resuspended 세포 현 탁 액의 희석 200 µ L 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 염 분 (DPBS) 버퍼링.
2. 셀 카운터 60 µ m 셀 카운트 센서를 부착, 토글 누른 끝 셀 서 스 펜 션으로 병합 합니다. 셀 서 스 펜 션 센서에 그려진 성공적으로 때까지 천천히 토글 해제. 셀 농도 셀/mL에 표시 됩니다.
3. 10 mL 세포 현 탁 액에 휴대폰 번호를 계산 합니다.

3. 셀 도금

1. 96 잘 접시에 3 중에 셀 밀도 (40000-90000 셀/잘)의 범위에서 플레이트 세포.
2. 라이브 셀 이미징에 접시를 놓고 모든 2 h 24 h에 대 한 검색을 예약 합니다.
   1. 소프트웨어에서 작업 목록에서 검색 하는 일정을 클릭 합니다. 서랍 설정 창에서 접시의 위치를 확인 하 고 추가 선박 을 클릭 접시 종류를 선택 합니다. 검색 설정 창에서 또는 실험 접시 설정에 따라 스캔 패턴 편집 선택한 스캔 형식 을 표준으로 설정 합니다.
   2. 시간 표시 막대 를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 설정 간격을 선택 합니다. 2 h 24 시간 일정에 추가할 검색 모든 설정 합니다. 적용을 클릭 합니다.

4. 마이그레이션 분석 결과 대 한 밀도 시드 최적의 셀 결정

1. 세인트op 24 h 후 스캔 합류 처리 HD 단계 대비 이미지를 자동으로 수집, 분석 도구를 적용 하 고 시간에 대 한 세포 증식 곡선 생성.
   1. 3-6 대표 이미지를 결정 하 고 새로운 이미지 컬렉션에 그들을 배치.
   2. 처리 정의로 적절 한 마스크를 결정 합니다.
   3. 분석 작업을 시작 합니다.
   4. 시간에 대 한 합류에 따라 최적화 된 세포 밀도 결정 (6 내에서 약 100% 합류-18 h 마이그레이션 분석 결과 개시 하는 때에 따라).
      참고: 합류 하는 세포를 성장 하는 데 걸리는 시간의 양을 시드 희석에 따라 다릅니다.

5. 일 1과 2: 마이그레이션 및 침입 분석 실험을 위한 준비

1. 주 1 침입 분석 결과 대 한 플레이트 코트.
   참고: ECM 젤 항상 처리 하룻밤 냉장고에 배치 된 팁과 얼음에.
   1. ECM 젤 얼음 문화 미디어 100 µ g/mL를 희석 하 고 지정 된 우물으로 희석된 ECM 젤/미디어의 50 µ L를 추가 합니다.
   2. 장소 표준 외피 조건에서 접시 하룻밤.
2. 하루에 2, 부드럽게 초과 미디어 발음. (현재 프로토콜, 최적화 된 시드 밀도 대 한에 늦은 오후에 셀 (uncoated) 마이그레이션 분석 결과 대 한 지정 2 96 잘 접시와 triplicates 다음 1-3에서에서 (코팅) 침공 분석 결과에 최적화 된 셀 밀도와 접시 ZR75-1 MDA-MB-231 했다 90000/잘 및 50000/글쎄, 각각).
3. 표준 배양 조건에서 하룻밤 접시를 놓습니다.

6. 주 3: 상처 스크래치

1. 스프레이 닦아 스크래치 도구는 biosafety에 캐비닛을 배치 하기 전에 70% 에탄올으로 보트 세척 2. 정확히 45 mL의 멸 균 (압력가) 증 류 된 물과 70% 에탄올으로 세척 보트를 1과 2를 각각 채우십시오.
2. 살 균, 세척 5 분 동안 배 1과 2에 스크래치 도구 핀 블록 (위) 장소.
3. 마이그레이션 분석 결과 접시와 함께 시작 합니다.
   1. 인큐베이터에서 세포를 포함 하는 접시 이동한 더 잘 스크래치 도구의 손상을 방지 하려면 건조 되었는지 확인 합니다. 플레이트 커버를 제거 하 고 스크래치 도구의 베이스 플레이트 홀더에 삽입 하 고 신중 하 게 못을 유도 하 여 기본 부분에 상단 부분을 배치. 검은 레버를 누르면 누른 한편 핀 블록을 조심 스럽게 들어올립니다. 각 잘에서 간격 육안 및 현미경의 밑에 일반적으로 볼 수 있습니다.
   2. 신속 하 게 물;에 핀을 담근 다 이것은 접시 설치 동일 경우 침공 분석 결과 접시를 긁 적 전에 스크래치 도구를 청소 충분 합니다. 그렇지 않으면, 5 분 동안 멸 균 증류수 그리고 70% 에탄올으로 살 균 단계를 반복 합니다.
4. 세척 접시 1 또는 2 시간 분리 된 셀 또는 셀을 피하기 위해 미리 데워 진된 문화 미디어와 잘 연결 시트입니다.
5. 치료의 유무에 관계 없이 지정 된 우물에 신선한 따뜻한 미디어의 100 µ L를 추가 합니다.
6. 침공 분석 결과 대 한 추가 단계.
   1. Equilibrate 신중 하 게 차가운 미디어 발음을 5 분 동안 4 ° C에서 침공 분석 결과 접시를 놓습니다.
   2. ECM 젤 얼음 문화 미디어 5 mg/mL를 희석, 지정 된 우물으로 희석된 ECM 젤의 50 µ L을 추가 하 고 30 분 동안 표준 외피 아래에 배치.
   3. 따뜻하게 업 미디어 또는 화합물을 테스트 없이 100 µ L를 추가 합니다.
7. 라이브 셀 이미징에 접시를 놓고 5 분 imagelock 격판덮개로 선택 선박 종류 에 대 한 equilibrate 그것 합니다. 스크래치 상처로 검색 유형 을 설정, 선택 또는 실험 판 설치 (1 이미지/잘 고 넓은 모드)에 따라 검색 패턴 을 편집 하 고 24 h 반복 스캔 마다 1-2 h 72 h에 대 한 상처는 치유 될 때까지 일정.
8. 다음 솔루션 (45 mL 보트 세척에서)의 각 상위 핀 블록 5 분: 0.5% 세제 1 넣어 스크래치 도구를 청소 하려면 (참조 테이블의 자료), 1% 세제 2 ( 재료의 표참조), 불 임 증 류 물과 70% 에탄올. 먼지 없는 환경에서의 베이스 플레이트 및 저장소에 다시 스크래치 도구를 놓습니다.

7. 데이터 분석

1. 서랍 설정 에 실험 접시를 선택 하 고 제거 선박을 클릭 하 여 모든 상처 치유 했다 후 지정 된 접시를 검색을 중지 합니다.
2. 후 상처, 폐쇄 상처 10%, 50%로 이미지 오른쪽을 포함 하 여 사운드 백분율의 범위를 확장 하는 3-6 대표 이미지를 수집 합니다.
3. 적절 한 처리 정의 확인 하려면 적절 한 스크래치 상처 마스크 와 합류 마스크를 적용할 세분화 조정, 정리 및 필터 를 사용 합니다. 전류/모든 미리 보기 를 사용 하 여 마스크의 정확도 볼 수 있습니다.
4. 분석 작업을 시작 합니다.
5. 데이터 분석 소프트웨어 또는 추가 분석에 대 한 내보낼 수 있습니다. 3 통계 소프트웨어에서 제공 HD 단계 이미지를 평가 하는데 사용 될 수: 상처 폭 (µ m), 상처 합류 (%)와 상대 상처 밀도 (%). 비교는 다음 섹션에서 논의 될 것입니다.

결과

이 마이그레이션/침입 분석 결과 상처 치유 분석 결과, 96 핀 스크래치 도구에 의해 만들어진 셀 자유로운 지역으로 이동 하는 셀의 속도 계산 하는 기반으로 합니다. 마이그레이션 및 침입 분석 실험의 차이 마이그레이션 분석 측정 셀 조직 문화 취급 플라스틱 표면 및 침략 측정값 셀에 ECM 젤 이동 이동 실험.

스크래치 도구는 지정 된 격판덮개에 일관 된 스크래치 상처를 만들기 위해 설계 되었습니다 그리고 라이브 셀 영상 중간에 스크래치 상처와 실시간 고해상도 이미지를가지고 하도록 설계 되었습니다. 두 유 방 암 세포 라인 현재 프로토콜에 사용 되는 ZR75-1 및 MDA-MB-231, luminal B로 분류 하 고 트리플 부정적인 하위 각각⁹. 96 핀 스크래치 도구에 의해 생성 된 스크래치 상처 700-900 µ m...

토론

마이그레이션 및 침략 암 세포의 이동성을 평가 하기 위해 중요 한 매개 변수가 있습니다. 96 핀 스크래치 도구를 사용 하 여 2D 및 3D에서 분석 실험을 동시에 치유 하는 상처를 수행 가능 하다. 자동 스캐닝을 촉진, 떨어져 최소 중단, 안정적인 셀 문화 환경을 제공 96 핀 스크래치 도구를 사용 하 여 실시 하는 스크래치 분석 결과 제공 일관 된 스크래치 상처, 더 강력한 실험을 사용 하 고 재현 가능. 96 잘 접시 형식은 세포 선 또는 다른 약물 치료의 수를 증가의 추가 옵션을 제공 합니다. 또한, 추가 분석을 위해 셀 형태 변화와 동적 움직임을 기록할 수 있습니다.

마이그레이션/침입 분석 결과 몇 가지 필수 구성 요소와 쉽게 적용할 수 있도록 설계 되었습니다. Confluent 셀 단층 간격으로 감독된 셀 이동 되도록 부상 전에 중요 하다. 그것은 따라서 매우 권장 셀 밀도, 시드를 최적화 하 고 6-18 h 사이 기간 일반적으로 이상적 이다. 표면 및 확산 속도에 연...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.5% 트립신-EDTA 용액 (10x)	ThermoFisher Scientific	30028-02
Countess II FL 자동 세포 계수기	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000	자동 세포 계수
세제 1 (Alconox)	Sigma-Aldrich	242985	0.5% 작동 농도
세제 2 (Virkon S)	VetProduct DIRECT		1% 작동 집중
Dulbecco' s Modified Eagle Medium, 페놀-레드	없음 ThermoFisher Scientific	21063-045	10% FBS, 200 mM L-글루타민, 2 &mu 공급; g/ml 인슐린
ECM 젤(마트리겔)	Sigma-Aldrich	E6909	성장 인자 감소, 페놀 레드 무료
Essen ImageLock 96-웰 플레이트, 평평한 바닥	Essen	4379
EVE 카운팅 슬라이드	BioTools	EVS-50
소 태아 혈청(FBS)	Bovogen Biologicals	SFBS-F-500ml
IncuCyte 96-웰 스크래치 상처 세포 침입 액세서리	Essen	4444	CoolBox, 2x CoolSink
IncuCyte 세포 마이그레이션 키트	포함 Essen	4493	96웰 핀 블록, 2x 세척 보트 및
IncuCyte ZOOM	소프트웨어 포함 Essen		라이브 세포 분석 시스템
인슐린 용액 인간	Sigma-Aldrich	19278-5ML
L-글루타민 용액(100x)	ThermoFisher Scientific	25030-091
조직 배양 플라스크, 75cm2 성장 면적	Greiner Bio-One	658175