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방법 논문

고급 폐 유도 빛 시트 현미경 검사 법에 따라 알레르기 염증의 Vivo 모델에서 실험에서 인간 림프 톨의 이미징

7.1K 조회수

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DOI:

10.3791/59043

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2019년 4월 16일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine 1, University Hospital of Erlangen, 2Department of Medicine 3, University Hospital of Erlangen

이 논문에서

요약

여기 소개 된 프로토콜 vivo에서 염증 성 조건 하에서 기본 인간 림프 톨의 폐 유도 용량 특성을 수 있습니다. 알레르기 염증의 마우스 모델에서 adoptively 전송된 인간의 면역 세포의 폐 침투 몇 군데 하 고 화학적으로 허가 폐 조직의 빛 시트 형광 현미경 검사 법에 의해 측정할 수 있습니다.

초록

매우 활성화 된 면역 세포의 조직 축적 압도적인 다양 한 만성 염증 성 질환의 특징을 대표 하 고 영향을 받는 환자의 임상 관리에 매력적인 치료 대상으로 등장. 프로-염증 성 면역 세포의 병 적 불균형 조직 침투의 치료 규제를 목표로 하는 전략을 더욱 최적화 하기 위해서는 그것은 향상 된 통찰력으로 질병 및 기관 관련을 달성 하기 위해 특별 한 중요성의 될 것입니다. 주변 세포의 속성을 추적 합니다. 여기 설명된 실험 프로토콜 papain 유도 폐 염증의 맥락에 놓여있는지 레이블 및 adoptively 전송 인간 림프 톨의 폐 축적을 모니터링할 수 있습니다. 면역 세포 이동과 chemotaxis 분석을 위해 자주 사용 표준 생체 외 분석 실험, 달리 지금 소개 vivo에서 설정 계정 폐 관련 조직 조직 및 복잡 한 염증의 영향으로 걸립니다. 시나리오 murine 생명체에서 일어나입니다. 또한, 3 차원 횡단면 빛 시트 형광 현미경 이미징만 양적 데이터, 면역 세포를 침투에 제공 하지 않습니다 하지만 또한 염증이 폐 내에서 면역 세포 지역화의 패턴을 보여 줍니다. 전반적으로, 우리는 제공 된 단계별 프로토콜에 따라 쉽게 적용 될 수 있는 만성 염증 성 폐 질환의 분야에서 면역학 연구에 대 한 높은 값의 혁신적인 기술을 소개 수 있습니다.

서론

알레르기 천식 등 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 폐의 고전적인 염증 성 질환으로 폐 조직1,2활성화 된 림프 톨의 증가 채용에 의해 구동 잘 알려져 있습니다. 림프 구 출시 cytokines (예를 들어, 일리노이-4, IL-5, 일리노이-9, IL-13, TNF-α와 IFN-γ) 더 타고 난 및 적응형 면역 세포의 chemotaxis를 홍보, 거리 기도 개장을 유도 하거나 직접 폐 실질2손상. 지금까지, 폐 조직 내에서 세포의 병 적인 축적에 대 한 책임 기본 메커니즘은 아직 완전히 이해 되지. 조직 선택적 T 세포 각 인 그리고 피부 본질적인 유도 대 한 설명에 비유, 폐 모 수석 세포 (DCs)는 분명히에 적어도 분할 CCR4 식의 유도 통해 우선 폐 침투에 대 한 주변 T 세포를 수는 림프 톨3의 표면입니다. CCR4, 외 기도 침투 T 세포는 CCR5와 CXCR3 주변 혈액1,,45내의 T 세포에 비해 chemokine 수용 체의 증가 특히 식 또한 특징. 전반적으로, 기존 데이터 폐 유도 생리 또는 염증 성 조건에서 T 세포의 다른 chemokine 수용 체와 그들의 각각 ligands의 수를 포함 하 고 따라서 결정적으로 의존 개념와 일치 하는 밀접 하 게 타고 난 및 적응형 면역 세포1간의 협업을 제어. 특히, 병원 체 또는 알레르기에 노출의 초기 단계, 타고 난 면역 계통의 세포 응답 TLR 자극 또는 LTB4, CCL1, CCL17, 같은 다른 chemoattractants의 즉각적인 석방 cross-linking IgE 중재 PGD, CXCL10, CCL20, CCL2221,,67. 대표적인 사례로 PGD2 와 chemoattractant 수용 체 간의 상호 작용 CRTh2 Th2 세포의 chemotaxis에 대 한 특정 중요성의 것으로 알려져 있다 하 고 따라서 나타났다 천식의 임상 관리에 유망 치료 대상. 실제로, 온건한 천식 환자 증상의 개선 및 치료 후 1 초 (FEV1)에서 강제로 내쉬는 숨의 볼륨의 상당한 증가와 보여주었다 위약 그룹8 에 비해 선택적 CRTh2 길 항 9. 염증 반응의 더 진행된 상태에서 이미 채용된 T 세포 폐 림프 구 축적 발표를 통해 IL-4, IL-13의 강력한 자극으로 폐 Dc에 대 한 증폭 수 있습니다. 그 후, 이러한 골수성 파생 된 타고 난 셀 최대-규제 STAT6 종속 방식으로1,,1011CCL17 및 CCL22의 표현.  있지만 설명된 시나리오의 복잡성은 여전히 귀환 T 세포 폐의 완전 한 이해를 방해, 염증 또는 알레르기 성 폐 질환의 잠재적으로 최적화 된 치료 제어를 위한 분자 대상의 과다를 제공 합니다. 따라서, 기술의 혁신적인 실험, 더 깊게 T 셀 chemotaxis 및 폐 유도의 분야에서 우리의 지식을 보완 하는 긴급 한 필요가 있다.

사실은 폐 유도 인체 내에서 세포의 여러 세포, 체액 및 물리적 매개 변수1에 의해 영향을 받습니다, 대부분 기존 실험 방법의 면역학 프로세스의 전체 복잡성을 모델링 할 수 없습니다. 대신, 림프 구 매력, 접착, 마이그레이션 및 보존 캐스케이드에 관련 된 특정 측면에 초점을 선택적으로 귀환 하는 폐의 분석에 대 한 많은 표준 프로토콜. 주변 또는 폐에 침투 림프 톨에 integrins 및 chemokine 수용 체의 mRNA 나 단백질 식 패턴의 혈액, 각각 chemokine 수준 보완 측정의 순전히 설명 결정 외 bronchoalveolar 게 (발) 또는 폐 조직12,13,,1415, 잘 설립 체 외 세포 문화 분석 허용 림프 구 접착 또는 chemotaxis의 기능 특성 따라 실험 조건16,,1718정의. 원칙적으로, 정적 생체 접착 분석 표준 생체 외에서 하는 동안 교양된 세포는 내 피 단층 또는 재조합 형 내 피 접착 분자 (MAdCAM-1, VCAM-1), 코팅 유리 슬라이드의 바인딩 용량 모니터링 chemotaxis 분석 실험 수 세포의 chemokine 그라데이션 transwell 시스템19에 따라 마이그레이션할 계량 하기 위해 일반적으로 적용 됩니다. 둘 다 생체 외에서 설정을 제어 조정 및 실험 조건, 변조 있지만 비판적 vivo에서 chemotaxis와 세포의 접착에 미치는 영향에 알려진 중요 한 변수를 다른 한편으로 부족. 정적 셀 문화 분석 실험19 영구 혈액 흐름 의해 발생 하는 전단 세력의 영향을 무시 하 고 잠재적으로 면역 주변 환경 및 비 림프 구 면역 세포 상호 작용의 개입을 무시 하는 주로, 둘 다 살아있는 유기 체에. 이러한 한계를 극복 하기 위해 정적 생체 외에서 또는 준수 chemotaxis 분석 실험에서 얻은 결과의 해석 추가 동적 접착 실험 흐름 조건20,21 에서 고에 유효성 검사에 필요한 염증 성 장기 병 리19의 vivo 모델. 실제로, 중요 한 동물 연구에서 T 세포 폐 염증 또는 알레르기 성 조건 하에서 귀환의 규제에 관한 결론을 얻을 수 수 유전자 분석 수정 다른 폐 질환3, 의 정의 된 모델에서 마우스 22 , 23. 대 한 관심의 특정 유전자 나타냅니다 특정 세포의 영향을 정의 하기 위한 확고 하 고 광범위 하 게 사용 도구 wildtype 쥐와 쥐 결핍과 세포를 침투 하는 폐의 양적 비교 경로 또는 T 세포 분포의 질병 제어 패턴에 수용 체. 그러나, 달리 생체 외 세포 문화 분석, 논의 하기 전에 클래식 동물 모델에 따라 연구 설계 능력이 없다 분석 하 고 기본 인간 T 세포 혈액 또는 염증 성 폐에서 고통 받는 환자의 발에서 직접 파생 된 모니터링 질병입니다. 따라서, 그것은 여전히 기능 진단 지정 된 폐 질환은 우선 폐 차 있는 굴곡 운동 그리고 얼마나 멀리 임상 매개 변수 영향을 줄 수이 시나리오에 대 한 인간의 세포 간 기 수를 확인 하기 위해 도전 남아 있습니다. 최근, 매우 우아한 vivo에서 접근 대부분의 이러한 한계를 극복할 수 있었던 고 창 자 림프 톨 귀환24에 고급 변환 연구를 위한 새로운도 열 선 동적인 장 질병 (IBD)의 맥락에서 소개 되었다 . 용 매 기반 조직 비운 뒤에 강력한 이미징 도구로 횡단면 빛 시트 형광 현미경 검사 법에 대 한 프로토콜을 이용 침투 및 adoptively 전송된 인간 T 세포의 분포를 시각화 가능 했다 colitic immunodeficient 마우스24의 소장. 특히,이 실험 설정 두 가지 주요 혁신 구현: 실험적으로 정의 된 vivo에서 조건; (1) 기본 인간의 면역 세포를 분석할 수 있습니다 (2) 병에 걸리는 기관의 오히려 큰 영역 (약 1.5 c m x 1.5 c m) 고해상도 품질, 3D 개조 뒤에 몇 군데 있습니다. 또한, 여러 최근 연구 성공적으로 설립 용 매 기반 조직 삭제 및 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 고급 폐25,26이미징에 대 한 중요 한 도구. 폐 면역학의 분야에서이 기술 진보에서 혜택, 우리는 지금 폐 유도의 분석을 위한 시스템을 채택 했다.

여기 제시 프로토콜 정화 방법과 붙일 레이블에 기본 인간 T 세포 유도 폐 염증와 쥐에 전송에 대 한, 또한, 빛 시트의 후속 과정 자세히 설명 단계별 소개를 제공 합니다. 기관 준비 및 이미지 처리를 포함 하 여 형광 현미경 이미지입니다. 전반적으로, 정교한 모니터링 vivo에서 조건에 따라 인간 림프 구 폐 유도 역시 가능한, 실험 모델만 도입 하 여 염증 또는 알레르기 성 폐 질환의 분야에서 미래의 변환 연구를 지원 하기 위해 노력 하겠습니다.

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프로토콜

실험 동물 관련 된 프로토콜 (Regierung 폰 인 운터 프랑 켄, 부츠 부르 크, 독일) 에를랑겐에서 관련 지방 자치 단체에 의해 승인에 따라 수행 했다. 마우스는 특정 병원 체 자유로운 조건에서 보관 되어 있었다. 인간의 혈액의 수집 지역 윤리 위원회 에를랑겐 뉘른베르크의 대학교의 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다. 각 환자 서 면된 동의 했다.

1. 쥐에서 알레르기 폐 염증 유발

참고: 이전 연구27에 설명 된 대로 다음 실험 절차 쥐에서 알레르기 기도 염증 유도 있으며, 따라서 BAL에서 타고 난 및 적응형 면역 세포의 축적을 트리거합니다. 설명된 프로토콜 C57BL/6J 마우스에서 설립 되었습니다 하지만 다른 표준 타고 난된 긴장에 입양 가능 해야 한다.

그림 1A 생체 조건 실험 절차의 요약에 대 한 참조 하십시오.

  1. 케 타 민/xylazine의 복 주입 하 여 쥐를 anesthetize.
    참고:     적어도 16 g의 몸 무게와 6 주 보다 더 오래 된 C57BL/6J 마우스 사용.
    1. PBS (12 mg/mL의 마 취 제; 1.6 mg/mL xylazine)에서 케 타 민/xylazine 솔루션을 준비 하 고 쥐의 정확한 몸 무게를 결정 합니다.
    2. Intraperitoneally 8 µ L/g bodyweight 케 타 민/xylazine 솔루션의 첫 번째 마우스 주입 하 고 1.3 단계 진행 하기 전에 발 핀치 반사의 부재를 통해 깊은 마 취를 확인 합니다.
  2. 갓 5 mg/mL PBS에 papain의 준비. 천천히는 콧구멍으로 papain 솔루션의 10 µ L (50 µ g) 플라스틱. 신중 하 게 각 성까지 마우스를 모니터링 합니다.
  3. 실험에 포함 된 모든 마우스 1.1-1.2 단계를 반복 합니다. 3 일에 1.1-1.3 단계를 수행 합니다.

2. 정화 하 고 인간의 말 초 혈액 CD4 붙일 라벨+ T 세포

참고: 무 균 조건 하에서 공정 셀입니다.

  1. 주변 정 맥에서 사람의 혈액의 18 mL를 수집 합니다. 말 초 혈액 단 세포 (PBMC)의 일부분을 선택 하려면 Ficoll-Hypaque 그라데이션 원심 분리를 수행 합니다.
    참고: 수집 및 인간의 기본 자료의 분석 지역 윤리 당국에 의해 승인 될 필요가 있다. 적절 한 의료 자격을 가진 사람만 주변 정 맥에서 혈액을 수집 수 있습니다.
    1. Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)에 혈액 수집-monovettes (1.6 mg/mL를 EDTA 혈액)를 포함 하는 응고를 피하기 위하여.
      옵션: 버 피 코트 혈액, 백혈구, 완전 한 정 맥 혈액 대신에 농축 혈액 기증의 부산물을 사용 합니다.
    2. 50 mL 원뿔 튜브로 혈액을 전송 하 고 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 1:2 희석. 조심 스럽게 Ficoll-매체의 10 mL을 추가 (밀도 1.077 g/mL) 희석된 피 아래 하단 레이어로. 샘플 (800 x g 브레이크 없이 실 온에서 15 분) 원심
    3. 조심 스럽게는 원심 분리기에서 튜브를 제거 하 고 새로운 50 mL 원뿔 튜브로 PBMC 포함 interphase를 전송. 상단 및 하단 레이어를 삭제 합니다. PBS와 분리기 (300 x g 4 ° C에서 10 분 동안) PBMC 포함 된 튜브를 채우십시오. 제거는 상쾌한.
      참고: 필요에 따라, 필요한 경우 나머지 적혈구의 세포를 수행 합니다. 신중 하 게 resuspended 셀 펠 릿을 소용돌이 샘플 염화 염화 칼륨 (ACP) 세포의 용 해 버퍼 (155 m m 염화 암모늄, 19 mM 칼륨 수소 탄산염 및 0.68 m m EDTA, pH 7.27) 3 mL를 추가 합니다. 3 분 동안 튜브를 흔들어. ACP 세포의 용 해 버퍼 제거, PBS와 분리기 (300 x g 4 ° C에서 10 분) 40 mL를 추가 합니다. 상쾌한을 삭제 합니다.
  2. CD4 정화+ T 세포 CD4 microbeads를 통해.
    참고: 일반적으로, 인간의 CD4의 정화에 대 한 자기 microbeads의 여러 유통 업체는+ 셀, 셀 순도의 유사한 수준에 발생 한다. 제품 선택은 개별 환경 설정을 기반으로 해야 합니다. 프로토콜 (2.2.2–2.2.7)의 다음 단계는 정의 된 CD4 microbead 제품 및 추가 테이블의 자료에 표시 된 각 분리 열 조정 됩니다. 프로토콜의 일부 수정 될 필요할 경우에는 대체 CD4 microbead 제품을 선택.
    1. 최소 0.5% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 10 당 2 mM EDTA (PBS/FBS/EDTA-버퍼)를 포함 하는 80 µ L PBS에서에서 PBMC 펠 릿 resuspend7 PBMC. 사용 약 30 x 106 약 3 x 106 6 x 106 끝낼-위해서는 PBMC의 시작 인구 정화 인간의 CD4+ T 세포.
    2. 20 µ L 10 당 CD4 microbeads의 추가7 PBMC, 부드럽게 혼합 및 4 ° c.에 20 분 동안 품 어 PBS/FBS/EDTA-버퍼 (4 ° C까지 냉각) 및 원심 분리기 (300 x g 4 ° C에서 10 분)로 튜브를 채우십시오. 상쾌한을 제거 합니다.
    3. 자기장에 분리 열을 놓습니다. 3 mL PBS/FBS/EDTA-버퍼의 열을 씻어. PBS/FBS/EDTA-버퍼 (4 ° C까지 냉각)의 500 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 자기장 내에서 배치 하는 씻어 서 분리 열에 세포 현 탁 액을 전송.
    4. 분리 열 세 번의 PBS/FBS/EDTA-버퍼 (4 ° C까지 냉각) 3 mL을 헹 구 고 유출 삭제.
    5. 자기장에서 분리 열을 제거 하 고 15 mL 튜브에 배치. CD4 elute+ 는 플런저를 사용 하 여 PBS/FBS/EDTA-버퍼의 5 mL에 셀 분수.
    6. 분리기 (300 x g 4 ° C에서 10 분 동안) PBS와 튜브를 작성. 상쾌한을 제거 합니다. 이 세척 단계를 두 번 반복 합니다.
    7. 표준 방법의 선택 (예를 들어, Neubauer 챔버)에 의해 주어진된 셀의 수를 결정 합니다.
  3. CD4 라벨 형광 세포 확산 염료와+ T 세포.
    1. CD4 resuspend+ T 세포를 PBS에서 (107 셀/mL까지, PBS의 미만 500 µ L를 사용 하지 마십시오).
    2. 빨간 불 고르기 세포 증식의 6 µ M 솔루션 준비 (미리 실내 온도를 따뜻하게) PBS에서 ( 재료의 표참조)를 염색. 와이 솔루션 1:2 혼합를 하기 전에 준비 셀 펜션과 소용돌이 철저 하 게 (3 µ M 최종 농도).
    3. (빛에서 보호 되는) 37 ° C에서 10 분 동안 품 어. 이후에, 추가 10% 포함 된 RPMI 매체의 5 개 양에 FBS와 얼음 (빛 으로부터 보호)에 5 분 동안 품 어.
    4. 워시 라는 RPMI에 세 번 셀 중간 포함 10 %FBS (4 ° C에서 10 분 원심 분리기 300 x g 에). PBS에서 레이블이 셀 resuspend, 얼음에 저장 하 고 사용까지 빛에서 보호.
      참고: 연장 세포의 저장 (> 60 분) 세포 생존에 부정적인 영향을 줄 수 있습니다.
      옵션: CD4의 순도 결정+ cytometry에 의해 세포 분수 및 라벨링 절차의 효능. 0.5 x 10 resuspend6 1 x 106 CD4+ 의 버퍼 (1 %FBS, 2 mM EDTA PBS에) 100 µ L에서 세포 및 안티 인간 CD4 항 체는 형광 염료의 선택과 함께 추가. 4 ° c.에 30 분 동안 품 어 1 mL 버퍼 및 분리기 (300 x g 4 ° C에서 10 분)을 추가 합니다. 상쾌한을 삭제 합니다. 흐름 cytometric 측정 샘플의 진행 (대표적인 결과 그림 1B, C에묘사 된다).

3. adoptively 인간의 CD4 전송 Papain 노출 받는 사람 Mmice에+ T 세포

참고: 그림 1A vivo에서의 요약에 대 한 실험 절차 수행을 참조 하십시오. 셀 전송 papain의 마지막 intranasal 행정 후에 1 일을 수행 합니다.

  1. 붙일 레이블된 인간의 CD4의 정지 조정+ T 세포 (단계 2.3.4) PBS에서 1 x 107 셀/mL의 농도에. 채우기 셀 서 스 펜 션의 100 µ L에 1 mL/30 G-주사기.
  2. 조심 스럽게 꼬리 정 맥 주입에 대 한 구속 장치에 첫 번째 papain 노출 C57BL/6J 마우스 (1.1-1.3 단계)를 놓습니다. 준비 된 주사기 (3.1 단계)를 사용 하 여 꼬리 정 맥을 찔린 1 x 106 인간의 CD4 레이블이 포함 된 셀 서 스 펜 션의 100 µ L를 천천히 주입을+ 세포. 주입 후 즉시 바늘에 밖으로 당겨 하지 마십시오 하지만 셀 서 스 펜 션의 방전을 방지 하기 위해 자세한 5 초 기다립니다.
  3. 구속 장치에서 마우스 놓고 동물 진행. 적어도 하나의 papain 노출 동물, 빛 시트 형광 현미경 검사 법에 대 한 부정적인 제어 역할을 붙일 레이블 셀 전송 받아야 하지 않습니다 유지.

4. 빛 시트 형광 현미경 검사 법에 대 한 폐 조직 준비

참고: 전송 붙일 인간의 세포 (3.2 단계)를 표시 한 후 다음 단계 3 h 수행 됩니다. 폐 조직의 수확 등 설명된 실험 절차, 고정 및 용 매 기반 조직 삭제 현재 설명된 프로토콜24,28에서 적응 했다.

  1. 이산화 탄소 (C02) 흡입 하 여 마우스를 희생.
  2. 현장에서 폐 5 mM EDTA를 포함 하는 PBS를 가진 perfuse.
    1. 마음을 폭로 흉 골을 따라 절단을 통해 가슴을 엽니다. Punctate 21 G 정 맥과 우 심 실 카 테 터에 연결합니다.
    2. 절단 하 여 좌 심 실을 열고 그로 인하여 혈액 및 관류 액체 종료를 허용 합니다. 천천히 폐 카 테 터를 통해 5 mM EDTA를 포함 하는 얼음 처럼 차가운 PBS의 20 mL와 함께 perfuse.
  3. 폐의 현장에서 고정을 수행 하기 위해 우 심 실에서 카 테 터를 제거 하지 마십시오. 천천히 얼음 4 %paraformaldehyde (PFA) PBS에 해결의 2 mL와 함께 폐 perfuse. 카 테 터는 정을 제거.
    참고: 폐 조직의 PFA 기반 현장에서 고정 이후 현미경 분석29,30murine 폐 조직 준비 하기 확립 기법을 나타냅니다.
    주의: PFA 독성 이며 주의 후드 처리 될 수 있다.
  4. 현장에서 0.75 %agarose 폐를 채우십시오.
    1. PBS에서 0.75 %agarose 준비 하 고 계속 그것은 솔리드 온도-통에 50 ° C에서 사용까지. 마우스의 침 샘을 제거 하 고 sternohyoid 근육을 잘라 아래 집게를 슬라이딩 하 여 기도 노출.
    2. 30g 바늘 노출된 기도 중단 하 고 agarose의 원치 않는 누설의 결과로 기도의 추가 손상을 방지 하기 위해 무딘 30 G 카 테 터에 의해 그것을 대체. 삽입 된 카 테 터와 바늘 홀더를 사용 하 여 기관 사이의 교차점을 봉인.
      옵션: 여기 발 컬렉션 최근 세부31 에서 설명 하는 발에 침투 인간 세포를 분석 하는 절차를 설명 하는 결합 ( 그림 2전자 대표 결과 대 한 참조).
    3. 조심 스럽게 채워 기도 (신체 온도에 냉각) 0.75 %agarose 카 테 터를 통해 폐;의 완전 한 전개까지 agarose의 완전 한 응고 될 때까지 기다립니다. 카 테 터를 제거 하 고 신중 하 게 어두운된 2 mL 튜브 4%로 채워진 폐를 수확 PFA.
  5. 추가 고정 품 어 샘플 4% PFA PBS에 연속 회전 (31 rpm)에서 4 ° C에서 2 시간에 대 한 해결에 대 한.
  6. 50% 에탄올 (pH 9), 70% 에탄올 (pH 9)에서 4 ° C에서 이후에 연속 회전 (31 rpm)에서 샘플을 배양 하 여 조직을 탈수와 100% 에탄올; 적어도 4 h에 대 한 각 단계입니다. 끝에, 4 h에 대 한 신선한 100% 에탄올을 사용 하 여 두 번째 부 화를 수행 합니다.
  7. 솔벤트 기반의 조직 에틸 cinnamate (ECi)를 사용 하 여 청소를 수행 합니다. 따라서, ECi로 샘플을 전송 합니다. 품 어 조직 반투명 (참조 그림 1D 대표 이미지)가 나타날 때까지 (아래 지속적인 회전) 실 온에서 하룻밤.
    참고: ECi (빛 으로부터 보호) 실내 온도에 저장 하는 예제는 개월에 몇 주 동안 안정.

5. 수행 Wwhole Murine 폐 엽의 빛-시트 형광 현미경 검사 법

참고: 빛-시트 형광 현미경과 다음 단계는 기반으로 해당 소프트웨어에 대 한 자세한 내용은 테이블의 자료 를 참조 하십시오. 그러나 다른 제조 업체에 의해 동등한 시스템, 사용할 수 있습니다 또한 다음 프로토콜의 개발자 관련 수정. 시작 하기 전에, 현미경 전용 운영 매뉴얼에 익숙한 하 고 사이트에 책임 있는 사람에 의해 기술 지침을 따르십시오.

  1. 빛-시트 현미경을 설정 합니다.
    1. 켜고 빛 시트 현미경 이미징 소프트웨어는 컴퓨터에 해당 하는 열. 필터링 된 ECi (100 µ m 필터)와 샘플 챔버와 레이저 광선 사이 그것의 위치에 놓습니다.
    2. 스틱 샘플 홀더를 폐 유기 용 매-안정 접착제의 작은 방울을 사용 합니다. 빛 시트의 필요한 침투 깊이 가능한 작게 유지 하려면 폐 엽을 똑바로 설정 합니다. 다음, 그것의 약 실에 샘플 홀더를 배치 합니다.
    3. ECi 삭제 시 약으로 사용 하는 경우 3.5 목표의 굴절 인덱스를 설정 합니다.
  2. 셀을 검출 인간의 전체 기관의 맥락에서 빛 시트 현미경에서 설정을 조정 합니다.
    1. 필요한 레이저를 선택 (측정에 대 한 필터 > 필요한 레이저의 확인란을 활성화) 제어 소프트웨어에 적절 한 농도 선택 하 고 (레이저 전송 제어 > 강도 레이저 를 설정 하려면 슬라이더를 사용 하 여 > 적용). 488의 여기 파장을 사용 하 여 감지 autofluorescent 폐 조직과 640 nm (525/50 필터) nm (680/30 필터) 빨간 스펙트럼에 fluorophore 방출 이라고 하는 인간 세포를 자극.
    2. 샘플 488에 흥분된에 초점 nm의 여기 파장에서 '색채 보정' 도구를 통해 초점을 적응 nm (슬라이더를 사용 하 여 색채 보정 설정 > 적용).
    3. 선택 적절 한 확대/축소 비율; 낮은 확대 개요를 사용 하 여 (예: 6.3 x) 자세한 지역화에 대 한 폐 조직 확대 이미지 (예를 들어, 32 x) 내에서 레이블이 지정 된 셀의 전체 배포를 확인 하려면.
    4. 균일 하 게 전체 기관 또는 관심의 특정 섹션 elucidating 시트 폭 선택 (광학 > 시트 너비를 설정 하려면 슬라이더를 사용 하 여, 일반적으로 20-40% 사이). 선명한 이미지를 만드는 높은 NA와 시트 수 가늠 구멍 (NA)를 정의 (광학 > 시트 없음 설정 하려면 슬라이더를 사용 하 여;를 0.025%의 총 종종 사용할 수 있습니다 크기의 생리 적 확장 murine 폐 엽에 대 한).
    5. 빛-시트 '고급 측정 설정'에서 사용을 선택 합니다. 양방향 조명, 경우 병합 homogenously 조명된 이미지를 생성 하려면 왼쪽 및 오른쪽 빛 시트 (고급 > lightsheets 병합 > 선택 혼합 모드 > 슬라이더를 사용 하 여 두 빛 시트 사이의 중복 정의).
      참고: 3의 빛-시트 각 샘플의 양방향 조명 활용 하는 것이 좋습니다.
      옵션: 이미지 품질을 더욱 높이기 위해 동적 초점 작업을 사용 합니다. 이 이미지 중 x-방향으로 포커스를 이동할 수 있습니다.
    6. 측정 하 고 5 µ m 스텝 크기를 설정 하는 z-스택의 시작 및 끝 위치를 정의 (xyz 테이블 Z > 범위 스캔).
      참고: 시작 위치와 끝 위치가 z 스택의 크기 및 샘플 챔버 내 폐 엽의 위치에 따라 달라 집니다. 그러나, 약 300 ~ 800 z-스택 단일 폐 엽 (5 µ m 스텝 크기)에 대 한 일반적으로 획득 됩니다.
    7. '자동 설정'을 사용 하 여 파일을 저장 하 고 이미지를 캡처하는 측정 시작. 끝마무리 데이터 수집 후 ECi 오염 샘플 홀더 및 실행 물 아래 챔버 청소.
      참고: 동일한 설정을 사용 하 여 이후에 비교 하는 여러 폐 엽을 이미지.

6. 후 이미지 처리 및 폐에 축적 된 인간 세포의 정량화

참고: 3D 분석, 다음 단계는 기반으로 후 이미징 소프트웨어에 대 한 자세한 내용은 테이블의 자료 를 참조 하십시오. 그러나, 대체 후 이미징 소프트웨어 뿐만 아니라 사용할 수 있습니다.

  1. Z 스택의 첫 번째 이미지 로드 (surpass 버튼을 활성화, 파일 > 열기 > 선택 이미지) 선택한 z-스택 및 그들의 자동 3D 재구성의 다른 모든 이미지의 오프닝 시작 하기 위하여.
  2. X의 올바른 표시를 위해, y 및 z 치수 복 크기를 확인 하 고 필요한 경우 그들을 조정 (편집 > 이미지 속성 > 복 크기를 수동으로 입력). Z의 복 크기에 대 한 두 개의 이미지 (여기 5 µ m) 사이의 선택한 단계 크기를 입력 합니다.
  3. 고유한 색에 각 채널을 표시 (편집 > 디스플레이 조정 표시). 각 채널 선택의 색을 정의 하는 다른 후 하나를 클릭 합니다 ( 그림 2A, B, C, D에서 autofluorescence 신호 회색으로 표시 되 고 인간의 CD4 표시 빨간색에서 셀+ ).
  4. 강도, 블랙 레벨 및 각 채널에 대 한 대비 조정 (편집 > 디스플레이 조정 표시) 채널 막대에 삼각형을 사용 하 여 또는 채널 설정에서 정확한 번호를 입력. 휘도 조정, 오른쪽 삼각형을 사용 합니다. 블랙 레벨 조정에 대 한 왼쪽된 삼각형을 사용 하 고 대비 조정 중간 삼각형을 사용 합니다.
    참고: 사용 된 폐 세포 이동 (단계 3.3) 특정 인간의 세포 유래 신호와 난다 배경 구별 없이 컨트롤 마우스에서 파생.
  5. 척도 폐 조직 내에서 레이블이 지정 된 셀 사용 '추가 새로운 관광 명소' 도구 모음에서 및 선택 '자동 생성을 건너뛰고, 수동으로 편집' 수동 셀 계산에 대 한.
    참고:     또는 자동 셀 카운팅 '관광 명소'에서 도구를 사용 하 여. 그러나, 수동 계산 특정 및 불특정 신호를 보다 정확 하 게 구별할 수 있습니다.
    1. 다른 샘플에서 인간 세포의 축적을 비교 하는 3D 자르기 도구를 사용 하 여 특정 볼륨 폐 큐브 정의 (편집 > 자르기 3D) (여기 813 x 813 μ μ m x 1,000 μ m).
    2. 계산 된 셀 선택 640 nm 채널 10 µ m의 '반경 규모'를 정의 하려면. 그런 다음 '편집' 클릭, 포인터 메뉴에서 '선택' 확인 하 고 각 셀을 shift-클릭 하 여 마우스 왼쪽된 버튼으로 통해 점이 표시. 통계에 표시 되는 계산된 셀의 전체 수를 찾아.
      참고: 좋습니다 계산된 폐 볼륨의 과학자-종속 선택에 대 한 결과의 신뢰성을 보장 하 고 보상을 폐 엽 (여기 5) 당 여러 큐브를 계산 (정량화 전략 및 대표 결과 에서 묘사 된다 2D 그림).
  6. '스냅샷' 도구를 사용 하 여 이미지 캡처 및/또는 '애니메이션' 도구를 사용 하 여 비디오 가져가 라. 저장 조정.ims 파일 파일 (파일 > 내보내기).
    참고: 대표를 위해 표시 하거나 또는 도구 모음에서 프레임을 선택 취소 하 여 프레임을 숨길. 또한, 디스플레이 중 최대 강렬 투 상 (MIP) 이미지 (도구 모음 > 볼륨 > 모드 > 밉 확인) 또는 '표면 모드'를 사용 (도구 모음 > 새 추가). '표면 모드' 조직 아키텍처 및 셀 시체 (대표 이미지 그림 2C에 표시 됩니다)을 강조 하기 위해 각 채널 마다 별도로 활성화 될 수 있다.

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결과

제시 프로토콜 모니터링 및 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 통해 폐에 adoptively 전송된 인간 T 림프 톨의 축적을 측정 하는 실험 마우스 모델을 설명 합니다. 그림 1 A 생체 조건 실험 일정 단계의 도식 개요를 제공 합니다. 신뢰할 수 있는 결과 보장 하기 위하여 그것은 좋은 품질은 절연 및 붙일 수 있도록 상당한 중요성의 표시 인간의 CD4+ T 세포, 이후에 쥐로 전송 됩니다. 그림 1B, C, microbead 기반 셀 농축 및 후속 형광-라벨 일반적으로 위의 설명된 절차에 대표적으로 묘사 된 흐름 cytometrically에서 결과 결정 CD4+ T 셀 순도 > 95% 그리고 성공적인 형광 모든 CD4의 라벨+ T 세포. 빛-시트 형광 현미경의 품질과 침투 깊이 비판적으로 조직 비운...

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토론

여기 설명된 실험 설정 제공 고전적인 vivo에서 염증 성 조건 및 그로 인하여 relevantly 보완 기본 인간의 면역 세포의 유도 폐 용량을 모니터링 하는 기회가 chemotaxis를 수행 하는 생체 접착 분석 실험입니다. 폐의 계정 특정 해부학 기관 특성 고려, 임상 관련성 및 수집 된 데이터의 양도 (를 포함 하 여 대상 기관 안에 chemotaxis 및 셀 유통) 귀환 하는 면역 세포의 중요 한 측면 우리 했다 3 기술적인 주요 기능: (1) 분석 murine 생명체; 내 기본 인간 세포의 (2) papain 중재 유도의 폐 염증; 그리고 삭제 된 폐 조직의 빛 시트 형광 현미경 검사 법 (3).

비록의 기능 연구는 adoptively 인간의 전송 살아있는 murine 유기 체 내의 면역 세포 상호 작용 수용 체 ligand-쥐와 남자, 일반적인 개념 사이에서 잠재적으로 관련 된 비 호환성으로 인해 몇 가지 측면에서 ...

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공개 사항

M.F. Neurath 펜탁스, 줄리아니, MSD, Abbvie, 얀 센, 다케다와 Boehringer 고문 역임 했다. 나머지 작가 팬 들은 어떤 충돌의 정보를 공개 하지 않습니다.

감사의 글

저자는 기꺼이 DFG 공동 연구 센터 SFB 1181 TRR 241에 의해 자금을 인정 합니다. 광학 이미징 센터 에를랑겐 (OICE) 특정 랄 프 사노, 필립 Tripal, 티 나 Fraaß (DFG CRC 1181의 프로젝트 Z2) 빛 시트 형광 현미경 이미징에 대 한 전문 기술 지원에 대 한 인정.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Agarose NEEO UltraCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany2267.4
AlexaFlour594 anti-human CD45antibody BioLegend, San Diego, USA304060
염화암모늄Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, GermanyK2981
Cannula 21 GBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA301300
세포 증식 염료 eflour670eBioscience Inc., San Diego, USA65-0840-85
CD4 MicroBeads, humanMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany130-045-101
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany8043.1
Potassium-EDTA 혈액 수집 튜브, 9 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, 독일21066001
Ethly cinnamate (ECi)Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany112372-100G
Ethanol ≥ 99.5% (EtOH)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany5054.3
FBS (fetal bovine serum) Good FortePAN-Biotech GmbH, Aidenbach, GermanyP40-47500
Filter 100 µ 엠 VWR International Germany GmbH, 다름슈타트, 독일732-2758
Imaris Image Analysis Software 9.0.2Bitplane AG, Zurich, Switzerlandn.a.ImspectorPro
softwareAbberior Instruments GmbH, Gö 팅겐, 독일n.a.Ketamin
 Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germany3617KET-V
LaVision UltraMicroscope IILaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Germanyn.a.MACS
MultiStandMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany130-042-303
멀티플라이 캐뉼라 20 GSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, 독일851638035
30G 바늘B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany9161502
Neubauer counting chamberneoLab Migge GmbH, Heidelberg, GermanyC-1003
Pattex GlueHenkel AG & 공동, Dü 독일 셀도르프PSK1C
LS columnMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany130-042-401
림프구 분리 배지 (밀도 1,077 g/mL)anprotecAC-AF-0018
PapainMerck1,071,440,025
PBS Dulbecco (phosphate buffered saline)Biochrom GmbH, Berlin, GermanyL182-10
PerCP/Cy5.5 anti-human CD4BioLegend, 샌디에이고, 미국317428
PerCP/Cy5.5 마우스 IgG2b, κ isotype CtrlBioLegend, 샌디에이고, 미국400337
PFA (파라포름알데히드)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany0335.1
Potassium hydrogen carbonateCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, GermanyP7481
혈청학적 피펫 10 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, 독일86.1254.001 
주사기 1 mLB. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Germany9166017V
주사기 5 mLBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA260067
주사기 20 mLBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA260069
튜브 1.5 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, 독일72,706,400
튜브 2 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, 독일72.695.400 
튜브 2mL, 갈색Sarstedt AG & Co., Nü mbrecht, 독일72,695,001
튜브 15 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, 독일62.554.502 
튜브 50 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, 독일62.547.254 
QuadroMACS SeparatorMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Germany130-090-976
Xylazin (Rompun 2%)Bayer Vital GmbH, 레버쿠젠, 독일KPOBD32

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