X 선 레이저에서 직렬 펨 결정학 시간 해결에 대 한 Microcrystals의 고 점도 압출을 개선

요약

시간이 해결 직렬 펨 결정학 실험의 성공 효율적인 샘플에 따라 달라 집니다. 여기, 우리는 프로토콜 최적화 높은 점도 마이크로 압출 인젝터에서 bacteriorhodopsin microcrystals의 입체 면을 설명 합니다. 방법론은 소설 3 방향 커플러와 샘플 균질 및 고속 카메라와 시각화에 의존합니다.

초록

높은 점도 마이크로 압출 인젝터는 극적으로 x 선 자유 전자 레이저 (XFELs)에서 직렬 펨 결정학 실험 (SFX)에서 샘플 소비를 감소 했습니다. 일련의 실험 빛 구동 양성자 펌프 bacteriorhodopsin를 사용 하 여 추가 설정한이 인젝터의 구조 변화를 해결 하려면 시간 해결 직렬 펨 결정학 (TR-SFX)에 대 한 결정을 제공 하는 기본 옵션으로 photoactivation 후 단백질입니다. 높은 품질의 여러 구조 스냅샷, 많은 양의 데이터를 수집 하 고 모든 펌프 레이저 펄스 사이의 결정의 보장에 필수적 이다. 여기, 우리가 어떻게 우리가 우리의 최근 TR SFX 실험 Linac 일관 된 빛 소스 (LCLS)에서 bacteriorhodopsin microcrystals의 입체 최적화 자세히 설명 합니다. 방법의 목표 속도 증가 하는 결정의 높은 밀도 유지 하면서 안정적이 고 지속적인 흐름에 대 한 압출을 최적화 하는 실험에서 TR SFX에 데이터를 수집할 수 있습니다. 우리 커플링 장치는 고속으로 찍은 압출 안정성의 측정에 따라 샘플 구성 조정 하 여 다음 소설 3-방법으로 주사기를 사용 하 여 결정의 균일 분포 lipidic 입방 단계를 준비 하 여이 목표를 달성 카메라 설정입니다. 방법론은 다른 microcrystals의 흐름을 최적화 하기 위해 적용할 수 있습니다. 설치는 새로운 스위스 자유 전자 레이저 시설 사용자가 가능할 것 이다.

서론

직렬 펨 결정학 (SFX)은 대부분의 잡기 동안 수천 마이크로미터 크기의 결정에서에서 x 선 자유 전자 레이저 (XFEL) 실 온 구조 결정의 독특한 속성을 이용 하는 구조 생물학 기술 "파괴 전에 회절" 원리^1,2,3방사선 손상.

시간 해결 SFX (TR-SFX) 확장,는 XFEL에서 펨 펄스는 단백질^4,5에 구조적인 변화를 공부 하는 데 사용 됩니다. 관심사의 단백질 XFEL 펌프-프로브 설치 프로그램에 의해 총 직전 광학 레이저 (또는 다른 활동 트리거) 활성화 됩니다. 정확 하 게 제어 함으로써 펌프와 프로브 펄스 사이의 지연, 다른 주에서 대상 단백질을 캡처할 수 있습니다. 시간 11 배나 통해 구조 변경의 분자 영화 보여 여러 단백질 목표^6,7,,8

프로토콜

1. 단백질 크리스탈 샘플 준비

1. 약 30 분 전에 샘플, 주입 하는 것입니다 monoolein 크리스탈-라덴의 부하 50 µ L 100 µ L 주사기에 LCP을 기반으로.
2. 대기압에서 주입에 대 한: 부하 10 µ L 주사기를 두 번째의 뒤쪽으로 액체 파라핀의. 수직으로 주사기를 들고, 주사기에서 공기 방울을 추방.
   1. 진공 환경으로 주입에 대 한: 매기 7.9와 두 번째 주사기의 뒤쪽으로 액체 파라핀의 5 µ L의 부하 5 µ L. 수직으로 주사기를 들고, 주사기에서 공기 방울을 추방.
3. 파라핀/매기 7.9 표준 주사기 커플러에 주사기를 연결, 눌러 부드럽게 플런저에 작은 볼륨까지 커플러에서 공기를 제거 (< 1 µ L) 파라핀/지질의 커플러 바늘의 끝에 표시 됩니다.
4. 샘플으로 공기를 소개 하지를 돌보는 주사기 커플러를 샘플 주사기를 연결 합니다. 커플러를 통해 시료를 여러 번 전달 하 여 지질/파라핀에 섞어.
5. 또 다른 100 µ L 주사기에 premixed LCP (27% 말뚝, 100 mM 소 렌 슨 pH 5.6 + 모)의 20 µ L를 로드 합니다. 필요에 따라 기포를 제거 합니다.
6. 커플러에서 빈 주사기를 제거 하 고 표준 주사기 커플러를 사용 하 ....

결과

여기에 설명 된 절차 (그림 3)에 대 한 이상적인 시작 물자는 인젝터를 위한 점성 운반대 매체에 통합 하는 microcrystals의 높은 밀도 이다. 절차의 크리스탈 라덴 각 준비를 위해 약 50 µ L에 대 한 호출합니다. 이러한 bR^9,10 여기, 예를 들어 (그림 4), 사용 또는 기존의 증기 확산 설정에서 성장 하는 결정을 사용 하 여 준비로 LCP에 직접 성장 수 있다. 우수한 비디오 가이드 기밀 주사기에서 직접 결정 화를 찾을 수 있습니다 Ishchenko 외. (2016)³⁷. BR, 결정 플레이트의 이상적인 직경 회절 능력과 펌프 레이저 동질적인 활성화 사이 좋은 타협으로 약 20 μ m입니다. 단백질.......

토론

점성 돌출 인젝터와 TR SFX 메서드 bacteriorhodopsin^9,10 , photosystem II¹³ 의 구조 역학 연구에 대 한 가능한 기술을 입증 하 고 지금 공부 단백질 다른 운전 준비가 보인다 사진 빛 구동 이온 전송 등 감각 지 각^5,50생물 학적 프로세스. 위에서 설명한 프로토콜 bacteriorhodopsin, TR-SFX 데이터 컬렉션의 성공을 극대화 하기 위해 설계 되었습니다 아직 다른 샘플에 데이터 수집을 최적화 하는 템플릿 역할을 할 수 있다고. 이 방법에서는, 귀중 한 beamtime의 많은 현재 막힘으로 인해 손실 또는 가난한 샘플 압출 대신 더 많은 시간 지연에 더 나은 데이터 수집에 사용 될 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
모기 LCP 주사기 커플 링	TTP labtech 상점	3072-01050
해밀턴 주사기 1710 RNR, 100 µ l	해밀턴	HA-81065
해밀턴 주사기 1750 RNR, 500 µ l	해밀턴	HA-81265
모노올레인	누첵 프렙, Inc.	M-239
7.9 MAG	Avanti 극지 지질 Inc.	850534O
50% w/v PEG 2000	분자 치수	MD2-250-7
파라핀(액체)	Sigma-Aldrich	1.07162
고속 카메라	Photron		Photron Mini AX
고배율 렌즈	Navitar		12X 줌 렌즈 시스템
3축 스테이지	ThorLabs	PT3/M
섬유 광	Thorlabs	OSL2
용융 실리카 섬유	Molex / Polymicro	TSP-505375
Lite 터치 페룰	IDEX	LT-100
ASU 고점도 인젝터	애리조나 주립 대학		Uwe Weierstall (weier@asu.edu)
HPLC 펌프	Shimadzu	LC-20AD
전자 가스 조절기	비율 공기	GP1