Osteoclast 형성과 생체 외에서 Osteoclast 선구자의 확산에 안티-c-fms 항 체의 효과

요약

이 프로토콜 포함 murine 긴 뼈와 골 절연, 골 수 세포를 생성 하 고 osteoclasts 대 식 세포 콜로 니 계수 (M-CSF) 및 핵 요인 Kappa B ligand (RANKL)의 수용 체 활성을 자극을 사용 하 여 생산의 해 부 또는 종양 괴 사 요인 알파 (TNF-α) 그리고 안티-c-fms 항 체, M-CSF 수용 체에 의해 그들의 체포.

초록

뼈는 복잡 한 프로세스 이며 그것은 증 착과 재흡수의 기간을 포함 한다. 뼈 재흡수는 뼈는에 의해 분해 osteoclasts 다른 자극에 응답에서 하는 프로세스입니다. Osteoclast 선구자 多 osteoclasts 대 식 세포 콜로 니 계수 (M-CSF) 및 핵 요인 Kappa B ligand (RANKL)의 수용 체 활성 자극에 대 한 응답으로 구분 합니다. Pathologic 조건 cytokine 프로필은 다른 염증 성 cytokines의 혼합물을 포함 한다. 종양 괴 사 요인 알파 (TNF-α) 염증 osteolysis와 관련 된 분야에서 다량에서 발견 되는 가장 중요 한 cytokines의 하나입니다. 이 프로토콜의 목적은는 murine 골 생성 M-CSF RANKL 및 안티-c-fms 항 체, 수용 체의 복용량을 증가 하 여 이후 저해 될 것입니다 TNF-α와 유도 통해 osteoclasts 하 격리 된 방법을 제공 하 M-CSF에 대 한. 이 실험 염증 뼈 재흡수의 질병 항 체 안티-c-fms의 치료 가치를 강조 한다.

서론

Osteoclasts는 고도로 전문화 된 세포, 그리고 그들은 여러 osteoclast 선구자의 융합을 통해 조 혈 줄기 세포에서 분화. 그들은 건강 한 뼈에 필수적인 고 류 마티스 관절염, 치 주 질환¹등 염증 성 osteolytic 질병와 관련 된 pathologic 뼈 재흡수에 기여.

Osteoclastogenesis 및 osteoclast 함수는 두 가지 주요 요인;에 의해 중재 (M-CSF) 비율과 핵 요인 kappa B ligand (RANKL)의 수용 체 활성을 자극 하는 대 식 세포 식민지. M-CSF와 RANKL osteoclast 차별화²중요 하다. 골 수 세포를 체 외에서 osteoclast 형성을 유도 하기 위해 표시 되었습니다 다른 요인은 종양 괴 사 요인 알파 (TNF-α)^3,,45이다. TNF-α 중재 osteoclast 형성 osteolysis⁶류 마치 스 성 관절염, 치 주 질환⁷

프로토콜

모든 동물 절차 및 동물 보호는 도호쿠 대학 규칙 및 규정에 따라 수행 했다.

1. murine Hindlimb 해 부 및 처리

1. 절 개, 앞 접시는 컨테이너의 크기에 따라 α-MEM의 약 50 mL와 함께 얼음에 배치. 모든 뼈의 해 부 완료 될 때까지이 컬렉션의 컨테이너 될 것입니다. 이 고 후속 실험, α-MEM 포함 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 100 IU/mL 페니실린 G, 및 100 μ g/mL 스 사용 합니다.
2. 5 %isoflurane 과다 복용의 흡입에 의해 C57Bl/6J 마우스를 안락사.
3. 야자수와 발 70% 에탄올으로 깨끗이 스프레이 통해 피어 싱 하는 핀을 사용 하 여 부정사 위치에 마우스를 수정.
4. 엉덩이의 수준에서 불 임 수술가 위, 핀셋을 사용 하 여 피부 절 개를 만들고 근육 노출 발까지 연장.
5. Quadriceps 근육을 연결 하는 힘 줄과 뼈에 햄 스트링 근육을 연결 하는 힘 줄을 잘라. 껍질 멀리 엉덩이 무릎 관절을 노출 하는 근육. 이 힘 줄을 찾기 부드러운 조직 태그를 떠나지 않고 그들의 첨부 파일에서 두 근육을 자유롭게 하는 것을 쉽게 것입니다. 뼈를 잘라 하지 마십시오.
6. 대 퇴 골의 머리와 ....

결과

이 프로토콜의 목적은 RANKL 또는 TNF-α, 존재 osteoclast 형성에 안티-c-fms 항 체의 효과 평가 하 고 osteoclast 선구자 확산에 M-CSF의 효과 결정 하. 이 프로토콜에서 우리는 순수 osteoclast 문화의 대량 생성 됩니다 신뢰할 수 있는 프로세스 제공. 우리는 또한 다른 문화 조건 osteoclast 형성 억제에 대 한 안티-c-fms 항 체 적당 한 농도 테스트 하는 방법 제공.

M에서 osteoclast 형성-CSF + RANKL 문화 안티-c-fms 항 체를 그림 1에 표시 됩니다. 1, 10 ng/mL 안티-c-fms 항 체, osteoclasts 제어 (0 ng/mL)에 비해 수가 크게 감소 했다. 100에서 1000 ng 안티-c-fms 항 체, osteocla.......

토론

이 연구에서 우리는 RANKL 유도 osteoclast 형성, TNF-α 유도 osteoclast 형성과 M CSF 유도 osteoclast 전조 확산에 안티-c-fms 항 체의 효과 조사. 우리는 안티-c-fms RANKL 유도 osteoclast 형성, TNF-α 유도 osteoclast 형성과 osteoclast 선구자의 M CSF 유도 확산 중 osteoclastogenesis의 억제에 대 한 항 체의 효과적인 금액은 다른 것을 발견.

RANKL 중재 osteoclastogenesis M-CSF 생체 외에서, 존재 하 고 순위 null 마우스 경험 심한 osteopetrosis¹⁵, 이렇게 RANKL은 osteoclastogenesis에 대 한 의무 cytokine 있으며 개발 osteoclasts의 실패는 뼈 항상 성에 중요 한 규제 역할입니다. 따라서, RANKL 유도 osteoclast 형성을 제어할 수 있습.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
항-c-Fms 항체			AFS98, 쥐 단클론, 항무린, c-Fms 항체(IgG2a)
TNF-&알파;			재조합 쥐 TNF-&알파; 우리 실험실에서 준비. TNF-&알파; RT-PCR에 의해 클로닝된 cDNA 단편을 pGEX-6P-I(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)로 클로닝하여 GST-융합 단백질을 생성했습니다. GST-TNF-&알파; 대장균 BL21 세포 세포(Stratagene, La Jolla, CA)에서 발현되었습니다. 세포는 비변성 조건 및 GST-TNF-알파 하에서 용해되었습니다. 글루타티온-세파로스(glutathione-Sepharose) 컬럼을 통해 정제하였다. GST는 제조업체에 의해 PreScission Protease(Amersham Biosciences)에 의해 절단되었습니다. 의 지시를 내리고 글루타티온-세파로스 컬럼에 의해 제거하였다.
RANKL	PEPROTECH	315-11	재조합 쥐 sRANK 리간드, 출처: E. coli
M-CSF			재조합 인간 M-CSF. CMG14&ndash의 1/10 권; 5x106 의 12 세포주 배양 상등액; 10cm 현탁 배양 접시에 있는 세포.
α-MEM	Wako		with L-Glutamine and phenol red
Fetal Bovine Serum	Biowest	s1820-500	Fetal Bovine Serum French Origin
Culture dish	Corning		100 mm x 20 mm 스타일 접시
96-웰 플레이트	Thermofischer Scientific		Nun clon Delta surface
Cell counting kit-8	Dojindo, Kumamoto, Japan
마이크로플레이트 리더	Sunrise REMOTE; Tekan Japan, 가와사키, 일본
셀 스트레이너	코닝		40 μ m 나일론
원심분리기 튜브	Corning		50mL CentriStar 캡
Triton X-100	Wako		폴리옥시에틸렌 (10) 옥티페닐 에테르