방법 논문

이중 가닥 RNA와 패턴 인식 수용 체 부정적인 감 RNA 바이러스 감염에의 confocal 영상

DOI:

10.3791/59095

⸱

2019년 1월 26일

 ,  , 
1Department of Pathology and Institute for Human Infections and Immunity, University of Texas Medical Branch

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA 바이러스 복제 생산 하는 이중 가닥 RNA는 타고 난 면역 반응 유도 하 패턴 인식 수용 체에 의해 인식할 수 있습니다. 부정적인 감 RNA 바이러스에 대 한 낮은 수준의 dsRNA와 호흡기 간의 상호 작용 불분명 남아 있습니다. Arenavirus dsRNA와 개별 셀에서 PRR를 시각화 하는 confocal 현미경 검사 법 방법을 개발 했습니다.

초록

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더블-좌초 (ds) RNA는 RNA 바이러스 감염 시 일차 중간으로 생산 됩니다. 호스트 패턴 인식 수용 체 (호흡기) retinoic 산 등으로 dsRNA의 인식 (장비-나) 수용 체 (RLRs) 의장 처럼-난 및 흑색 종 분화 관련 단백질 5 (MDA-5) 타고 난 면역 반응의 유도에 이르게. 형성 및 세포내 분포 긍정적인 감 RNA 바이러스 감염에서에서 dsRNA가 되었습니다 잘 특징 현미경 검사 법. 일부 arenaviruses를 포함 하 여 많은 부정적인 감 RNA 바이러스 감염 시 타고 난 면역 반응을 트리거합니다. 그러나, 부정적인 감 RNA 바이러스는 dsRNA 바이러스 성 dsRNA의 PRR 인식의 이미징 연구를 방해 하는 낮은 수준의 생산으로 생각 되었다. 또한, 감염 실험 높게 병원 성 arenaviruses 높은 견제 biosafety 수준 시설 (BSL-4)에서 수행 되어야 합니다. 높게 병원 성 RNA 바이러스에 대 한 바이러스 성 RNA와 호흡기 간의 상호 작용 크게 알려진 연구자 BSL-4 시설에서 직면 하는 추가 기술 도전 때문입니다. 최근, 단일 클론 항 체 (Mab) (클론 9D 5) 원래 팬 엔테로바이러스 감지에 사용 특히 dsRNA 전통적인 J2 또는 K1 안티 dsRNA 항 체 보다 더 높은 감도와 감지 하 발견 되었습니다. 9D 5를 이용 하 여 여기, 항 체, confocal 현미경 검사 법 프로토콜 dsRNA, 바이러스 성 단백질 및 PRR arenavirus에 의해 감염 하는 개별 셀에 동시에 시각화를 성공적으로 사용 된 설명. 프로토콜은 또한 이미징 연구 dsRNA 및 PRR 분포 BSL4 시설에서 감염 하는 병원 성 arenavirus 세포에 적합 합니다.

서론

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타고 난 면역 반응의 유도의 초기 단계는 더블-좌초 (ds) RNA retinoic 산 등 패턴 인식 수용 체 (호흡기)에 의해 호스트 인식 (장비-나) 수용 체 (RLRs) 의장 처럼-난 및 흑색 종 분화 관련 단백질 5 (MDA-5)1. 긍정적인 감 RNA 바이러스, dsRNA 수 있습니다 일반적으로 쉽게 감지가 J2 또는 K1 안티 dsRNA 단일 클론 항 체 (Mab)2를 사용 하 여. DsRNA와 호흡기 간의 상호 작용 picornavirus, 같은 긍정적인 물가 RNA 바이러스에 confocal 현미경 검사 법3을 사용 하 여 특징 되었습니다 했다. 그러나, 부정적인 감 RNA 바이러스에 대 한 시각화 및 PRR 및 dsRNA 상호 작용의 특성은 되었습니다 의해 방해 dsRNA에 중요 한 항 체의 부족. RNA 형광 제자리 교 잡 (물고기) 바이러스 성 RNA와 호흡기4의 시각화에 적용 되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, 물고기 방법론 대상 RNA 시퀀스의 지식이 필요 하 고 PRR 공동 얼룩과 호환 되지 않을 수 있습니다. 최근, 9D 5는 원래 팬 엔테로바이러스 감염의 진단에 대 한 개발, Mab 발견 됐다 J2 Mab 보다 더 예민 하 고 쉽게 수 부정적인 감 RNA 바이러스 감염5,6에서 dsRNA를 감지. 따라서, Mab 9D 5 소설과 바이러스 성 복제 및 PRR 부정적인 감 RNA 바이러스에 대 한 바이러스 성 RNA의 상호작용 연구에 유용한 도구 이다.

Arenaviruses는 Lassa 바이러스 (LASV), Junín 바이러스 (JUNV)와 Machupo (MACV), 인간7에서 심각한 출혈 질병의 원인이 그 같은 여러 인간 병원 체를 포함 하는 단일 가닥, 부정적인 감 RNA 바이러스의 가족입니다. 임상 데이터로 새로운 세계 arenavirus JUNV에 의해 발생 하는 아르헨티나 출혈의 심각 하 고 치명적인 경우 혈 청 IFN-α8,9의 비정상적으로 높은 수준의 전시. 우리 병원 성 NW arenaviruses (JUNV, MACV), 하지만 하지는 병원 성 올드 월드 arenavirus, LASV, 유도 종류 것으로 나타났습니다 내가 인간 monocyte 파생 된 모 수석 세포10인터페론 (IFN) 응답. 또한, 장비-센서 중 하나입니다 중재 유형 I IFN 응답 JUNV 감염 세포11. 우리는 또한 전통적으로 dsRNA 인식에 대 한 알려져 있다는 단백질 키 니 아 제 R (PKR) 수용 체 병원 성 NW arenavirus 감염12활성화 됩니다 발견. 더 arenavirus 감염 시 바이러스 관련 IFN 응답의 메커니즘을 이해, 우리는 바이러스 성 dsRNA와 세포질 호흡기 간의 상호 작용을 시각화 하기 위해 프로토콜을 개발 목적.

병원 성 JUNV, MACV 및 LASV 감염 실험 biosafety에서 수행 되어야 하는 레벨 4 (BSL-4) 시설. 따라서, 뿐만 아니라 arenavirus 감염에 dsRNA의 아마도 낮은 수준 biosafety 요구 사항을 충족입니다 다른 기술 도전이 높게 병원 성 바이러스에 대 한 이미징 연구를 수행할 때. 9D 5를 이용 하 여 항 체와 JUNV의 Candid1 # 백신 긴장, confocal 현미경 검사 법 기반 프로토콜은 dsRNA, 바이러스 성 단백질 및 PRR에 arenavirus에 의해 감염 된 세포에 동시에 시각화를 성공적으로 사용 된이 보고서에 설명 BSL2 실험실입니다. 프로토콜 또한 세포내의 분포 dsRNA와 PRR BSL4 시설에서 병원 성 arenavirus 감염 시의 시각화를 위해 적당 하다.

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프로토콜

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1. 준비 A549 세포 및 JUNV 감염의

  1. 폴 리-D-리 (PDL)에 시드 2 x 105 인간 폐 상피 A549 세포 감염 이전 24 시간에 유리 coverslips 12-잘 접시에 코팅.
  2. JUNV13 감염 (MOI)의 곱셈에서의 150 mL의 aliquots 단위를 형성 하는 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 미디어 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린과 스 (P/S 보충에 희석 셀당 1.0 플 라크의 준비 ).
  3. 세포 배양에서 미디어를 제거 합니다. 각 잘 포함 coverslip에 바이러스 inoculum을 추가 하 고 37 ° c.에 1.5 h에 대 한 품 어 접시 마다 15 분 흔들.
  4. 제거 바이러스 inoculum DMEM 5 %FBS 1 %P 보충의 1 mL을 추가/미 품 어 원하는 시간 지점에 대 한 37 ° C에서 접시.

2. 고정 및 immunostaining

  1. 미디어 발음 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 칼슘과 마그네슘을 각 영역 보충의 1 mL을 추가 하 여 셀을 씻어.
  2. PBS를 제거 합니다. 사전-20 ° C에서 냉장 메탄올 (MeOH)의 1 mL을 추가 하 고 15 분을 위한 드라이 아이스 또는-20 ° C에서 품 어.
  3. MeOH를 제거 합니다.
  4. 1 mL PBS의 각 음을 추가 하 고 부드러운 락을 5 분으로 4 ° C에서 워시 샘플 총 4 번의 세척을 반복.
  5. 0.2 %t-octylphenoxypolyethoxyethanol 부드러운 락와 4 ° C에서 5 분의 1 mL에 coverslips에 고정 된 세포를 씻어.
  6. 각 우물에 PBS의 1 mL를 추가 합니다. 부드러운 락으로 5 분 동안 4 ° C에서 샘플을 씻으십시오. 총 4 번에 대 한 세척 단계를 반복 합니다.
  7. DsRNA와 MDA5를 검출, 3% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)에 희석 하는 주 항 체의 200 mL에 샘플을 품 어. 1:2 희석에 안티-dsRNA 9D 5 항 체를 희석 하 고 1: 250에서 안티-MDA-5 항 체 희석. 부드러운 락을 4 ° C에서 하룻밤 함께 품 어.
  8. 1 차 항 체를 제거 하 고 각을 씻어 부드러운 실시간 반복에서이 워시 4 번 더 락을 5 분에 대 한 PBS의 1 mL와 잘.
  9. 200ml 2 차 항 체 (1:2, 000 희석)의 3 %BSA 희석을 추가 하 고 1 시간에 대 한 RT에서 품 어.
  10. 2 차 항 체를 제거 하 고 각을 씻어 부드러운 실시간 반복에서이 워시 4 번 더 락을 5 분에 대 한 PBS의 1 mL와 잘.
  11. JUNV nucleoprotein (NP)를 감지 하 고 장비-, 추가 3 %BSA 희석 활용 된 항 체의 200 mL. 1:1,000에서 활용 된 안티-JUNV NP (AG-12)을 묽 게 하십시오 그리고 부드러운 락 RT에서 h 2에 대 한 샘플을 품 어. 활용 된 안티-RIG-나 항 체 1: 500에 희석 하 고 부드러운 락으로 하룻밤 4 ° C에서 품 어.
  12. 활용 된 항 체를 제거 하 고 각을 씻어 부드러운 실시간 반복에서이 워시 4 번 더 락을 5 분에 대 한 PBS의 1 mL와 잘.
  13. 실시간에 부드러운 락으로 3 분 DAPI (1:1, 000)와 coverslips counterstain
  14. 워시는 coverslips 3 번, 실시간에 부드러운 락으로 0.5 %t-octylphenoxypolyethoxyethanol의 1 mL에 5 분 동안 각 시간
  15. 실시간에 부드러운 락 각 시간 5 분에 대 한 PBS의 1 mL에 두 번 씻으십시오
  16. DdH2O RT, 부드럽게 락에 1 분의 1 mL에 한 번 씻어.
  17. 설치 미디어를 사용 하 여 유리 슬라이드에 coverslips를 탑재 합니다. 하룻밤 사이 치료 하자.
  18. 매니큐어와 슬라이드를 밀봉 하 고 1 시간 동안 건조 공기.
  19. 60 x confocal 현미경 이미지 / 1.42 숫자 조리개 기름 침수 렌즈 같은 레이저 방사를 사용 하 여 각 샘플에 대 한.
  20. 필요한 경우 데이터를 분석, 밝기 및 대비 모든 샘플에 대 한 동일한 선형 조정을 사용 하 여 조정을 합니다.

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결과

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이 프로토콜 배포 및 colocalization는 RLRs 사이 연구에 적용 된 (장비-어 MDA-5) 및 JUNV에 감염 된 세포에 dsRNA. 그림 1 과 그림 2에서 같이, dsRNA의 축적 바이러스 감염 진행으로 시간이 지남에 따라 증가 합니다. MDA-5 (그림 1) 및 장비를 집중-(그림 2) 신호는 NP의 dsRNA punctate 구조와 colocalized 발견 했다.

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그림 ...

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토론

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긍정적인 감 RNA 바이러스 및 dsDNA 바이러스, dsRNA J2 안티 dsRNA 널리 사용 항 체로 쉽게 검색 됩니다. 그러나, 부정적인 감 RNA 바이러스는 dsRNA 동일한 항 체2를 사용 하 여 감지 수준 이하로 낮은 생산 하는으로 추정 된다. 따라서, 바이러스 성 RNA 및 PRR 상호 작용의 여러 측면 크게 부정적인 감 RNA 바이러스에 대 한 명확 하지 않다. 우리는 dsRNA J2 항 체를 사용 하 여 arenavirus 감염에 대 한 얼룩 하려고 했지만 형광 신호 모의 감염에 비해 미분 가능 했다. Mab 9D 5, 원래 팬 엔테로바이러스 검색에 사용 되는 dsRNA에 대 한 구체적이 고 J2 항 체5보다 더 중요 한 것을 발견 되었다. 이 항 체는 부정적인 감 RNA 바이러스 감염, 프로토 타입 arenavirus 림프 choriomeningitis 바이러스5,...

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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우리는 UTMB 이미징 핵심 시설과 Maxim Ivannikov 현미경 지원에 감사 하 고 싶습니다.

이 작품은 공중 보건 서비스에 의해 지원 되었다 RO1AI093445 및 RO1AI129198 및 수 여에 SP, UTMB 지 펀드 P84373 채널, T32 AI007526 그들을 부여.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
APEX Alexa Fluor 647 항체 라벨링 키트InvitrogenA10475
BSASigma AldrichA4503
DAPICell Signaling40831:1,000 희석
당나귀 토끼 Alexa Fluor 594InvitrogenA-110581:2,000 희석; Lot #: 1454437
Dulbecco의 변형된 독수리 매체Corning10-013-CV
Fetal Bovine SerumAtlanta BioS11150
유리 현미경 슬라이드Fisher12-550-15
염소 안티 마우스 Alexa Fluor 488InvitrogenA-110291:2000 희석; Lot #: 1874804
인간 폐 상피 A549 세포ATCCCCL-185
메탄올피셔A412-20 °에 저장; C
마우스 MAb anti-JUNV NPBEINA05-AG121:1,000 희석으로 Alexa-647에 접합
마우스 MAb pan-Enterovirus 9D5 시약Millipore Sigma3361사용 준비; 1:2로 희석; Lot #: 3067445
PBS 보충 Ca 및 MgCorning21-030-CV
PDL 코팅 커버 슬립NeuvitroH-12-1.5-pdl
ProLong Gold antifadeInvitrogenP10144
Rabbit MAb MDA-5Abcamab1266301:250 희석; Lot #: GR97758-7
재조합 Candid#1 균주 JUNVLab 생성Lab 생성 이전에참고 문헌 13에서 설명한 바와 같이 생성됨.
Santa Cruzsc-376845에 활용된 RIG-I 마우스 MAb; 로트 #: AO218
트리톤 X-100시그마 알드리치T8787 
Alexa-594 1:1000 희석

참고문헌

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  1. Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
  2. Weber, F., Wagner, V., Rasmussen, S. B., Hartmann, R., Paludan, S. R. Double-stranded RNA is produced by positive-strand RNA viruses and DNA viruses but not in detectable amounts by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 80, 6(2006).
  3. Triantafilou, K., Vakakis, E., Kar, S., Richer, E., Evans, G. L., Triantafilou, M. Visualisation of direct interaction of MDA5 and the dsRNA replicative intermediate form of positive strand RNA viruses. Journal of Cell Science. 125, 4761-4769 (2012).
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  12. Huang, C., Kolokoltsova, O. A., Mateer, E. J., Koma, T., Paessler, S. Highly pathogenic new world arenavirus infection activates the pattern recognition receptor protein kinase R without attenuating virus replication in human cells. Journal of Virology. 91, 20(2017).
  13. Emonet, S. F., et al. Rescue from cloned cDNAs and in vivo characterization of recombinant pathogenic Romero and live-attenuated Candid#1 strains of Junin virus, the causative agent of Argentine hemorrhagic fever disease. Journal of Virology. 85 (4), 1473-1483 (2011).
  14. Child, S. J., et al. Antagonism of the protein kinase R pathway in human cells by Rhesus Cytomegalovirus. Journal of Virology. 92, 6(2018).
  15. Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).

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