Method Article

효 모 신경 Proteinopathy 모델에서 특성화 히스톤 포스트 번역 상 수정 변경

DOI:

10.3791/59104

⸱

March 24th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Chemistry Department, Brooklyn College, 2Ph.D. Program in Biochemistry, Graduate Center of the City University of New York, 3Ph.D. Program in Chemistry, Graduate Center of the City University of New York, 4Ph.D. Programs in Chemistry, Biochemistry, and Biology, Graduate Center of the City University of New York

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜의 히스톤 포스트 번역 상 수정 (PTM) ALS와 파 킨 슨 병에 관련 된 단백질의 overexpression 관련 하 여 발생 하는 수준에서 게놈 넓은 변화 하는 실험 절차 설명 Saccharomyces cerevisiae 모델입니다. SDS 페이지 분리 후 개별 히스톤 PTM 수준은 통해 서 부 럽 수정-특정 항 체와 검색 됩니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

신경 퇴행 성 질환, 파 킨 슨 병 (PD), 루 경화 증 (ALS) 등 생활 매년 수천의 수백의 손실. 효과적인 치료 옵션 수 질병의 진행을 중단 하는 부족. 대형 환자 집단에서 광범위 한 시퀀싱 노력에도 불구 하 고 대부분의 ALS 및 PD 경우 혼자 유전자 변이 의해 설명할 수 없는 남아 있습니다. Epigenetics 메커니즘, 히스톤 단백질의 포스트 번역 상 수정 같은 신경 퇴행 성 질환 병 인 및 진행에 관련 되어있을 수 있습니다 고 제약 개입에 대 한 새로운 목표. ALS와 PD의 포유류 vivo에서 그리고 생체 외에서 모델은 비용이 많이 드는 연장과 힘 드는 실험 프로토콜 요구. 여기, 우리는 게놈 넓은 변경 Saccharomyces cerevisiae 를 사용 하 여 모델 시스템으로 하는 히스톤 수정 레벨을 결정 하는, 빠르고, 실용적이 고 비용 효율적인 접근을 개설 한다. 크게의 우리의 지식을 확대 하는 동안 다른 모델 시스템에서 이전 연구 결과 확증 신경 proteinopathies에 연결 하는 epigenetic 변화에 포괄적인 수사를 위해이 프로토콜을 사용 하는 신경 퇴행 성 질병 epigenome입니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

신경 퇴행 성 질환 거의 아무 치료 옵션을 사용할 수 있는 치명적인 질병이 있습니다. 이러한 가운데, 루 경화 증 (ALS) 및 파 킨 슨 병 (PD)는 특히 무서운. ALS와 PD의 경우의 약 90% 산발적, 나머지 경우 가족에서 실행 하 고 일반적으로 특정 유전자 돌연변이1,2에 연결 하는 동안, 질병의 가족 력이 없이 발생으로 간주 됩니다. 흥미롭게도,이 질병의 두 단백질 mislocalization 및 집계3,4,,56와 연결 됩니다. 예를 들어, 육 (FUS)에 융합 및 타르 DNA 묶는 단백질 43 (TDP-43)는 세포질에 mislocalize ALS7,,89,10에서 집계 하는 RNA 의무적인 단백질 11,12, α-synuclein는 배치할 PD5,13,,1415Lewy 몸 불리의 원리 구성 요소.

대형 환자 집단에서 광범위 한 게놈 넓은 협회 노력에도 불구 하 고 압도적인 대부분의 ALS 및 PD 경우 남아 설명할 수 없는 유전자. Epigenetics는 신경 질환에 역할을 할 수 있습니다.? Epigenetics는 원본 DNA 시퀀스16변경 없이 발생 하는 유전자 발현에서 변화 구성 되어 있습니다. 주요 epigenetic 메커니즘 히스톤 단백질16의 포스트 번역 상 수정을 (PTMs)를 포함 한다. 진 핵 세포에서 유전 물질 염색 질으로 단단히 싸여 있다. Chromatin의 기본 단위는 DNA는 히스톤 octamer 감싸의 146의 기본적인 쌍의 구성 된 nucleosome 히스톤 (2 부 각 히스톤 H2A, H2B, H3, H4)17의 4 쌍의 구성입니다. 각 히스톤이 있다 N 맨끝 꼬리는 nucleosome 중 돌출 하 리 신과 아르기닌 잔류물18에 일반적으로 다양 한 화학 moieties의 추가 의해 수정할 수 있습니다. 이러한 PTMs 이므로 동적, 그들은 쉽게 추가 될 수 있습니다 및 제거, 그룹 acetylation, 메 틸 화, 인 산화 등을 포함. PTMs transcriptional 기계, DNA의 접근을 제어 하 고 따라서 제어 유전자 식18도움. 예를 들어 histone acetylation 매우 기본적인 히스톤 단백질 및 유전자 더 액세스할 수 acetylated 히스톤에 의해 포장 수 있도록 부정 청구 DNA 등뼈 사이 정전기 상호 작용의 힘을 감소 따라서 매우 19를표현 했다. 최근에, 특정 히스톤 PTMs 및 그들의 조합의 놀라운 생물 특이성 히스톤 코드 가설20,21 어떤 단백질에서을 작성, 삭제, 및 읽기 히스톤 PTMs 모든 콘서트에서 행동을 주도하 고 있다 유전자 발현 조절

효 모 neurodegeneration 공부에 매우 유용한 모델 이다. 중요 한 것은, 많은 신경 세포 통로 인간22,,2324누 룩에서 보존 됩니다. 효 모 세포 독성 고기 및 FUS, TDP-43, 또는 α-synuclein22,,2324,,2526의 overexpression에 단백질 포함 정리. 사실, ALS의 Saccharomyces cerevisiae 모델 인간27에서 유전 위험 요소를 식별 하기 위해 사용 되었습니다. 또한, 인간의 α-synuclein ameliorate α-synuclein 독성 신경28,29druggable 대상으로 Rsp5 네트워크의 특성에 대 한 허용 overexpressing 효 모.

여기, 우리가 Saccharomyces cerevisiae 신경 proteinopathies (그림 1)과 관련 된 게놈 넓은 히스톤 PTM 변화를 감지를 악용 하는 프로토콜을 설명 합니다. S. cerevisiae 의 사용 때문에 그것의 사용의 용이성, 저렴 한 비용과 속도 neurodegeneration의 다른 시험관 및 동물 모델에 비해 매우 매력적 이다. ALS와 PD 모델22,23,,2526개발 이전 활용, 우리 인간의 FUS, TDP-43, 및 효 모에 발견된 고유 히스톤 PTM 변화에서 발생 하는 α-synuclein overexpressed 있다 각 proteinopathy30와 연결입니다. 우리가 여기에 설명 하는 프로토콜은 데이터 분석에 변환에서 2 주 미만에 완료할 수 있습니다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 신경 proteinopathy 관련 단백질 구조와 S. cerevisiae 변형

  1. 효 모 추출 물 펩 포도 당 (YPD) 국물 (200 rpm) 30 ° c.에 떨고 함께 하룻밤에 야생 타입 (WT) 303 효 모 성장
  2. 12−16 h의 성장, 후 희석 효 모 600에서 광학 밀도 YPD와 0.25 nm (OD600). 효 모 액체 문화 10 mL 각 변환에 대 한 필요 하 게 됩니다, 효 모 액체 문화 50 mL 해당 FUS, TDP-43, synuclein, a 벡터만 (ccdB) 구조, 뿐만 아니라 부정적인 컨트롤 변환 하는 5 개의 변환 준비 없이 DNA.
  3. OD600 0.60와 0.80 사이이 때까지 30 ° C에서 동요와 효 모 성장. 이 일반적으로 4−6 h를 걸립니다.
  4. 30 분 전에 효 모 성장 완료, 선형화 플라스 미드 구조.
    참고: 플라스 미드 구문을 여기에 사용 되는 게놈에 직접 통합 해야 하며 따라서 선형화 필요 변환 전에.
    1. 계산 플라스 미드의 볼륨 금액 1 µ g 합니다. 빼기가이 볼륨 nuclease 무료 H2O 필요의 양을 계산 하 44 µ L에서 합니다.
    2. Microcentrifuge 튜브를 nuclease 무료 H2O, 10 x 제한 효소 버퍼 (자료 테이블)의 5 µ L, NheI 제한 효소 (자료 테이블)의 1 µ L 및 플라스 미드 (에서 계산된 단계 1.4.1)의 적절 한 금액을 추가 합니다. 아래로 pipetting으로 철저 하 게 혼합 하 고 15 분 동안 37 ° C에서 품 어. 플라스 미드는 이제 선형화 및 준비 변환입니다.
  5. 효 모 후 문화 0.6-0.8, 50 mL 원뿔 튜브에 스핀 아래로 3 분 삭제 상쾌한 4 ° C에서 850 x g 에서 수확 셀의 OD600 에 도달합니다.
  6. 살 균 H2O 3 분 삭제 상쾌한에 대 한 850 x g 4 ° C에서 원심 분리기의 10 mL에 셀 펠 릿을 세척. 총 4 개의 세척의 3 배를 반복 합니다.
  7. 3 세척의 시작에서 해 동 하 고 연어 정자 DNA가 열 블록에 5 분에 대 한 변환 반응 당 10 µ L를 끓여.
  8. DH2O 변환 당 100 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 microcentrifuge 튜브의 적절 한 수로 분할. 5 변환, dH2O의 500 µ L에 펠 릿을 resuspend 하 고 5 별도 microcentrifuge 튜브로 균등 하 게 분할 합니다.
  9. 실 온 (RT)에서 850 x g 에 5 분 동안 centrifuge 고 모든 나머지 물을 제거 합니다.
  10. 다음과 같은 순서로 살 균 H2O, 240 µ L의 50% 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG), 1 M LiAc, 연어 정자 DNA의 10 µ L, 선형화 플라스 미드 DNA의 20 µ L (또는 nuclease 무료 물 없는 DNA 컨트롤 변환에 대 한)의 36 µ L의 50 µ L를 추가. 믹스 철저 하 게 각 추가 소용돌이 후 간단히 모든 변환 구성 요소를 추가한 후.
  11. 20 분 동안 42 ° C에 변화 반응을 품 어.
    참고: 더 일관 된 온도 제어를 위한 물 욕조에이 부 화를 실시 합니다.
  12. 470 x g RT에 대 한 5 분 삭제 상쾌한에 centrifuge 및 살 균 H2o.의 200 µ L에서 각 셀 펠 릿 resuspend
  13. 효 모 현 탁 액 선택적 미디어 접시에 접시 및 롤링 구슬 또는 스프레더 확산. 30 ° c.에 2−3 일에 대 한 번호판을 품 어
    참고: 합성 정의 (SD)-여기에서 설명 하는 플라스 미드에 사용 되는 그의 접시.

2. 측량 식민지 성장 억제 및 글리세롤 주식에 저장

  1. 2% 유 보충 선택적 미디어의 5 mL에 변환 격판덮개에서 단일 식민지 접종 30 ° C에서 통에 밤새 껏 증가 한다. 변환 당 적어도 12 식민지를 선택 합니다.
    참고: 없음 식민지 "DNA" 변환 제어 접시에 예상 된다.
  2. 핀-frogger 불타는 다음 에탄올 소독.
  3. 각 문화는 96 잘 접시의 첫 번째 행에서 포화 세포 현 탁 액의 aliquot 100 µ L에 대 한. 인접 한 잘 열의 모든 스에서 살 균 H2O의 200 µ L를 추가 합니다. 1:5 직렬 희석에 대 한 멀티 채널 피펫으로 뒤에 인접 한 열에 첫 번째 열에서 50 µ L을 추가 합니다. Pipetting으로 철저 하 게 혼합. 다음 50 µ L 두 번째 열에서 세 번째 열과 혼합 하 여 추가 pipetting 합니다. 이 접시의 나머지 부분에 대 한 반복 합니다.
  4. Frogger 96 잘 접시에 놓고 다음 눌러 부드럽게 하 고 균등 하 게 내려와 갈 락 토스 없이 선택적 미디어 접시에 스탬프 플레이트 효 모. 2−3 일 30 ° C에서 품 어.
    참고: SD-그의 SGal 그의 접시는 여기에서 설명 하는 플라스 미드 사용 됩니다.
  5. FUS, TDP-43, 그리고-synuclein 변환, 갈 락 토스의 대부분 성장 억제를 표시 하는 식민지를 식별 합니다. SD-그의 격판덮개에서이 식민지를 선택 하 고 선택적 미디어 하룻밤 성장 위한 2% 유 보충의 10 mL에 접종. 벡터 제어에 대 한 갈 락 토스의 존재 없는 성장 억제를 표시 하는 식민지를 선택 하십시오.
  6. 글리세롤 주식 준비, 50% 글리세롤의 0.5 mL와 포화 액체 문화의 0.5 mL을 결합. 아래로 pipetting으로 혼합 하 고-80 ° c.에 동결
    참고 사항: 글리세롤 주식 저장할 수 있습니다-80 ° c.에서 1 년까지

3. 신경 proteinopathy의 overexpression S. cerevisiae 에서 단백질 관련

  1. 냉동된 글리세롤 주식, 히스티딘, 효 모 다시 행진에서 2% 포도 당 한 천 선택적 미디어 격판덮개 그리고 2−3 일 30 ° C에서 품 어.
  2. Overexpression 모델 및 제어 2% 유 보충 히스티딘 선택적 액체 미디어의 5 ml에서의 각 단일 식민지를 예방. 하룻밤에 30 ° C (200 rpm)를 떨고 함께 성장.
  3. 액체 문화의 100 mL의 overexpression 모델과 컨트롤 각각에 대 한 성장 (FUS, TDP-43, 및 벡터 제어;-synuclein 및 벡터 제어).
    1. 2% 갈 락 토스와 보완 하는 선택적 미디어에서 문화의 100ml 준비 합니다.
    2. OD600 의 숙박 문화를 측정 하 고 하룻밤 문화의 시작 OD600 0.3의 overexpression 문화를 렌더링 하는 데 필요한 금액을 계산. 일반적으로, 야간 문화 0.9−10, 약 5 mL 100 mL 신선한 문화의 시작을 하룻밤 문화 요구의 OD600 에 도달 한다.
    3. 5 h (FUS 및 TDP-43) 또는 8 h (-synuclein) 30 ° c.에 떨고와 갈 락 토스 미디어 (3.3.1 단계 참조)에 효 모 성장 하 여 단백질 overexpression를 유도
  4. 유도 기간의 끝에 각 문화권의 OD600 를 측정 합니다. OD600 최소값을 모든 셀 수를 표준화. 4 ° c.에서 5 분 동안 850 x g 에서 centrifuging 여 50 mL 튜브에 문화를 수확 상쾌한을 삭제 합니다.
    참고: 경우 유도의 끝에 측정 된 OD600 값 0.654 0.984, 각각,-synuclein 문화 100 mL 및 100 mL의 제어 문화, 95 mL-synuclein 문화 및 제어 문화의 67.1 mL 수확.
  5. 살 균 dH2O 성장 문화의 모든 10 ml의 1 mL에 펠 릿을 resuspend. Aliquoting 셀 물의 resuspension의 1 mL microcentrifuge 튜브에 의해 펠 릿을 균등 하 게 분할 합니다. 예를 들어 100 mL의 문화에서 시작 해 서, 살 균 dH2O 10 mL에 펠 릿을 resuspend 그리고 10 microcentrifuge 튜브로 그것을 분할.
  6. 4 ° C에서 5 분 동안 850 x g 에서 centrifuge 다음 상쾌한을 제거 합니다. 스냅 액체 질소와-80 ° c.에 게에 셀 펠 릿을 동결
    참고: 셀 펠 릿 저장할 수 있습니다-80 ° C에서 최대 1 년.

4. 세포 세포의 용 해 및 히스톤 포스트 번역 상 수정을 검출 하 부 럽

  1. 세포 세포의 용 해
    1. 효 모 세포 알갱이 얼음에 녹여와 dH2o.의 100 µ L에서 셀 펠 릿 resuspend
    2. 셀 물의 resuspension를 0.2 M NaOH의 300 µ L 2-mercaptoethanol의 20 µ L을 추가. 아래로 pipetting으로 resuspend.
    3. 10 분 동안 얼음에 셀을 품 어 고 다음 30 탁상 원심 분리기에 3200 x g 에서 원심에서 실시간 삭제 상쾌한 s.
    4. 염료와 10 분이 열 블록에 대 한 종 로드 x 1의 100 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend.
      참고: 로드 염료 x 6에 대 한 제조 법 재료의 테이블에서에서 찾을 수 있습니다.
  2. 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 그리고 막 전송
    1. 두 젤 젤 홀더 및 충전 내부 챔버에 버퍼를 실행 하 고 2-젤 라인 마크를 외부 챔버를 작성 상단에 배치 하 여 젤 챔버를 준비 합니다.
    2. 10 잘 12 %polyacrylamide 젤으로 잘 당 4.1.4 단계에서 15 µ L의 샘플을 로드 합니다. 단백질 사다리 레인 5 µ L 로드.
    3. 150 V, 또는 젤의 하단에 도달 하면 염료 전면 로드 될 때까지 약 45 분 젤을 실행 합니다.
    4. 젤을 실행 하는 동안 전송 버퍼 (자료 테이블)에 (젤 당 2) 섬유 패드를 몸을 담글 하 고 메탄올에 polyvinylidene 불 소 (PVDF) 멤브레인을 몸을 담글 하 여 막 전송을 위해 준비 합니다. 전송 하기 전에 전송 버퍼에 막을 헹 구 십시오.
      참고: PVDF 막 젤의 크기에 절단 해야 하 고 전송 되는 모든 젤 한 PVDF 막 사용 합니다.
    5. 조립, 세미 드라이 전송 장치 셀에 전송 '샌드위치': 하단 전극에서 장소 (1) presoaked 섬유 패드, (2) presoaked 및 씻어 서 PVDF 막, (3) 단계의 4.2.3, 젤 및 (4) 두 번째 presoaked 섬유 패드.
      참고: 전송 '샌드위치'에 공기 방울을 피하기 위해 있는지 확인 부드럽게 '샌드위치' 거품 밖으로 강제로 serological 피펫으로 롤. 일단 젤 PDVF 막 위에 배치 되었습니다, 그것을 이동 하지 않도록 확인 합니다.
    6. 단백질 전송 150 파워 팩을 설정 하 여 수행 (1 ' 샌드위치')에 대 한 1 시간 mA.
  3. 히스톤 PTMs 수정 특정 항 체를 검출
    1. 전송 장치에서 멤브레인을 제거 합니다. 짧게 dH2O. 린스
      1. 필요에 따라 작은 플라스틱 상자에서 막 커버 하 고 30−60 s. 제거 Ponceau S에 대 한 부드러운 떨고와 RT에 잠복기 얼룩 배경 얼룩 때까지 지명 타자2O로 씻어 충분히 Ponceau S 얼룩을 붓는 의해 Ponceau S 얼룩과 단백질의 전송 확인 사라집니다 및 단백질 밴드 육안으로 볼 수 있습니다. DH2O 린스 모든 얼룩 막에서 제거 될 때까지 계속 합니다.
    2. 작은 얼룩 상자에서 막 tris 버퍼 염 분 (TBS) 블로킹 버퍼 (테이블의 재료)과 함께 부드러운 락와 RT에 1 시간을 위한 얼룩을 배양 하 여 차단 합니다. 충분 한 차단 버퍼를 사용 하 여 얼룩을 커버.
      참고: 배치 막 직 립 착 색 상자에서 그렇게 막 쪽에 단백질 거짓말 하지 향하게 주의 해야 합니다.
    3. 품 어 하룻밤 4 ° c.에 효 모 쪽으로 반응 한 히스톤 수정 특정 항 체와 착 상자에 오 점 제조업체 사양에 따라 TBS 블로킹 버퍼에서 항 체 희석. 또한 안티 총 H3 수정 특정 항 체에서 다른 호스트 종에서와 같은 적절 한 핵 로드 컨트롤을 포함 합니다. 예를 들어, 토끼에서 안티-H3S10ph 항 체와 H3S10ph에 대 한 탐색 하는 경우 로드 컨트롤 마우스에서 안티 총 H3 항 체를 사용 합니다. 필요에 따라 모든 오 점을 위해 이것을 반복 합니다.
      참고: 항 체 희석 한 달에서 세 번의 총 다시 수 있습니다. 4 ° c.에서 그들을 저장합니다
    4. 막 4 워시 x 집 만든 TBS + 0.1% 폴 20 (TBST) 실시간에서 락으로 5 분
    5. 제조 업체 지정 된 희석 (당나귀 안티 토끼 680와 당나귀 안티 마우스) 실시간에서 1 h에서 형광 이차 항 체와 오를 품 어
      참고: 보조 형광 항 체 보호 되어야 합니다에서 저장 및 사용 하는 동안. 어두운 플라스틱 상자에서 인큐베이션을 카 리 또는 알루미늄 호 일 커버.
    6. 막 4 워시 x TBST 가진 5 분을 실시간에 락 하는 동안 5 분 TBS로 세척
    7. 형광 서쪽 오 점 2 분에 대 한 시스템 이미징에 시각화 오 시각화 안티 토끼 680와 반대로 마우스 800 2 차 항 체는 800 nm와 700 nm 채널, 각각.
      참고: 복제는 독립적으로 실시 하지 섹션 1에서에서 시작 합니다. 그것은 항 체 신호 응답은 신호 응답은이 실험에서 적절 한 데이터 해석에 대 한 선형 범위 이내 인지 확인 해야 합니다.

5. 데이터 분석 및 통계

  1. 오픈 이미지 이미징 소프트웨어 (자료 테이블)에서 오 점입니다. 프레임 분석 모드에서 밴드 사각형을 그려서 벡터 제어, TDP-43, FUS (또는 벡터 제어 및 synuclein) 수정 특정 밴드 샘플의 원시 밀도 취득 합니다.
  2. 컨트롤 밴드를 로드 하기 위한 5.1 단계를 반복 합니다.
    참고: 있을 것 이다는 로드 제어 밴드와 각 샘플에서 수정 특정 밴드.
  3. 벡터 제어 샘플에서 해당 밴드의 밀도 의해 각 밴드를 나누어 수정 특정 밴드의 상대 밀도 계산 합니다. 이 데이터는 벡터 제어를 정규화합니다.
  4. 로드의 상대 밀도 계산 해당 로드의 밀도 의해 각 밴드를 나누어 컨트롤 밴드 벡터 제어 샘플에서 컨트롤 밴드.
  5. 로드의 상대 밀도 통해 수정 특정 밴드의 상대 밀도 분할 하 여 각 밴드의 조정된 상대 밀도 계산 각 샘플에 대 한 컨트롤 밴드. 이제, 데이터 히스토그램 형태로 구상 될 수 있다.
    참고: 처리의 용이성, 단계 5.3-5.5 스프레드시트 (보충 파일)에서 할 수 있습니다.
  6. 중요성에 대 한 구분으로 후 여러 독립 복제, 두 개의 샘플 및 적절 한 proteinopathy 사이 실행된 웰 치의 T-테스트 모델 (FUS 대 제어, TDP-43, 대 제어 및 제어-synuclein 대) p = 0.05 .

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 방법을 설명 하기 위해 우리는 최근에 출판 된 결과30의 활용 것입니다. 동안 WT α-synuclein는 8 h overexpressed WT 인간의 FUS 및 TDP-43 5 h overexpressed 했다. CcdB 구문 벡터 부정적인 제어로 사용 되었다. 그림 2 는 고체와 액체 문화에서 성장 억제를 보여준다. 효 모는 설명 된 대로 수확 했다 하 고 수행한 수정-특정 항 체로 서 부 럽. 반대로 총 H3 로드 제어로 사용 되었다. H3S10ph와 H3K14ac의 수준에서 크게 감소 FUS overexpression 모델 (그림 3ab)에서 분명 하다. 나타나지 않으면에 FUS TDP-43 overexpression 모델 또는 α-synuclein overexpression 모델 ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 설명 된 프로토콜의 게놈 넓은 히스톤 PTM 변화 신경 proteinopathies 연관 분류, 편법, 간단 하 고 비용 효율적인 방법을 제공 합니다. 그러나 거기에 다른 모델의 ALS 및 PD, 등 생체 외에서 인간 세포 선 및 murine 모델32, S. cerevisiae 남아 사용의 용이성 때문에 매력적인. 예를 들어, 효 모 모델 살 균 후드의 사용을 요구 하지 않습니다 없으며 그들은 필요로 할 교육 집중 셀 문화 작업 함께 간다. 또한, 효 모 배양에 대 한 시 약 포유류 세포 배양 공급 보다 훨씬 더 저렴 한 있습니다. 효 모 모델 공개 도메인 결정 단백질 집계22,23,,2425,

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리 기술 Royena Tanaz, Huda 유세 프 및 Sadiqa Taasen 감사합니다. 우리는 시 약 및 자당 튜닝 실험의 디자인에서 지적 도움의 관대 한 제공에 대 한 교수 제임스 짧은에 매우 감사. 효 모 플라스 미드 교수 아론 Gitler (303 Gal FUS;를 포함 하 여에서 관대 한 선물을 했다 Addgene 플라스 미드 # 29614)입니다. NIH NINDS 고급 박사 전환 수상 (K22NS09131401) 뿐 아니라 고급 과학 연구 센터 (CUNY)와 브루클린 대학 지원 M.P.T.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
-His DO 보충제클론텍630415
10x 러닝 버퍼믹스: 글리신 141.65g(ThermoFisher BP381-1), 티즈마 염기(시그마-알드리치 T6066) 30.3g, 황산나트륨(시그마-알드리치 L3771) 10g, 탈이온수 1L, pH 8.8.
12% 폴리아크릴아미드 겔BIO-RAD456-1041
2-메르캅토에탄올시그마-알드리치M3148
항아세틸-히스톤 H3(Lys14) 1차 항체MilliporeSigma07-353(로트 번호 2762291)희석: 1/1000
항아세틸-히스톤 H4(Lys 16) 1차 항체Abcamab109463(로트 번호. GR187780)희석 : 1/2000
안티 아세틸 히스톤 H4 (Lys12) 1 차 항체Abcamab46983 (로트 번호. GR71882)희석 : 1/5000
안티 디메틸 히스톤 H3 (Lys36) 1 차 항체Abcamab9049 (로트 번호. GR266894, GR3236147)희석: 1/1000
Anti-Histone H3 Primary AntibodyAbcamab24834 (Lot No. GR236539, GR174196, GR3194335)핵 적재 제어; 희석 : 1/2000
Anti-phospho-Histone H2B (Thr129) 1 차 항체Abcamab188292 (Lot No. GR211874)희석 : 1/1000
안티 포스포 - 히스톤 H3 (Ser10) 1 차 항체Abcamab5176 (로트 번호. GR264582, GR192662, GR3217296)희석액: 1/1000
BioPhotometer D30Eppendorf6133000010
Cell Culture Dish (100 x 20 mm)Eppendorf30702118
Cell Culture Plate, 96 wellEppendorf30730011
Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 REppendorf22625501
Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CWLI-COR926-32212 (로트 번호 C60301-05, C61116-02, C80108-05)희석액: 1/5000
당나귀 안티-래빗 IRDye 860 RDLI-COR926-68073 (로트 번호 C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07)희석액: 1/2500
에탄올시그마-알드리치E7023
매우 두꺼운 오점지(여과지)BIO-RAD1703968
갈락토오스시그마-알드리치G075020% w/v 원액을 준비합니다.
포도당Sigma-AldrichG827020% w/v 원액을 준비합니다.
글리세롤시그마-알드리치G551650% w/v 용액을 준비합니다.
Immobilon-FL 전사막MilliporeSigmaIPFL00010
리튬 아세테이트 이수화물(LiAc)Sigma-AldrichL41581m 용액을 준비합니다.
로딩 염료혼합물: 도데실황산나트륨 1.2g, 브로모페놀 블루(시그마-알드리치 B8026) 6mg, 글리세롤 4.7mL, pH 6.8 0.5M 트리즈마 염기 1.2mL, DL-디티오트레이톨(시그마-알드리치 D0632) 0.93g 및 탈이온수 2.1mL.
MethanolThermoFisherA412-4
Mini-PROTEAN Tetra 수직 전기영동 셀BIO-RAD1658004
다채널 피펫Eppendorf2231300045
NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10xNew England Bio Labs102855-152
Nhe I Restriction EnzymeNew England Bio Labs101228-710
Nuclease Free WaterQiagen129114
Odyssey Fc 이미징 시스템LI-COR Biosciences2800-03
OmniTray 세포 배양 처리 w/뚜껑 멸균, PS (86 x 128 mm)ThermoFisher165218
pAG303GAL-a-synuclein-GFPA. Gitler
pAG303GAL-ccdBAddgene14133
pAG303Gal-FUSAddgene29614
pAG303GAL-TDP-43A. Gitler
Poly(ethylene glycol) (PEG)Sigma-AldrichP433850% w/v 용액을 준비합니다.
Ponceau S StainSigma-AldrichP3504Mix: 0.5 g 0.1% w/w Ponceau S 염료, 5 mL 1% v/v 아세트산(Sigma-Aldrich 320099) 및 500 mL 탈이온수.
PowerPac 기본 전원 공급 장치BIO-RAD164-5050
라피노스 펜타하이드레이트시그마-알드리치R763010% w/v 스톡 용액을 준비합니다.
연어 정자 DNA애질런트 테크201190
SD-His 플레이트믹스: 한천 20g(Sigma-Aldrich A1296), 0.77g -His DO 보충제, 아미노산 없는 효모 질소 염기 6.7g(ThermoFisher 291920) 및 900mL 탈이온수.
SGal-His 플레이트믹스 : 한천 20g, His DO 보충제 0.77g, 효모 질소 염기 (아미노산 제외), 갈락토오스 용액 100mL 및 탈이온수 900mL
나트륨 도데 실 설페이트 로딩 버퍼-20 oC에서 보관하십시오. 6X, 혼합 : 1.2g 나트륨 도데 실 설페이트, 6mg 브로 모페놀 블루, 0.93g DL- 디티 오 트레이톨, 2.1 mL 탈 이온수, 4.7 mL 글리세롤 및 1.2 mL 0.5 M 트리즈마 염기, pH 6.8.
수산화나트륨시그마-알드리치2214650.2m 용액을 준비합니다.
설탕Sigma-Aldrich8409720% w/v 원액을 준비합니다.
TBS + 0.1% 트윈 20(TBST)혼합: 100mL 10X TBS, 1mL 트윈 20(Sigma-Aldrich P7949) 및 900mL 탈이온수.
TBS 차단 버퍼LI-COR927-5000
Trans-Blot SD 반건조 전기영동 전달 셀BIO-RAD170-3940
전달 버퍼혼합물: 글리신 22.5g, 티즈마 염기 4.84g, 메탄올 400mL, 도데실황산나트륨 1g 및 탈이온수 1.6L.
트리스 완충 식염수(TBS)10X, 7.6 pH, 용액: 트리즈마 염기 24g과 염화나트륨 88g(Sigma-Aldrich S7653)을 혼합합니다. 탈이온수를 1L까지 채웁니다.
WT 303 S. cerevisiae 효모J. 쇼터
효모 추출물 펩톤 포도당(YPD)의 선물Sigma-AldrichY1375
의 선물 .

References

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