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방법 논문

중립 지질에 대 한 녹색 미세 거품 열 Photobioreactors에 시험 재배

21.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/59106

⸱

2019년 1월 7일

 ,  , 
1Department of Biosystems Engineering, Auburn University

이 논문에서

요약

여기, 우리 실험실 규모 거품 열 photobioreactors를 생성 하 고 문화 microalgae를 그들을 사용 하 여 프로토콜을 제시. 그것은 또한 문화 성장 율 및 중립 지질 내용에 대 한 메서드를 제공합니다.

초록

Microalgae 바이오 연료, 고부가가치 제품의 생산 등 엔지니어링 응용 프로그램에 대 한 및 폐기물의 처리를 위해의 연구에 상당한 관심이 있다. 대부분 새로운 연구 노력 실험실 규모에서 시작, 재현 방식에서 microalgae 재배에 대 한 비용 효과적인 방법에 대 한 필요가 있다. 여기, 우리 교통 문화 microalgae 실험실 규모 photobioreactors, 그리고 그 조류의 성장 내용과 중립 지질을 측정 하는 효과적인 접근 한다. 지침은 photobioreactor 시스템을 설정 하는 방법에 포함 됩니다. 예제에서는 생물 클로렐라 와 Auxenochlorella의 종 있지만,이 시스템 미세, 비 조류 종의 조류의 공동 문화를 포함 한 넓은 범위를 육성 하기 위해 적응 수 있다. 재고 문화 처음 inoculum photobioreactor 시스템을 생산 하는 병에서 성장 된다. 조류 inoculum 집중 이며 일괄 처리 모드에서 재배에 대 한 photobioreactors로 전송 합니다. 샘플은 광학 밀도 판독을 매일 수집 됩니다. 배치 문화의 끝에, 셀, 원심 분리기에 의해 수확 하 고 동결 건조는 최종 건조 중량 농도를. 최종 건조 중량 농도 광학 밀도 건조 중량 농도 사이의 상관 관계를 생성 하는 데 사용 됩니다. 수정된 Folch 메서드는 이후에 동결된 바이오 매스에서 총 지질을 추출 하 고 추출 microplate 분석 결과 사용 하 여 중립 지질 내용 분석. 이 분석 결과 이전에 게시 되었습니다 하지만 프로토콜 단계 오류가 자주 발생 하는 절차의 중요 한 단계를 강조 하기 위해 여기 포함 됐다. 여기에 설명 된 생물 반응 기 시스템 간단한 플라스 크 및 상업 bioreactors 완벽 하 게 제어 사이의 틈새 시장을 채웁니다. 치료 당도 3-4 생물 복제, 우리의 접근 방식 조류 배양 성장 및 지질 분석 실험에 꽉 표준 편차를 리드.

서론

미세 공학 및 생명 공학에서의 응용 프로그램은 최근 몇 년 동안에 큰 관심을 모으고 있다. Microalgae 폐수 처리1,2,3,4, 바이오 연료 생산5,6,7,8, 사용을 위해 공부 되 고 있다 그리고 영양 보충 식품 및 다른 높은 가치 제품9,10의 생산. 조류는 또한 유전자 수정 중인 큰 속도로 특정 엔지니어링 응용 프로그램11,12에 대 한 그들의 적합성을 향상 하기 위해 따라서, 제어 설정에서 산업으로 관련 유기 체를 가진 실험에 큰 관심이입니다. 이 방법의 목적은 문화 미세 제어 실험실 환경에서 효과적인 접근을 의사 소통을 하 고 측정할 성장과 그 조류의 중립 지질 내용. 성장을 향상 속도 중립 지질 콘텐츠 미세 조류 바이오 연료13의 상용화를 향해 두 주요 병목 확인 되었습니다.

다양 한 접근 문화 조류 실험적인 목적을 위해 사용 되었습니다. 일반적으로 이러한 방법은 대규모 야외 재배 및 소규모 실내 재배 사이 나눌 수 있습니다. Photobioreactors와 오픈 연못에 야외 재배 실험 실험실 규모 (예를 들어, 조류의 새로운 하이-지질 긴장의 스케일-업 테스트)에서 이미 입증 된 프로세스를 확장 하기 위한 위해 적합 하다14. 그러나, 실내 소규모 재배 적합 한 새로운 또는 향상 된 조류 종자를 개발 하는 경우 또는 생물 학적 메커니즘을 이해 하기 위한 실험을 수행. 이 후자의 경우에서 실험 제어의 높은 학위 생물 학적 행동에 미묘한 변화 애타게 필요 합니다. 이 위해, axenic 문화 종종 필연적으로 대규모 야외 시스템에서 성장 하는 다른 생물 (예: 박테리아, 다른 조류)와 관련 된 복잡 한 생물 요소를 최소화 하기 위해 필요 합니다. 조류와 다른 유기 체 사이 상호 작용을 공부 하는 경우에 우리 생물15,,1617간의 분자 교류를 조사할 때 높은 제어 실험 조건의 사용 유용 하는 것이 나타났습니다.

소규모 실내 조류 재배의 범주 내에서 다양 한 접근은 사용 되었다. 아마도 가장 일반적인 방법은 빛 은행18,19아래 통 테이블에 삼각 플라스 크에 조류를 성장 하는 것입니다. 산소와 CO2 의 교환 플라스 크의 상단에 있는 거품 플러그를 통해 수동 확산에 의해 일어난다. 일부 연구 자들은이 설정 플라스 크20의 활성 폭 기를 통해 향상 되었습니다. 다른 방법은 병, 저 어 바와 활성 폭 기 혼합에 조류를 배양 하는 것입니다. 그들의 단순에도 불구 하 고 우리는 플라스 크 및 병의 사용 수시로 이끌어 생물 복제 간의 일관성 없는 결과 것으로 나타났습니다. 아마도 이것은 위치 효과-다른 위치로 받을 또한 반응 기 내부 온도 영향을 미치는 다른 양의 빛. 새로운 위치로 원자로의 매일 회전 수 있지만 있기 때문에 문제를 완화 하지 않습니다 조류 성장의 특정 단계 (예를 들어, 초기 지 수) 다른 사람 (예를 들어, 로그 단계) 보다 위치 효과에 더 민감한.

기술적 정교의 스펙트럼의 반대 측에 완벽 하 게 통제 상업 photobioreactors가 있습니다. 이러한 시스템은 지속적으로 모니터링 하 고 조정 조류 성장을 최적화 하는 원자로. 그들은 실시간 온도 제어, 프로그래밍 가능한 조명과 pH 제어 했습니다. 불행히도, 그들은 비싼 그리고 일반적으로 반응 기 당 몇 천 달러를 비용. 가장 과학적이 고 공학 저널 생물 복제의 결과, 여러 bioreactors의 구매 필요로 필요 합니다. 우리는 현재 여기 거품 열 원자로 시스템 연구소 규모 조류 재배에 대 한 접근 (플라스 크) 간단 하 고 정교한 완전 제어 (bioreactor) 사이 분할을 다리. 거품 열 가스 거품 상승 가스 교류를 촉진 하 여 원자로 혼합 사용 합니다. 이 이렇게 어느 정도의 조명 및 온도 제어를 제공 하지만 비용 효과적인 방법으로 이렇게 한다. 또한, 우리 생물 복제 플라스 크 또는 병 접근에 비해 통계적으로 유의 한 결과 얻기 위해 필요한 필요한 수를 줄여이 시스템 생물학 복제 중 매우 일관 된 결과 얻을 수를 발견 했다. 우리는 또한 성공적으로 조류와 박테리아21의 혼합물을 육성 하기 위해이 시스템을 사용. 조류 재배 뿐만 아니라 우리 경작된 해 조류에 중성 지질 함량을 측정 하는 절차를 개설 한다. 후자의 방법은 되었습니다22, 다른 곳에서 출판 하지만 우리가 성공적으로 그것을 사용 하는 방법에 대 한 단계별 지침을 제공 하기 위해 여기 절차를 포함.

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프로토콜

1입니다. 거품 열 Photobioreactors의 설치

  1. 1 리터 유리병과 교 잡 튜브 (회로도 및 사진 그림 1 참조)와 함께 제공 된 플라스틱 뚜껑에서 환풍구 뚜껑의 집합을 생성 합니다. 가습기, 트랩, 각 공기 리프트 photobioreactor와 각 병 원자로 뚜껑을 생성 합니다.
    1. ¼"뚜껑에 구멍을 드릴: 2 구멍에 필요한 생물 반응 기 및 가습기 뚜껑; 3 구멍 혼합 함정에 필요 합니다.
    2. 슬립 한 ¼"o-링을 스레드에 1/8" 패널 마운트 Luer 피팅의 그리고 뚜껑 (그림 1A)에 교 련된 구멍 ¼"에 이것을 슬라이드.
    3. 슬립 한 두 번째 ¼"o-링을 스레드에 뚜껑은 두 개의 오-링 사이 끼여. 스레드에 로크 슬립 하 고 자리에 패널 마운트 루어를 해결 하기 위해 강화.
    4. 잠금 고리는 노출 남성 Luer 투영에서 뚜껑에 스냅 합니다. 뚜껑에 각 구멍을 위한 1.1.2-1.1.4 단계를 반복 합니다.
    5. 뚜껑 거품 열 병 원자로에 사용할 연결 1/8"에 대 한 1.5" 바 브 피팅 하 여성 루어 1/8"ID PVC 튜브의 조각. 이러한 각각의 뚜껑에 노출된 남성 Luer 피팅 연결 합니다.
    6. 체크 밸브 (뚜껑 멀리 가리키는) 중 1/8"의 무료 끝 연결 조각.
      참고: 이것은 생물에 대 한 배기 포트 될 것입니다.
    7. 남성 Luer 바바라 1/8"튜빙 뚜껑에서 예상의 두 번째 부분을 연결 합니다. 제자리 회전 잠금 링을 클릭 하 고이 0.2 m m 공기 필터를 고정 시킵니다.
      참고:이 입구 포트는 원자로 대 한 될 것입니다.

포트 어셈블리가 있는 병 밀봉 방법 다이어그램; 잠금 너트, O-링 및 PVC 튜브 설정이 포함됩니다.
그림 1입니다. 회로도 및 사진 bioreactors 건설에 대 한 는 생물의 건설에 대 한 개략도 (A) 뚜껑 조립된 생물 뚜껑의 (B) 사진 및 사용 하는 가습기 조립된 뚜껑의 (C) 사진. 참고 가습기 피팅 뚜껑으로 밀폐 봉인 되도록 방수 실리콘에 코팅 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

  1. 공기 전달 시스템 조립 (회로도 및 사진에 대 한 그림 2A 및 2B 참조).
    1. 1/8"NPT 스레드 바 브 피팅 후미 및 각 rotameter의 뒤에 콘센트에 연결 합니다.
      참고: 200-2500 cm3/min rotameters는 가습기의 상류 공기 압력 변조에 대 한, 100-1000 cm3/min rotameters는 병 원자로, 50-500 c m3/분 rotameters 공기 리프트 생물 반응 기, 및 5-50 cm3/ 최소 rotemeters CO2 흐름 규칙에 대 한 있습니다. 마운트 rotameters 고정된 표면 (예: 플라스틱 시트)를 하는 것이 좋습니다 그래서 그들은 작업 중 떨어지지 않는다.
    2. 압축 공기 소스에서 입 하 다음 호스 클램프와 압축 공기 소스 ¼"ID 유연한 PVC 튜브를 연결. 1/8 "는 ¼" 바 브 피팅 및 1/8"바 브 피팅 남성 여성을 사용 하 여 ID PVC 유연한 튜브 호스 직경을 사임.
    3. 200-2500 cm3/min rotameter의 입구를 1/8"ID 튜빙의 자유로운 끝을 연결 합니다.
      참고:이 rotameter 콘센트 가습기 병 1/8"ID 배관 통해 공급 합니다.
    4. 1/8"환풍구 뚜껑 (연결을 운동 하는 여성 루어 사용)에 입구에 튜브 연결 합니다. 두 번째 조각의 1/8"패널 마운트 안쪽 튜브 연결 피팅.
      참고:이 작품 것 이다 아래로 가습기 물을 통해 거품 공기에 만요.
    5. 첨부 1/8"피팅 1/8" ID 튜브의 각 끝에 밥이 조각을 사용 하 여 혼합 트랩의 입구에는 가습기의 콘센트를 연결 하 여 루어.
    6. 1.2.5로 같은 방식으로, CO2 레 귤 레이 터의 콘센트 혼합 함정에 두 번째 포트에 연결 합니다.
    7. 구성 사용 하 여 1/8"매니폴드 배관 및 1/8" 멀티 포트 바바라 rotameter 은행에 공기를 공급을 (참조 그림 2 C).
      참고: 이러한 rotameters는 생물 반응 기 공급 사용 됩니다. 시리즈에서 6 개 이상의 rotameters 구성 하지 마십시오. 대신, rotameters의 병렬 은행을 사용 하 여 시스템을 확장. 모든 원자로 대 한 전체 흐름 수요 2500 cm3/min 미만 확인 (또는 다른 더 큰 rotameter 필요 하 게 됩니다는 가습기의 업스트림).
    8. 1/8"튜빙 및 1/8" 여성 바바라 루어를 사용 하 여 새로 생성 된 rotameter 은행에 혼합의 콘센트 (3rd 포트)를 연결 합니다.
    9. 충분히 긴 1/8"는 생물 반응 기에 공기 공급을 rotameter 은행에 각 rotameter의 출구에 튜브 연결 합니다. 은행에 rotameters 튜브의 끝에 레이블을 지정 합니다.
    10. 물-증거 실리콘 모든 포트 주위는 가습기와 혼합 되도록 그들은 공기가 꽉 트랩 뚜껑에 적용 됩니다.

생물 반응기용 압축 공기 시스템; 로타미터, 가습기, 혼합 트랩; 다이어그램, 실험 설정.
그림 2입니다. 회로도 및 조립 거품 열 시스템에 대 한 사진 (A) 회로도 가습기의 통 기 통풍 시스템 (B) 사진 함정, 그리고 rotameter 은행, 및 (C) 사진 rotameter 은행을 함께 연결 하는 데 사용 하는 매니폴드의 혼합. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

  1. 물고기 탱크, 접시, 그리고 빛 (그림 3)를 저 어.
    주의:이 시스템 및 모든 구성 요소를 지 원하는 충분 한 회로 용량의 많은 수를 요구 한다. 모인 함께 여러 개의 전원 스트립 및 확장 코드 데이지-체인 방식 전기 위험 때문에 하지 마십시오. GFI 타입 콘센트와 멀티탭의 사용은 시스템에 매우 권장 물의 존재 때문 이다.
    1. 로우 프로 파일 자석 교 반기 물 가득한 물고기 탱크의 무게를 충분히 강한 평면에 정렬 합니다.
    2. 작은 나무 또는 플라스틱 블록 (저 접시 보다 약간 키가) 둘레에 물고기 탱크의 무게를 지원 하기 위해 저 어 접시의 장소.
      주의: 무게는 그들을 짝사랑으로 볶음 판에 직접 물고기 탱크를 배치 하지 마십시오.
    3. 저 어 접시에 놓고 물고기 탱크 블록을 지원 하 고 물으로 탱크를 채우기.
    4. 뚜껑으로 생선 탱크 위에 맞게 뻣 뻣 한 플라스틱 시트의 한 조각 잘라. 밖으로 교 잡 튜브 슬라이드이 커버에 구멍을 절단. 또한 물고기 탱크 히터에 대 한 구멍을 잘라.
    5. 물고기 탱크는 bioreactors의 가로 조명을 제공 옆 형광 빛 은행을 정렬 합니다. 일 또는 밤 주기를 설정 하는 가벼운 타이머 빛 은행을 연결 합니다.

미생물 배양 성장 및 폭기 공정을 위한 병 및 공수 반응기 시스템 다이어그램.
그림 3입니다. 시스템 회로도 병 생물 반응 기 (왼쪽)와 거품 열 photobioreactors (오른쪽)에 대 한. 이 그림에서 히 긴 스 외. 수정 되었습니다. 17. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

2입니다. 미세 Inoculum의 준비

  1. 곳을 알아내는 보존, 도금, 또는 액체 문화에서 microalgae inoculum을 가져옵니다.
    참고: inoculum 세포가 가능한 고 결과 문화는 axenic로 사용 하기 전에 cryopreserved 유기 체를 도금 하는 것이 좋습니다. 한 천 매체 (예., ATCC #5 천 sporulating)21 cryo-스토리지에서 클로렐라 와 Auxenochlorella 의 종을 살리기 위해 잘 작동 하는 풍부한 매체입니다.
  2. 특정 미세 종족에 대 한 적합 한 미네랄 매체의 2.4 L를 준비 합니다.
    참고: 예로 N8 중간23 클로렐라, N8-NH4 중간21 Auxenochlorella의 종 종 있습니다. 조류 스트레인에 대 한 적절 한 매체의 사용으로 강력한 조류 성장을 보장 가장 중요 한 단계 중 하나입니다.
  3. 3 1 리터 유리병에 동등 하 게 미네랄 매체의 aliquot 2.4 L 각 병에 대 한 각 병 바 저 어 고 발명된 뚜껑 (그림 1)를 추가 합니다. 통 기 통풍 관 입구 쪽에 각 병은 재확인에 저 어 바가 있다.
  4. 고압 액체 살 균을 사용 하 여 주식 병 나중 도금에 사용 될 것입니다 동시에 이온된 수 (dH2O)와 일부 1.5 mL 튜브의 30 분 압력솥 100 ml (121 ° C)를 주기. 멋진 하룻밤 매체를 허용 합니다. 또는 실내 온도에 반응 기를 냉각 하 고 접종 전에 2 h에 대 한 다음 공기에 쐬 십시오.
  5. biosafety 내각 (BSC)에 접시 또는 axenic 액체 문화에서 미세 사진 병으로 예방. 다음 단계에서 axenic 문화를 유지 하기 위해 무 균 기술을 사용 합니다.
    1. 살 균 50 mL 원심 분리기 튜브에 압력가 dH2O의 20 mL를 추가 합니다. 살 균 10 µ L 일회용 루프를 사용 하 여 단계 2.1에서에서 접시에서 여러 단일 식민지를 선택. 50 mL 튜브에 루프와 조류 세포 압력가 dH2균일 미세 솔루션 O. 동요 50 mL 튜브의 20 mL로 씻고.
    2. 10 mL 살 균 혈 청 학적인 피 펫으로 각 사진 병으로 미세 솔루션의 6 mL를 플라스틱. 매체에 있는 미세 균등 하 게 혼합 병을 소용돌이 친다.
  6. 2 mL 살 균 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 살 균 1.5 mL 튜브에 1 mL 샘플 각 주식 병 및 전송에서 그리는.
    참고: Micropipettes는 오염의 위험 때문에이 단계에 대 한 권장 하지 않습니다. 주식 병에 환풍구 뚜껑을 조입니다.
  7. 저 어 접시 (~ 150 rpm)에 주식 병을 놓고 공기 유량, CO2, 그리고 종족에 대 한 적절 한 조명 레벨을 조정 합니다. 매일 주식 병 위치를 회전 합니다.
  8. 2.6 단계 얻은 1ml 샘플 희석 (살 균 물에 100 희석 일반적으로 잘 작동) 다양 한 매체에 플레이트를 확산.
    참고:이 접시는 오염의 인스턴스 뿐만 위한 미래 조류 inoculum의 근원으로 봉사 하는으로 추가 실험 검사 하 사용할 수 있습니다.
  9. 걸릴 샘플 (BSC)에 병에서 매 2 일 미세 성장 확인.
    샘플 3 (200 µ L) 중에서 96 잘 microplate에 놓고 측정 광학 밀도 (OD) 550 nm와 680 nm OD까지 매 2 일에 도달 0.2-0.3 (요구 하는 일반적으로 5-7 일).
  10. 부 화를 중지 하 고 중력에 의해 정착 조류 셀 수 있도록 24-48 h에 대 한 벤치에 재고 병을 놓습니다.
    참고: 정착된 세포 거품 열 photobioreactors 접종에 다음 사용할 수 것입니다. 더 빠른 셀 컬렉션을 원하는 경우 셀 셀 수집을 더 이상 1000 x g에 centrifuged 수 있습니다.

3. 미세 거품 열 Photobioreactors에서의 재배

  1. 생물 접종 전날 적절 한 미디어를 준비 하 고 전송 200 mL (또는 원하는 볼륨) 거품 열 photobioreactor 하 관 (교 잡 튜브). 고압 튜브 미디어와 장소에서 환풍구 뚜껑.
    참고: 성장 매체, 오토 클레이 브 빈으로 폐수를 사용 하는 경우 생물 반응 기 (axenic 문화는 원하는 경우) 살 균 필터링 폐수를 추가.
  2. 진공 펌프를 사용 하 여 상쾌한 제거 하 여 정착된 microalgae 주식을 집중 한다. 각 병에 100ml 미만 매체를 떠나 하지만 정착된 조류를 제거 하지 마십시오.
    참고: BSC 내부이 절차를 수행 하 고 메 마른 기술에 따라. 진공 플라스 크 또는 병을 사용 하 여 간단한 진공 장치를 구성할 수 있습니다. 튜브의 끝에 살 균 혈 청 학적인 피 펫에 맞는.
  3. 일시 중단 하 고 살 균 50 mL 원심 분리기 튜브 조류 슬러리 전송. 5 분 더 1000 x g에서 원심 분리기 조류 집중.
  4. BSC, 12 photobioreacters에 대 한 조류 집중의 ~ 80 mL의 총 볼륨을 달성 하기 위해 충분 한 상쾌한 제거. 펠 릿 밖으로 진공 청소기로 청소 하지 마십시오. 살 균 컨테이너 (또는 사용된 조류 재고 병) 조류 집중을 전송 합니다.
  5. 살 균 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 각 photobioreactor에 조류 슬러리의 6 mL를 추가 합니다.
  6. 살 균 필터 (0.2 m m 주사기 나 진공 필터) 및 어떤 다른 화합물 (예: 비타민 주식) 압력가 마로 소독 될 수 없습니다의 적절 한 금액을 추가.
  7. 매체에 조류를 섞어 bioreactors를 소용돌이 친다.
  8. 혈 청 학적인 피 펫 및 전송 2 mL 튜브를 사용 하 여 각 생물에서 2 mL 샘플을 그립니다. 문화 진행 상황을 모니터링할 모든 24 h 2 mL 샘플 (BSC)에 수집 합니다. 전화를 사용 하 여 샘플 테스트 스트립을 확인 하 고 M NaOH 또는 3 M HCl 중 3 필요에 따라 원자로 조정 합니다.
  9. 생물 반응 기 뚜껑을 강화 고 모든 bioreactors 물고기 탱크 물 목욕 합니다. 폭 기, CO2, 그리고 조명 종족에 대 한 적절 한 수준으로 조정 합니다. 회전 생물 반응 기 위치 (단계 3.8)를 샘플링 후 매일.
  10. 3 중에서 각 문화 샘플의 200 µ L 96 잘 microplate의 웰 스에 적용 됩니다. 광학 밀도 (OD)를 측정 하는 550 nm와 680 nm.
    1. 문화 시대의 마지막 날, 다른 희석 요인 (예를 들어, 1 x 2 배, 4 x, 8 배속, 16 배속, 32 x) 수확 (4 단계) 후 마약과 실제 건조 중량 사이의 상관 관계를 설정 하에서 OD를 측정 합니다.
  11. 5 분 동안 12000 x g에 2ml 샘플 튜브 원심
  12. 상쾌한 0.2 µ m 비 멸 균 주사기 필터를 통해 필터링 하 고 상쾌한 (및 필요한 경우 펠 릿) 없이 저장 장기 저장 및 미디어 구성에 변화의 나중 분석-20 ° C 보다 더 높은.

4. 수확 및 Microalgal 바이오 매스의 건조 동결

  1. 졸업된 실린더 (예를 들어, 생물 매체의 그 원래 포함 된 200 mL에서에서 160 mL)와 각 생물에서 조류 문화의 고정된 볼륨을 측정 하 고 원심 병으로 전송. DH2O 각 측정 사이 졸업된 실린더 린스.
  2. 5 분에 대 한 4,696 x g에서 원심 분리기는 신중 하 게 그것을 밖으로 진공 청소기로 상쾌한을 삭제 합니다.
  3. 레이블이 50 mL 튜브에 펠 릿을 전송 합니다. DH2O, 원심 분리기 병 및 전송 내용 50 mL 튜브에 린스. 총 관 볼륨 45 mL를 초과 하지 않는 확인 하십시오.
  4. DH2O 소금 제거 조류 펠 릿을 세척.
    1. 5 분 동안 4,696 x g에서 50 mL 튜브 원심 고는 상쾌한 삭제.
    2. 각 50 mL 튜브; 40 mL dH2O 추가 소용돌이를 섞어입니다. 다시 5 분 동안 4,696 x g에서 원심 하 고 상쾌한 삭제.
    3. 4.4.2 단계를 다시 반복 합니다.
  5. 레이블 및 빈 15 mL 원심 분리기 튜브 4 소수 균형에 무게 (뚜껑 및 튜브와 함께 그들을 무게). 조류 문화 당 하나의 튜브 무게. 오류를 최소화 하기 위해 두 번 각 15 mL 튜브 무게.
  6. 마지막 세척 후 상쾌한, 삭제 하 고 각 50 mL 튜브에 dH2O의 7.5 mL를 추가 합니다. 소용돌이 전송 사전 무게 15 mL에 조류 슬러리 튜브 합니다. 추가 dH2O 50 mL 튜브를 헹 구 고 15 mL 튜브에 액체를 전송. 15 mL 튜브에 총 볼륨의 12 mL을 초과 하지 마십시오.
  7. 5 분 동안 4,696 x g에서 15 mL 튜브 원심 고는 상쾌한 가만히 따르다. 적어도 30 분 동결에 대 한 준비-80 ° C에서 펠 릿으로 튜브를 고정 합니다.
  8. 동결 건조 하룻밤 또는 건조 될 때까지.
  9. 무게와 조류와 동결 건조 15 mL 튜브를 기록.

5. 지질 추출은 Folch 수정 방법24 를 사용 하 여

  1. 2 mL 나사 모자 폴 리 프로필 렌 관 (비드 기사에 대 한 적합 한 제품 인지 확인 제조 업체 라벨)으로 동결된 조류 바이오 매스의 20 밀리 그램을 무게.
  2. 각 2 mL 튜브 (동결된 조류의 20 밀리 그램을 포함)를 Folch 용 매 (2:1 클로 프롬/메탄올)의 1.5 mL를 추가 합니다. ~0.5 mL 지 르 코니 아/실리 카 구슬 (0.5 m m)에 붓고 각 튜브 튜브에 액체 수준 2 mL에 도달할 때까지.
    주의: 및 가스를 호흡 하지 않도록 또는 접촉 피부 클로 프롬 및 메탄올 증기 두건에서 처리할.
  3. 20 대 한 비드 밀 조류 샘플 균질 s 30에 대 한 얼음 6.5 m/s의 전송 튜브의 속도로 샘플 진정 s. 완전히 추출 지질을 5 회 반복 합니다.
  4. 스테인레스 스틸 와이어 메쉬 디스크 (#60 메쉬) 15 mL 튜브에는 filtrate 수집 구슬 밖으로 긴장을 포함 5 mL 주사기를 통해는 homogenate를 필터링 합니다.
  5. 필요한 만큼 주사기를 통해 액체를 밀어 Folch 매의 1.5 mL와 구슬 워시. 이 세척 두 번 더 반복 하 고 약 6 mL의 최종 볼륨을 저조한 15 mL 튜브에 모든 filtrate 수집.
  6. 0.9% (w/v) NaCl 솔루션 15 mL 튜브에 Folch 추출 하 고 잘 혼합 하는 소용돌이의 1.2 mL를 추가 합니다.
    참고: 지금까지 필요한 경우에 더 많은 Folch 솔벤트 구슬 (0.9 %NaCl 솔루션 단계 분리를 유도 하는 것의 총 세척 볼륨 x 0.2 사용)를 씻어 사용할 수 있습니다.
  7. 5 분 레코드를 가장 가까운 0.1 mL 15 mL 튜브의 측면 라인을 사용 하 여 하단 클로 프롬 (녹색) 단계 볼륨에 대 한 6000 x g에서 15 mL 튜브 원심 (뚜껑)와 유리 유리병에 하단 단계 유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 전송 합니다.
  8. -20 ° C 또는 (경우이 추출 지방산 분석을 위해 사용 하는 계획이 있다 ° C-80) 지질을 저장 합니다.

6. 중립 지질 분석 결과 Microplate 메서드를 사용 하 여 (히 긴 스 외. 201422) 에서 적응

  1. 재고 솔루션을 준비 합니다. 클로 프롬에 10 mL 1 mg/mL 식물성 기름 표준을 준비 하 고-20 ° c.에 저장
    참고: 모든 식물성 기름 지방산의 종류를 구분 하지 않습니다 때문에이 분석 결과에 사용할 수 있습니다. 200 µ g/ml 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에서 나 일 레드 솔루션 10 mL를 준비 하 고 실 온에서 어둠 속에 저장.
  2. 증기 두건에서 55 ° C로 전 열 건조 microplate 블록. 이것은 열 하는 동안 희석 지질 추출 물과 식물성 기름 표준 3-fold와 메탄올.
    참고:이 희석, 조류의 지질 내용에 따라 변경 될 수 있습니다 하지만이 수준 대부분 클로렐라를 위해 잘 작동 합니다.
  3. 각 희석 샘플 quadruplicate에서 96 잘 폴 리 프로필 렌 microplate에 80 µ L를 추가 합니다.
    주의: 폴리스 티 렌 plasticware의 사용 유기 용 매와 함께 사용 하지 않는 좋습니다.
  4. 빈 용 매에 대 한 2:1 메탄올/quadruplicate에서 클로 프롬의 80 µ L을 적용 합니다. 표준, 10, 30, 60, 90, 및 quadruplicate에서 표준 희석 식물성 기름의 120 µ L를 추가 합니다.
  5. 20-30 분까지 모든 용 매 증발은 55 ° C에서 건조 블록 히터에 미 판 장소. 용 매 증발 하는 동안 준비 작업 나 일 레드 솔루션 (잘 접시 당 1 µ g/ml 해결책의 필요 200 µ L). 예를 들어, 12 샘플 및 표준의 전체 세트 1.0 µ g/mL 해결책; 16 mL 필요 16 mL dH2오를 (DMSO)에서 200 µ g/mL의 80 µ L를 용 해 하 여 준비
  6. 미 판 열 블록에서 제거 하 고 실내 온도에 차가운 시키십시오. 각 우물에 이소프로필 알코올 30 µ L을 추가 하 고 아래로 pipetting으로 혼합. 모든 피 펫 채널 혼합 솔루션 및 지질, 저조한 균질 녹색 액체를 resuspending를 확인 하십시오.
  7. 위/아래를 섞어 10 배 나 일 레드 솔루션 (1 µ g/mL) 각 음, 플라스틱의 200 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 5 분 동안 접시를 품 어. 기다리는 동안,2오 20 µ L 당 잘 필요는 지명 타자로 사용 표 백제 (6% 차 아 염소 산)을 혼합 하 여 50%의 표 백제 솔루션을 준비 합니다. 50% 표 백제 3 mL의 준비는 12 샘플 및 표준의 전체 집합에 대 한 충분 한 이다.
  8. 잘 각 microplate에 표 백제 솔루션의 20 µ L을 추가 하 고 잘 섞어 5 번 위아래로 플라스틱. 실 온에서 30 분을 품 어.
  9. 30 분 후 읽기 샘플에서 형광 530 nm 여기/575 nm 방출에서 5-10 분 마다 자동 컷오프 570 설정 nm 조류 샘플에서 신호 안정화 될 때까지. 일반적으로, 전체 외피의 60 분은 충분 합니다.
  10. (0-40 ng 오일/우물의 범위)에서 식물성 기름 표준에 대 한 교정 곡선을 만듭니다.
    참고: 선형 맞는 저를 위해 잘 작동 (< 30 ng/잘) 오일 농도 및 적합 다항식 표준 30 ng/잘 초과 하는 경우 사용할 수 있습니다. 이 상관 관계를 사용 하 여 샘플 우물에서 중립 지질 계량.

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결과

이 절차는 세 550 nm (그림 4A)에서 조류 광학 밀도 데이터의 시간 과정을 생성합니다. 광학 밀도 건조 중량 농도 데이터 수 상관 (그림 4B). 이것은 동결 단계 후 최종 건조 중량 조류 농도 계산 하 여 수행 됩니다. 다음, 문화 연속 희석 (샘플링의 마지막 날에 수행)과 실제 건조 중량 농도의 광학 밀도 상관 될 수 있다. 낮은 셀 농도 대 한 높은 셀 농도 대 한 두 번째 주문 다항식 상관 관계를 사용할 수 있습니다 반면 선형 상관 관계를 사용할 수 있습니다. 그것은 각 문화 조건에 대 한 별도 상관 관계를 만드는 것이 좋습니다. 마지막으로, 건조 중량 성장 곡선 (그림 4C)를 시간 코스 광학 밀도 데이터 상관 관계를 적용할 수 있습니다. 이 예제에서는 실험에서 Auxenochlorella...

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토론

조류를 배양 할 때 가장 중요 한 고려 사항은 유기 체 또는 생물의 그룹의 특정 요구에 대 한 이해입니다. 여기에 설명 된 재배 시스템 문화 조류 하지만 특정 비 생물 적인 요인 (온도, 미디어, pH, 빛의 강도, CO2 수준, 통 기 통풍 속도)의 넓은 범위를 사용할 수 있는 조류 생물의 필요에 조정 될 필요가 있다. Note 여기에서 설명 하는 매개 변수 클로렐라 와 Auxenochlorella의 재배를 위해 이용 되었다. 이러한 생물 산업 관심 때문에 높은 영양소, 빛, 그리고 온도 레벨27에 있습니다. 그러나, 가벼운 수준의 형광 전구의 제거를 통해 감소 될 수 있다 고 주/야 주기 계절을 표현 하기 위해 조정 될 수 있다. 마찬가지로, 물 히터 설정할 수 있습니다 위 또는 아래로 제어 시스템에 물 목욕 온도. 여기서 설명 하는 시스템 같은 기능을 채용 하지 않습니다, 하는 동안 진정 저가 냉각 시스템을 통해 실내 온도 아래 ...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 연구에 대 한 지원은 미국 농 무부 식품 및 농업 해치 프로젝트 ALA0HIGGINS는 학장, 연구를 위한 부사장 그리고는 사무엘 Ginn 대학의 공학의 고동색 대학 사무실에 의해 제공 되었다. 지원 또한 NSF에서 제공한 CBET 1438211를 부여.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Supplies for airlift photobioreactor setup
1 L Pyrex bottleCorning16157-191병 반응기, 가습기용
1/2" 호스 클램프Home DepotUC953A또는 동급
1/4" 암 루어 to barbNordson biomedical NordsonFTLL360-60051/4" ID, PP
1/4" ID, 3/8" OD 오토클레이브 가능 PVC 튜빙Thermo-Nalgene63013-24450'1
/4" in O-링Grainger1REC5#010 중간 하드 실리콘 O-링, 0.239" I.D., 0.379"O.D.
1/8" 암 루어-미늘Nordson 생물 의학FTLL230-6005
1/8" ID, 1/4" OD 오토클레이브 가능 PVC 튜빙Thermo-Nalgene63013-608250'1
/8" 남성 회전 루어-미늘Nordson 생물 의학MLRL013-6005
1/8" 멀티포트 미늘Nordson 생물 의학4PLL230-60051/8" 멀티포트 미늘
1/8" NPT to barbNordson biomedical18230-60051/8" 200 시리즈 미늘
1/8" 패널 마운트 luerNordson biomedicalNordson MLRLB230-60051/8", PP
10갤런 어항Walmart802262레이아웃에 따라 최대 8개의 생물 반응기를 수용할 수 있습니다
100-1000 ccm 유량계DwyerRMA-13-SSV병 반응기용
2피트 형광등 은행AgrobriteFLT24 T5
200-2500 ccm 유량계DwyerRMA-14-SSV가습기
250 mL Pyrex 병Corning16157-136가습기
50-500 ccm 유량계DwyerRMA-12-SSV혼성화 튜브 반응기용
5-50 ccm 유량계DwyerRMA-151-SSVCO2 유량 제어용
에어 필터 0.2 &마이크로; mWhatman/ Fisher09-745-1A폴리벤트, 28 mm, 0.2 &마이크로; m, PTFE, 50 팩
체크 밸브VWR89094-714
파이렉스 병용 코닝 뚜껑VWR89000-23310 GL45 뚜껑
암 루어 엔드캡Nordson 생물 의학 NordsonFTLLP-6005암 안정 PP
하이브리드화 튜브Corning32645-03035x300 mm, 2
팩 라이트 타이머Walmart556393626
잠금 너트Nordson 생체 의학Nordson LNS-31/4", 빨간색 나일론
로우 프로파일 자기 교반기VWR 10153-690로우 프로파일 자기 교반기
남성 루어 엔드캡Nordson 생체 의학Nordson LP4-6005수 플러그 PP
스피닝 루어 잠금 링Nordson 생체 의학Nordson FSLLR-6005
교반 바 - 긴VWR58949-04038.1 mm, 병 반응기용
교반 막대 - 매체VWR58949-03425 mm, 수화 튜브
용조류 배양용 용품 및 시약
0.2 µ m 필터VWR28145-49113 mm, PTFE, 일일 배양 시료 주입에서 사용한 배지 필터링용
1 mL 주사기Air-tite89215-216일일 배양 시료 주입에서 사용한 배지 필터링용
1.5 mL 튜브VWR87003-294멸균(또는 동급)
10 mL 혈청학 피펫Greiner Bio-One82050-482멸균(또는 동급)
100 mm 플레이트VWR25384-342100x15 mm 쌓을 수 있는 페트리 접시, 멸균
15 mL 튜브Greiner Bio-One82050-276멸균(또는 동급), 폴리프로필렌
2 mL 혈청학적 피펫 팁Greiner Bio-One82051-584멸균(또는 동급)
2 mL 튜브VWR87003-298멸균(또는 동급)
50 mL 튜브Greiner Bio-One82050-348멸균(또는 동급), 폴리프로필렌
96웰 마이크로플레이트Greiner Bio-One89089-578폴리스티렌(뚜껑 포함, 평평한 바닥)
접종 루프VWR 80094-478멸균(또는 동급)
액체 이산화탄소 탱크 및 조절기AirgasCD-50
지질 추출 및 중성 지질 분석용 용품 및 시약
2 mL 비드 튜브VWR10158-556폴리프로필렌 튜브(뚜껑 포함
96웰 마이크로플레이트Greiner Bio-One82050-774폴리프로필렌, 평평한 바닥
표백제Walmart550646751일반 표백제만 사용하고 표백제를 세척하지 않음
클로로포름BDHBDH1109-4LG
디메틸 설폭사이드BDHBDH1115-1LP
이소 프로필 알코올BDHBDH1133-1LP
메탄올BDHBDH20864.400
나일 레드VWRTCN0659-5G
파스퇴르 피펫 팁VWR14673-010
염화나트륨BDHBDH9286-500G
식물성 기름월마트9276383모든 식물성 기름은 신선한
지르코니아/실리카 비드(직경 0.5mmBiospec 제품11079105z
Equipment
Analytical balanceMettler-ToledoXS205DU소수점 이하 4자리 정확도 이상
가능 비드 균질화기Omni19-040E
벤치탑 마이크로 원심분리기ThermoHeraeus Fresco 21(24x2 포함1.5 및 2mL 튜브를 처리할 수 있는 로터 포함
드라이 블록히터 VWR75838-282마이크로플레이트용 드라이 블록 포함
Labconco 76705202.5L 동결 건조 시스템
대형 탁상용 원심분리기ThermoHeraeus Megafuge 16R Tissue400 mL 병, 50 mL 튜브 및 15 mL 튜브를 처리할 수 있는 로터 포함
마이크로플레이트 리더분자 장치SpectraMax M2흡광도 및 형광을 판독할 수 있는
Vortex mixerVWR10153-838
상류의 공기 조절용 후 가스 혼합용 ) )인 한 작동해야 합니다.)

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