Golgi 세포 표면에서 단백질의 역행 수송 막 항상성 유지에 필수적 이다. 여기, 우리는 화학적 HeLa 세포에서 기능성된 nanobodies를 사용 하 여 재조합 단백질의 세포 표면에 골 교통을 분석 하는 방법을 설명 합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
배양된 세포에서 기능성된 Nanobodies를 사용 하 여 Trans Golgi 네트워크 Endocytic 통풍 관 및 역행의 분석
이 논문에서
요약
초록
수송 단백질은 골을 넘어 셀 표면에서 막의 항상성, 세포 기관이 정체성과 생리학에 대 한 필수적입니다. 공부 하 고 퇴행 성 단백질 트래픽, 최근 고정 및 라이브 셀 이미징, 전자 현미경, 또는 화학적 여 골 복잡 한 세포 표면에서 수송 분석을 다양 한 nanobody 기반 툴킷을 개발 했습니다. 우리 설계 기능성된 안티 녹색 형광 단백질 (GFP) nanobodies-작고, 단위체, 높은 선호도 단백질 바인더-셀 라인 막 단백질 extracellular GFP moiety와 관심의 표현에 적용 될 수 있는. Derivatized nanobodies GFP 기자에 바인딩된 특별히 내 면 고 기자 정렬 경로 따라 피기백을 수송. Nanobodies은 기능성을 형광 현미경 검사 법에 의해 역행 수송을 따라 하는데 과산화 효소 2 전자에 의해 기자 nanobody 복합물의 ultrastructural 지역화를 조사 (APEX2)와 영상 살 fluorophores와 현미경 검사 법, 그리고 trans Golgi 네트워크 (TGN) 도착의 활동을 평가 하기 위해 티로신 sulfation (TS) 모티브. 이 방법론 문서에서는, 우리는 bacterially 표현 하 고 기능성된 nanobodies 정화 일반 절차 개요. 우리는 mCherry 및 TS 수정 nanobodies endocytic 통풍 관 및 TGN 도착 화물 단백질의 분석을 사용 하 여 우리의 도구를 사용 하 여를 강력한를 보여줍니다.
서론
단백질과 지질 세포 표면에서 다양 한 세포내 구획을의 역행 트래픽이 막 항상성 분 비를 균형 잡히게 하 고 참가자 전송 기계1 의 구성 요소를 재활용의 유지 보수에 대 한 중요 한 , 2. 다음 clathrin-또는-독립적인 endocytosis 통해 국제화, 단백질 및 지질 화물은 먼저 일찍 채울 endosomes 어디에서 그들은 더 중 엔 lysosomal 시스템, 플라즈마 막에 재활용 따라 리디렉션 또는 trans Golgi 네트워크 (TGN) 대상. 다양 한 양이온 종속 및 양이온 독립만 노 오 스 6 인산 염 수용 체 (CDMPR 및 CIMPR) 등 참가자 막 횡단 화물 수용 체의 기능 사이클의 일부인는 TGN endosomes 및 셀 표면에서 재활용 제공 새로 합성 늦은 endosomes와 리소좀3,,45, sortilin 및 SorLA6,7, 및 Wntless (WLS) 수송 하는 세포 표면에 Wnt lig....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. 세균성 전이 기능성된 Nanobodies
참고: 이 프로토콜은 앞에서 설명한30식, 정화, 고 기능성된 안티-GFP nanobodies의 분석에 대 한 최적화 되었습니다. 다른 단백질 moieties와 derivatization이 표준 프로토콜의 수정이 필요할 수 있습니다.
- 해 동 chemocompetent 박테리아 (~ 100 µ L) 단백질 표정에 적합 (예를 들면, 대장균 로제타 BL21 (DE3) 셀) 얼음에 그들을 배치 하 여.
참고: Chemocompetent 표준 실험실 절차에 따라 세균 셀을 준비 합니다. 또한, 화학적으로 유능한 세균성 세포는 상업적으로 구입할 수 있습니다. - 추가 50 기능성된 nanobodies 인코딩 플라스 미드의 ng. 충분 한 사이트 biotinylation nanobody 기자의 세균성 식 중, 또한 추가 삼 배 초과 (150 ng) 인코딩 biotin 리가 BirA 세균성 식 플라스 미드의 (참조 표 1 플라스 미드 정보). 부드럽게 피펫으로 위쪽 및 아래쪽입니다.
참고:....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
다양 한 세포내 목적지 역행 단백질 교통 조사, 우리는 최근 레이블 및 셀 표면30에서 재조합 융합 단백질을 따라 하는 안티-GFP nanobody 기반 도구를 설립 했습니다. 여기, 그러한 세균 생산 nanobodies derivatized 그리고 TGN 도착 sulfation 분석 조사를 그들의 사용 뿐만 아니라 형광 현미경 검사 법 및 immunoblotting, endocytic 통풍 관 공부를 그들의 응용 프로그램을 보여 보여 줍니다. 후자의 응용 프로그램은이 프로토콜의 방법론 초점.
우리는 표준 분자 복제30일반적인 기능을 가진 다른 공업화 안티-GFP nanobodies의 도구 상자를 생성. 우리의 간단한 (표준) nanobody, VHH-성병, VHH 도메인, 포함.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
Nanobodies 많은 이점이 기존의 항 체와 단백질 바인더 장비의 신흥 클래스 대표: 그들은 작은, 안정, 단위체, 높은 친 화력과 부족 이황화 채권33,35, 에 선정 될 수 있다 44 , 45. 세포 배양 시스템에 유기 체 개발 생물학46,47,48,49, 결정 화도 보호자를 같은 응용 프로그램의 숫자에 사용 됩니다 억제제 또는 효소54,55의 활동 변조기.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 작품은 그랜트 31003A-162643 스위스 국립 과학 재단에 의해 지원 되었다. 우리 니콜 Beuret는 Biozentrum 이미징 핵심 시설 (IMCF) 지원에 대 한 감사합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 항 GFP 항체 | Sigma-Aldrich | 118144600001 | 제품은 Sigma-Aldrich에 의해 유통되지만 Roche |
| Anti-His6 항체 | Bethyl Laboratories | A190-114A | |
| 항 액틴 항체 | EMD Millipore MAB1501 | ||
| 염소 항 토끼 HRP | Sigma-Aldrich | A-0545 | |
| 염소 항 마우스 HRP | Sigma-Aldrich | A-0168 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | 1x PBS/1%BSA |
| 디메틸 설폭사이드(DMSO) | 프로그램 | A3672 | |
| D-비오틴 | Sigma-Aldrich | B4501 | 멸균 500mM NaH2PO4 또는 DMSO |
| 5-aminolevuilnic acid(dALA)에 용해 염산염 | Sigma-Aldrich | A3785 | 멸균수에 용해 |
| DNase I | Applichem | A3778 | 멸균수에 용해 |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | 18037059001 | 제품은 Sigma-Aldrich에 의해 유통되지만 Roche |
| Brefeldin A (BFA) | 에서 제조Sigma-Aldrich | B5936 | |
| Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | 바이오컨셉 | 4-01F00-H | |
| L-글루타민 | 애플리켐 | A3704 | |
| 둘베코' s 변형 된 독수리' s 매체 (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| 태아 송아지 혈청 (FCS) | Biowest | S181B-500 | |
| 황산 나트륨 -35 | Hartmann Analytics | ARS0105 | 제품에는 5 mCi |
| Earle's balanced salts | Sigma-Aldrich | E6267 | |
| MEM 아미노산 (50x) 용액 | Sigma-Aldrich | M5550 | |
| MEM 함유 비타민 용액 (100x) | Sigma-Aldrich | M6895 | |
| cOmplete, Mini Protease 억제제 칵테일 | Sigma-Aldrich | 11836153001 | 제품은 Sigma-Aldrich에 의해 유통되지만 Roche |
| Isopropyl-beta; -D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Applichem | A1008 | 멸균수에 용해되고 재고는 1 M |
| Carbenicillin disodium salt | Applichem | A1491입니다. | 멸균수에 용해, 스톡은 100 mg/mL |
| Kanamycin sulfate | Applichem | A1493 | 멸균수에 용해, 스톡은 100 mg/mL |
| Coomassie-R (Brilliant Blue) | Sigma-Aldrich | B-0149 | |
| 파라포름알데히드 (PFA) | Applichem | A3813 | |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Ni Sepharose 고성능 | GE Healthcare | 17-5268-01 | |
| His GraviTrap 컬럼 | GE Healthcare | GE11-0033-99 | |
| His 버퍼 키트 | GE Healthcare | GE11-0034-00 | |
| 일회용 PD10 탈염 컬럼 | GE Healthcare | GE17-0851-01 | |
| Mini-Protean TGX 젤, 4-20%, 15-웰 | 바이오-라드 | 456-1096 | |
| 둘베코' s 인산염 완충 식염수(DPBS) w/o Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 35mm 접시 | Falcon | 353001 | |
| 6웰 플레이트 | TPP | 92406 | |
| 유리 커버슬립(No. 1.5H) | VWR | 631-0153 | |
| 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF) | Applichem | A0999.0025 | 40% DMSO 60% 이소프로판올에 용해, 500mM |
| 트립톤 | Applichem | A1553 | |
| 효모 추출물 | Applichem | A1552 | |
| 염화마그네슘 육수화물 | Merck Millipore | 105833 | 멸균수에 용해, 스톡은 1M |
| 염화칼슘 이수화물 | 102382 | 멸균수에 용해, 스톡은 1M | |
| 염화나트륨 | Merck Millipore | 106404 | 멸균수에 용해되며 재고는 5M입니다. |
참고문헌
- Johannes, L., Popoff, V. Tracing the retrograde route in protein trafficking. Cell. 135 (7), 1175-1187 (2008).
- Bonifacino, J. S., Rojas, R. Retrograde transport from endosomes to the trans-Golgi network. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 7 (8), 568-5....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
태그
