이 프로토콜에는 배아 Astyanax cavefish에 유전자 발현의 시각화 수 있습니다. 이 방법은 일반적인 배경 얼룩을 최소화 하면서 진 식 신호를 극대화 하는 목적으로 개발 되었습니다.
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이 논문에서
요약
초록
최근 몇 년 동안에서 맹인 멕시코 cavefish (Astyanax mexicanus)에 대 한 초안 게놈이 나왔다, 유전자의 수천의 시퀀스 id를 공개. 이 신흥 모델 시스템에 대 한 사전 연구는 다양 한 동굴 관련 고기와 관련 된 수많은 양적 특성 loci (QTL) 식별 포괄적인 게놈 넓은 조사에 대문자. 그러나, phenotypic 변화에 대 한 상속 기초에 관심사의 유전자를 연결할 수는 중요 한 도전 남아 있습니다. Troglomorphic 진화에서 개발의 역할의 더 깊은 이해를 촉진 수 있는 하나의 기술은 전체 마운트 제자리 교 잡 이다. 이 기술은 직접 동굴 및 표면 주거 형태 사이의 유전자 발현을 비교, 지명 후보 유전자 설립된 QTL 기본, 다음-세대 시퀀싱 연구에서 유전자 식별 또는 다른 개발을 구현할 수 있다 검색 기반 접근입니다. 이 보고서에서 우리는 널리 제시 연구 시스템을 넘어 잘 사용 하기 위해 적용할 수 있는 유연한 검사 목록에서 지 원하는 간단한 프로토콜을 제시. 그것은 기대 Astyanax 지역 사회를 넘어이 프로토콜 광범위 한 자원으로 사용할 수 있습니다.
서론
제자리 교 잡 착 고정된 조직 유전자 표현 패턴1을 시각화 하는 일반적인 방법입니다. 이 기술은 다양 한 생물 학적 연구에 대 한 다른 전통적인2 및 비 전통적인3 모델 시스템에서 년간 수행 되었습니다. 그러나, 여러 단계 및 시 약은이 절차를 성공적으로 수행 하는 데 필요한. 결코이 방법을 수행한 조사 과정을 시작 될 수 있습니다 많은 단계 때문에 협박. 또한,이 절차의 긴 자연에 빌려준다 기술적인 오류를 해결 하기 어려울 수 있습니다.
이 글의 전반적인 목표는이 교 잡 기술은 다양 한 연령층에 접근할 수 렌더링 하는 간단 하 고 간단한 방법을 제시. 오류에 대 한 소개를 줄이기 위해, 선물이 고품질 유전자 식 얼룩 및 일반적인 배경 신호를 최소화 하는 간단한 접근. 이 절차는 다른 접근 Danio rerio4와 같은 전통적인 모델 시스템에서 개발 유사 합니다. 여기, 우리는 프로토콜의 주의 구현할 다운로드 점검 (보충 파일 1)를 사용 하 여 각 단계의 주의 구현 촉진을 목표로 합니다. 이 일에 대 한 근거가이 절차에 관련 된 여러 단계를 통해 조직 촉진 것입니다. 이 문서 전체 마운트 제자리 교 잡 배아 개발 수행에 관심이 있는 연구자에 적합 하지만 아직 절차 수행 하지. Astyanax 연구에 대 한 선택된 방법의 장점은 것 그것이 테스트 되 고 cavefish에 따라서 비교 식 분석을 촉진 하는 표면 물고기 변경해 입증. Astyanax 및 다른 시스템에 대 한 연구에서 연구자에 의해 제시 메서드를 사용할 수 있습니다.
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프로토콜
여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 대학 신시내티 (프로토콜 #10-01-21-01)에 의해 승인 되었습니다.
1입니다. 고정
- 번 식 탱크에서 Astyanax mexicanus 배아의 원하는 번호를 분리 하 고 한 번에 ~ 50 배아를 수정. 태아는 크고 오래 된, 경우 25도 고정 되도록 한 번에 해결 하기 위해 필요할 수 있습니다.
- 태아의 나이 따라 마 취의 IACUC 승인 방법을 이용 한다. 작동 신 시스템으로 이전 배아에 대 한 마 취 과다 통해 배아를 희생. 따라서 통증과 유기 체에 대 한 불편을 최소화 하기 위해 ~ 1 %tricaine (pH 7.4에 버퍼링)의 솔루션에 배아를 배치 합니다.
- 배아, 터치 응답 하지 일단 대체 시스템 물 tricaine를 포함 하 고 ~ 1 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, pH 7.4) x 1 추가 합니다.
- PBS 솔루션을 제거 하 고 4 %paraformaldehyde (PFA)의 1 mL를 추가 합니다. 4 ° c.에 하룻밤 배아를 수정
주의: PFA (즉, 그것은 가연성 이며 피부와 폐 자극) 유해 하, 주의 처리.
2입니다. 탈수
- 배아, 탈수 통 솔루션을 제거 하 고 1 mL의 PBS로 씻어. 린스 하는 동안 플랫폼 통에 각도 (30 °와 45 °) 사이 포함 하는 태아 튜브를 놓습니다. 계속 씻어 두 번 배아 세척 당 5 분.
- 배아는 chorion 아직도 가진다면 모든 50 배아는 100 x 25 mm 페 트리 접시에 놓고 조심 스럽게 시계의 겸 자 (예: #5 집게) 현미경의 2 세트를 사용 하 여 chorions에서 그들을 분리 합니다.
참고: 아래, 그리고 프로토콜의 나머지 부분에 대 한 설명 하는 단계 동안 신중 하 게 제거 모든 액체 깨끗 한를 사용 하 여 이전 단계에서 다음 솔루션을 추가 하기 전에 유리 파스퇴르 펫 - 메탄올 (MeOH) 아래에 설명 된의 점점 집중된 세척의 시리즈에 배아를 탈수. 희석 솔루션 각 4 mL 유리 유리병에가의 500 µ L 1 mL 전체 볼륨을 기반으로 합니다. 플랫폼 통에 상 온 (RT)에서 모든 탈수 단계를 수행 합니다.
- 조심 스럽게 PBS 솔루션 제거. 25 %MeOH 솔루션 (MeOH의 250 µ L) + PBS의 750 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 5 분에 대 한 플랫폼 통에 흔들.
- 조심 스럽게 제거 25 %MeOH 솔루션. 50 %MeOH 솔루션 (MeOH의 500 µ L) + PBS의 500 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 5 분에 대 한 플랫폼 통에 흔들.
- 조심 스럽게 제거 50 %MeOH 솔루션. 75 %MeOH 솔루션 (MeOH의 750 µ L) + PBS의 250 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 5 분 동안 플랫폼 통에 흔들.
- 조심 스럽게 제거 75 %MeOH 솔루션. 100 %MeOH 솔루션 (MeOH의 1 mL)을 추가 합니다. 부드럽게 5 분이 단계 3 번 반복에 대 한 플랫폼 통에 흔들.
- 이 시점에서,-20 ° C (장기)에 그들의 유리 튜브에 필요에 따라 탈수 배아를 저장 합니다. 또는 하루 1 프로토콜의 직접 진행 합니다.
3. 주 1: 재
- -20 ° C 냉장고에서 탈수 배아를 얻기 (또는 단계 2.5에서 직접 진행).
- 배아는 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 정렬 합니다. 하나에 따라 morphotype (즉, 동굴 및 표면)를 정렬할 수 있습니다 그리고 유전자의 수는 각 실험에서 평가. 한 번 정렬 유리병 당 일반적으로 더 이상 12 배아가 있다. 조직 유지, 병 및 각 유전자에 대 한 펫을 지정 하 컬러 랩 테이프를 사용 합니다. 배아는 전체 프로토콜을 통해 같은 유리병에 있을 것입니다.
참고: 장소 100%에서 파스퇴르 피 펫의 끝 사이 소독 EtOH를 사용 합니다. - 이후 단계에서 사용 될 70 ° C에 떨고 물 목욕을 설정 합니다. 정렬 된 배아의 튜브에 MeOH 밖으로 신중 하 게, 그리고 새로운 100%의 500 µ L를 바꿉니다 MeOH. 세척 짧게 (~ 1 분) 플랫폼 통에.
- 플랫폼 통에 트윈 20 (PBT, 아래 참조)와 1 x PBS의 증가 농도에 배아 리하이드레이션 희석은 바탕 1 mL 최종 희석 볼륨 500 µ L 각 유리병에가.
- 25 %PBT 솔루션 (PBT, MeOH의 750 µ L의 250 µ L)를 추가 합니다. 부드럽게 5 분에 대 한 플랫폼 통에 흔들.
- 조심 스럽게 제거 25 %PBT 솔루션. 50 %PBT 솔루션 (PBT, MeOH의 500 µ L의 500 µ L)를 추가 합니다. 부드럽게 5 분에 대 한 플랫폼 통에 흔들.
- 조심 스럽게 제거 50 %PBT 솔루션. 75 %PBT 솔루션 (PBT, MeOH의 250 µ L의 750 µ L)를 추가 합니다. 부드럽게 5 분에 대 한 플랫폼 통에 흔들.
- 조심 스럽게 제거 75 %PBT 솔루션. 100 %PBT 솔루션 (PBT의 1 mL)을 추가 합니다. 부드럽게 5 분이 단계 3 번 반복에 대 한 플랫폼 통에 흔들.
4. 주 1: 소화와 고정
- PBT의 2 개 mL를 PK (20 mg/mL)의 1 µ L을 추가 하 여 가수분해 K (PK) 솔루션을 준비 합니다.
- 후속 단계의 기대에,-20 ° C 저장에서 교 잡 버퍼 (Hyb-및 Hyb +; 보완 파일 2 와 보조 파일 3참조)와 PFA의 냉동된 aliquots를 가져옵니다.
- PFA 실시간에서 해빙 하는 것을 허용합니다
- Hyb-및 Hyb +의 aliquots 회전 70 ° C의 물 욕조에 배치 합니다. 모든 시 약 및 작은 "개 스" 메쉬 바닥 부동 목욕 정수기 내부 내부 튜브를 배치 합니다. 간단한 추가 및 제거의 튜브와 튜브 회전 70 ° C 물 탕에서 수 있습니다.
- 부드럽게 추가 배아 모든 조직 확보의 vial(s)에 PK 솔루션 솔루션으로 완전히 덮여 있다. 태아 ~ 12 분 PK 작업 솔루션 플랫폼 셰이 커에 대 한 다이제스트.
참고: 소화의 길이 최적의 결과 보장 하기 위해 수 사관에 의해 변화 될 수 있습니다. - 부드럽게 PK 솔루션에서 그리고 모든 나머지 PK. 희석 PBT와 유리병을 간단히 홍수
- PBT 솔루션에서 그리고 새로운 PBT의 500 µ L를 바꿉니다. 5 분에 대 한 플랫폼 셰이 커에 린스에 솔루션을 수 있습니다.
- PBT에서 그리고 해 동된 4%의 500 µ L를 바꿉니다 PFA. 실시간에서 플랫폼 통에 20 분 동안 품 어 배아 있도록
- 4% 그리기 PFA, 짧게 어떤 나머지 PFA 희석 PBT와 유리병을 홍수. PBT, 떨어져 그리고 신선한 PBT의 500 µ L를 바꿉니다. 배아 플랫폼 통에 5 분 동안 린스를 허용 합니다. 이 단계 4 번 더 반복 합니다.
5. 주 1: Prehybridization
- 유리병으로 미리 데워 Hyb 솔루션의 장소 500 µ L. 신중 하 게는 70 ° C 물 (가스 켓) 내부 목욕 없이 5 분 동안 흔들어에 유리병을 배치 합니다.
- Hyb 솔루션에서 그리고 미리 데워 Hyb + 솔루션의 500 µ L로 유리병을 홍수. 다시 흔들어 (40 rpm)와 70 ° C 물 목욕으로 유리병을 놓습니다. 어느 4 h incubate 나 밤새.
참고: 4 h 인큐베이션 총에서 4 일 동안 지속 될 것 이다 완전 한 현장에서 프로토콜을 얻을 것입니다. 여기,이 단계는 총에서 5 일 지속 되는 프로토콜을 보장할 하룻밤 부 화도 제공 됩니다.
6. 주 2: 교 잡
- 5 분 동안 흔들어 뜨거운 물 목욕으로-20 ° C 냉동 고에서의 Hyb + 약 수를 놓습니다.
- 유리병에서 떨어져 Hyb + 그리고 미리 데워 Hyb + 500 µ L를 바꿉니다. 이 솔루션을 신중 하 게 각 유리병에 RNA 프로브 2 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 프로브 분배 되도록 유리병을 소용돌이 친다.
- 40 rpm에서 떨고 있는 동안 70 ° C 온수 목욕에서 Hyb + (추가 조사)와 솔루션 밤새 품 어.
참고: 하나 다시 Hyb + (프로브) 솔루션을 사용할 수 있습니다. 이 위해 걸릴 Hyb + 프로브 처음부터 실행-20 ° C 냉동 고에서 장소 5 분 바꾸기 Hyb + 1 일에서에 대 한 뜨거운 물 목욕에 프로브 Hyb + 프로토콜 고 뜨거운 물 목욕에서 하룻밤 배양.
7. 주 3: 솔루션 준비
- Microcentrifuge 튜브 "유전자의 관심" RNA 프로브 Hyb + 표시를 준비 합니다. 3 일 동안 사용할 수 있는 희석의 시리즈를 준비 합니다.
- Hyb-및 염 분 나트륨 시트르산 (SSC, 0 ~ 100%)의 희석의 다음 시리즈를 준비 6 별도 튜브를 사용 하 여, 1 mL 볼륨, 그리고 장소에서 떨고 70 ° C에 물 목욕: 1 = 100% 튜브 Hyb-(1 mL의 Hyb-): 2 = 25% 튜브 2 x SSC (250 µ L 2의 x SSC의 Hyb-750 µ L); 3 = 50 %2 x SSC 튜브 (2 x SSC의 Hyb-500 µ L의 500 µ L); 4 = 75 %2 x SSC 튜브 (2 x SSC의 Hyb-250 µ L의 750 µ L); 튜브 5 = 100 %2 배 SSC (2 x SSC의 1 mL); 6 = 100 %0.2 x SSC (0.2 x SSC의 2 개 mL) 튜브.
참고: 심하지 SSC의 농도의 0.2 2 x에서 변경 x. - 튜브를 분리 1 mL 볼륨에 PBT와 SSC의 희석의 다음 시리즈를 준비 하 고 RT에 4를 사용 하 여: 1 = 25% 튜브 PBT (PBT, 0.2의 750 µ L의 250 µ L x SSC); 2 = 50 %PBT 튜브 (PBT, 0.2 x SSC의 500 µ L의 500 µ L); 3 = 75 %PBT 튜브 (PBT, 0.2 x SSC의 250 µ L의 750 µ L); 4 = 100 %PBT (PBT의 1 mL) 튜브.
- 포함 된 트윈 20 (MABT) 작업 솔루션 maleic 산 버퍼의 2 mL 튜브를 준비 합니다.
- 두 개의 15 mL 원뿔 튜브 차단 솔루션의 준비. 각 관에서 MABT의 10 mL를의 차단 시 약 0.2 g을 추가 ( 추가 파일 4참조). (최대 3 h) 솔루션에 완전히 녹아 때까지 nutating 믹서 (또는 플랫폼 통)에 모두 관을 놓습니다.
- Hyb-및 염 분 나트륨 시트르산 (SSC, 0 ~ 100%)의 희석의 다음 시리즈를 준비 6 별도 튜브를 사용 하 여, 1 mL 볼륨, 그리고 장소에서 떨고 70 ° C에 물 목욕: 1 = 100% 튜브 Hyb-(1 mL의 Hyb-): 2 = 25% 튜브 2 x SSC (250 µ L 2의 x SSC의 Hyb-750 µ L); 3 = 50 %2 x SSC 튜브 (2 x SSC의 Hyb-500 µ L의 500 µ L); 4 = 75 %2 x SSC 튜브 (2 x SSC의 Hyb-250 µ L의 750 µ L); 튜브 5 = 100 %2 배 SSC (2 x SSC의 1 mL); 6 = 100 %0.2 x SSC (0.2 x SSC의 2 개 mL) 튜브.
8. 주 3: 조사 제거
- 유리 피 펫 파스퇴르 Hyb + (프로브) 솔루션에서 그립니다 고 그것은 살 균, microcentrifuge 튜브를 표시 합니다. (프로브 라벨 성공 하면) 나중에 사용-20 ° C 냉동 실에이 관을 유지 합니다.
- 신중 하 게는 따뜻한 SSC/Hyb-희석 (아래 표시)의 500 µ L를 추가 합니다. 각 70 ° C 떨고 물 탕에서 10 분 다음 솔루션의 각에서 품 어.
- 100% 순차적으로 품 어 Hyb-Hyb-(1 mL), 25 %2 x SSC (250 µ L 2의 x SSC의 Hyb-750 µ L), 50 %2 x SSC (500 µ L 2의 x SSC의 Hyb-500 µ L), 75 %2 x SSC (750 µ L 2의 x SSC, 250 µ L의 Hyb-), 100 %2 x SSC (2의 1 mL x SSC) 100 %0.2 x SSC (0.2의 2 mL x SSC).
- 마지막 단계, 10 분에 대 한 다음 솔루션의 각에서 품 어. 다음 외피의 모든 플랫폼 셰이 커에 RT에서 열릴: 25 %PBT (PBT, 0.2의 750 µ L의 250 µ L x SSC), 50 %PBT (PBT, 0.2의 500 µ L의 500 µ L x SSC), 75 %PBT (PBT, 0.2의 250 µ L의 750 µ L x SSC) 100 %PBT (PBT의 1 mL).
- 10 분 부 화 후 100% 제거 PBT, 각 유리병에 MABT의 500 µ L을 추가 하 고. 5 분 동안 두 번이 단계를 반복 합니다.
9. 주 3: 차단
- 각 유리병 및 튜브 (준비 단계 7.1.4에서에서) 중 하나에서 premixed 차단 솔루션 홍수에서 MABT를 제거 합니다. 실시간에서 ~ 4 h nutating 믹서에 장소 유리병
- 2 추가 안티 DIG AP 팹의 µ L 10 mL 차단 솔루션 (준비 단계 7.1.4에서에서) 그리고 짧게 소용돌이의 두 번째 약 병을 조각.
- 채워 각 유리병 거의 완전히 차단 솔루션 (~ 5 mL)와 4 ° c.에 냉장고에 하룻밤 nutating 믹서에
10. 주 4: MABT 린스
- MABT에 10% 정상 염소 혈 청 (NGS)의 재고 유리병을 준비 (900 µ L MABT의 NGS의 100 µ L 추가).
- 각 유리병에 차단 솔루션에서 그리고 각 유리병에 500 µ L NGS/MABT 혼합물의 추가. 플랫폼 셰이 커에 RT에 25 분 동안 품 어 배아를 허용 합니다.
- 100%의 500 µ L NGS/MABT 혼합물 바꿉니다 MABT. 플랫폼 셰이 커에 RT에서 30 분 동안 품 어. 이 린스 11 번 이상 하루 30 분 마다 수행 합니다.
- 100 %MABT와 4 ° c.에 냉장고 또는 대형 챔버에 하룻밤 nutating 믹서에 유리병을 채우기
11. 주 5: 프로브 시각화
- 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (AP) 버퍼의 약 50 mL 수 준비 ( 보충 파일 5참조). 50 mL 원뿔 튜브 빛 노출을 제한에 알루미늄 호 일에 싸여 다음 결합: 1 M Tris (pH 9.5), 50 mM MgCl2, 1%의 5 mL의 5 mL의 5 mL 트윈 20, 1 M NaCl, ddH2O의 30 mL의 5 mL.
- MABT를 제거 하 고 AP 버퍼 (호 일에 싸여 튜브) 1 mL를 바꿉니다. 5 분 동안 씻어 보자. MABT의 완전 한 제거를 보장 하기 위해 두 번 이렇게.
- AP 버퍼를 제거 하 고 AP 버퍼 3.5 μ 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate (BCIP) 및 4.5의 1 mL를 바꿉니다 니트로 블루 tetrazolium (NBT)의 μ. 매 시간 마다 반응까지 완료 되 면 갓된 AP 버퍼/NBT/BCIP로 바꿉니다. 매 15 분, 채색 반응 얼룩의 원하는 수준을 달성 때까지 자리를 차지할 수 있도록 검사, 밀접 하 게 모니터링 합니다. 침전 양식 하기 시작, 빨리 솔루션을 교체 합니다.
- 들러 채색 반응 (NBT/BCIP) 없이 신선한 100 %AP 버퍼에 배아를 rinsing PBT에서 5 분 계속 린스에 대 한 신호 (배경 얼룩의 최소 금액)와 최적의 수준을 달성 하는 때까지. 린스 표본 같습니다 AP 버퍼에 PBT의 희석을 증가 함께 계속: 25 %PBT (PBT, AP 버퍼의 750 μ의 250 μ), 린스 5 분; 50 %PBT (PBT, AP 버퍼의 500 μ의 500 μ), 린스 5 분; 75 %PBT (PBT, AP 버퍼의 250 μ의 750 μ), 5 분 동안 씻어.
- PBT nutating 믹서 최소 배경 얼룩이 지 원하는 때까지에 도달 하는 100%의 ~ 5 mL에 배아를 씻어. 스위치 밖으로 신선한 PBT 여러 번. 이것은 몇 일 걸릴 수 있습니다.
- 때 플랫폼 통에 살 균 PBS의 500 μ에 완료, 세척 배아 rinsing. 5 분 동안 두 번이 린스를 수행 합니다. PBS 세척 후 4%의 500 μ에는 표본에 수정 후 PFA 플랫폼 통에 RT에 1 시간에 대 한. 4%의 1 mL에서 하룻밤 수정 또는, 4 ° c.에 냉장고에는 PFA
- 신선한, 함께 정착 액을 대체 살 균 PBS. 수행이 린스 5 분 장소에 적어도 두 번 배아 100% 살 균 PBS의 ~ 4 ml에서와 4 ° c.에 긴 기간 저장
12입니다. 영상
- 3 %agarose 및 태 버퍼를 사용 하 여 페 트리 접시에 이미징 접시를 확인 합니다.
참고: 수량 얼마나 많은 접시는 필요에 따라 달라 집니다. 접시 여러 번 다시 사용할 수 있습니다. 젤 접시에 배아를 포함 하는 우울증을 만들려면 냉각 하는 동안 얕은 직사각형 형 페 트리 접시에 배치 하는 것이 좋습니다. - 배아는 PBS에서 접시에 놓습니다.
참고:이 부드럽게 그들을 밖으로 그들은 플라스틱 펫의 내부에 붙어 것입니다 발견 되었습니다 때문에 pipetting 대신 접시에 배아를 부 어 좋습니다. - 가벼운 현미경 검사 법 사용 하 여 각 배아를 시각화. 무딘 프로브를 사용 하 여 원하는 위치로 배아를 책략.
- 태아는 원하는 위치에 이미지를 가져가 라. 참고 완료 얼룩 얼룩의 잠재적인 저하를 방지 하는 몇 주 이내 태아의 이미지를가지고 하는 것이 중요 합니다.
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결과
이 보고서에서 우리는 높은-품질 유전자 표정 분석에 대 한 미 발달 Astyanax 표본의 라벨 수행 하는 단순 하 고 간단 접근 방식을 제공 합니다. 이 기술은 4 개 또는 5 일에 실시 될 수 있습니다 하 고 절차의 각 주요 단계 색된 순서도 (그림 1)에 표시 됩니다. 완료 되 면, 얼룩진된 배아 관심사의 특정 유전자를 표현 하는 조직에서 어두운 자주색 반음계 레이블을 항구 합니다. 우리는 성공적으로 Pachón cavefish (그림 2A-B, E)에 표면 물고기 (그림 2C-D, F) 배아가이 프로토콜을 실행 했다.
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토론
저하로 RNA의 취약점 때문 프로토콜의 가장 중요 한 단계 중 하나는 RNA 조사 살 균 합성을 염려 한다. 그러나, 경우는 조사 신중 하 게 생성 되 고 좋은 결과 제공 합니다, 그것은 이후의 착 반응에 활용할 수 있습니다. 두 번째 중요 한 단계는 프로토콜에서 사용 하는 모든 시 약의 주의 생산 이다. 이 프로토콜 포함 하므로 몇 일 및 많은 작은 단계, 그것은 필수적인 모든 시 약은 정확 하 게, 생산과 살 균 방식에서으로 저장. 또한, 그것은 근본적으로 중요 한 탐정 프로토콜에서 각 단계의 주의 트랙을 유지입니다. 우리는 단계 제공 된 검사 목록을 매우 정확 하 고 정확한 준공이이 프로토콜의 각 부분을 확보에 유용할 수 있습니다 나타났습니다.
우리는 종종 우리가 여기에 제시 된 프로토콜을 수정 하지 마십시오. 그러나, 조사자는 제안 하는 것 보다 서로 다른 온도에서 프로브 외피를 수행할 수 있습니다 (즉, 70 ° C). 교 잡 온도에서 약간의 변화는 RNA 프로브, 바인...
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
저자가이 원고에 도움이 의견에 대 한 총 연구소의 회원을 감사 하 고 싶습니다. 4 고 등 학생 들은 여름 인턴쉽 2017, 2018, 크리스틴 카오, 마이클 소장, 아키 리, 데이비드 은완코 등 동안이 프로토콜을 활용 하 길. HL은 UC 생물학 줄기 친목 2017의 여름 동안에 지원 됩니다. 이 작품은 국립 과학 재단 (뎁-1457630 JBG에), 그리고 국립 연구소의 치과 Craniofacial 연구 (NIH;에서 교부 금에 의해 지원 되었다 JBG에 DE025033)입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 10 mL 혈청학적 피펫 | VWR | 89130-888 | |
| 1000 mL 여과 장치 | VWR | 89220-698 | |
| 15 mL 원추형 | VWR-Greiner | 82050-278 | |
| 25 mL 혈청학적 피펫 | VWR | 89130-890 | |
| 250 mL 여과 장치 | VWR | 89220-694 | |
| 5 mL 혈청학적 피펫 | VWR | 89130-886 | |
| 50mL 원뿔 | VWR-Falcon | 21008-940 | |
| 500mL 여과 장치 | VWR | 89220-696 | |
| 안티-디곡시제닌-AP, 팹 단편 | Sigma-Roche | 11093274910 | |
| BCIP | Sigma-Aldrich | B8503-1G | 1g |
| 차단 용액 | Sigma-Roche | 11 096 176 001 | 50g |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A104-500 | 500 g |
| DIG RNA 라벨링 키트(SP6/T7) | Sigma-Roche | 11175025910 | |
| Eppendorf Tubes | VWR | 20170-577 | |
| 에탄올 | Fisher-Decon | 04-355-223 | 1 Gal |
| 포름아미드 | Thermo Fisher Scientific | 17899 | 100 mL |
| 유리 드람 바이알 | VWR | 66011-041 | 1 Dr |
| 유리 피펫 | Fisher Scientific | 13-678-8A | |
| HCl | Thermal-ScientificPharmco-AAPER | 284000ACS | 500mL |
| 헤파린 | 시그마 | H3393-25KU | |
| 염화마그네슘-결정질 | Fisher Scientific | M33-500 | 500g |
| 말레산 | 시그마 | M0375-100g | 100g |
| 메탄올 | Fisher Scientific | A452-4 | 4L |
| 분자 등급 물(RNase-free) | VWR | 7732-18-5 | 500mL |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | 3kg |
| NaOH 펠릿 | Fisher Scientific | S318-500 | 500g |
| NBT 기질 분말 | ThermoFisher Scientific | 34035 | 1g |
| 일반 염소 혈청 | Fisher-Invitrogen | 31873 | |
| 너트 믹서 | VWR | 82007-202 | |
| 파라포름알데히드 | 시그마 | 158127-500g | 500g |
| PBS 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 20L |
| 단백질 분해 효소 K(200mg/10ml) | Qiagen | 19133 | 10mL |
| 플라스틱 피펫 | VWR-Samco | 14670-147 | |
| RNAse | Sigma | R2020-250mL | 250mL |
| 쉐이킹 수조 12L | VWR | 10128-126 | 12L |
| 표준 아날로그 쉐이커 | VWR | 89032-092 | |
| Tris | Sigma Millipore-OmniPur | 9210-500GM | 500g |
| tRNA 효모 | Fisher-Invitrogen | 15401011 | 25mg |
| 트윈 20 | 시그마 | P9416-50mL | 50 mL |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc | 50-728-002 | |
| 염화리튬(LiCl) | 시그마-알드리치 | 203637-10G | 10g |
참고문헌
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