이 프로토콜에는 배아 Astyanax cavefish에 유전자 발현의 시각화 수 있습니다. 이 방법은 일반적인 배경 얼룩을 최소화 하면서 진 식 신호를 극대화 하는 목적으로 개발 되었습니다.
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이 논문에서
요약
초록
최근 몇 년 동안에서 맹인 멕시코 cavefish (Astyanax mexicanus)에 대 한 초안 게놈이 나왔다, 유전자의 수천의 시퀀스 id를 공개. 이 신흥 모델 시스템에 대 한 사전 연구는 다양 한 동굴 관련 고기와 관련 된 수많은 양적 특성 loci (QTL) 식별 포괄적인 게놈 넓은 조사에 대문자. 그러나, phenotypic 변화에 대 한 상속 기초에 관심사의 유전자를 연결할 수는 중요 한 도전 남아 있습니다. Troglomorphic 진화에서 개발의 역할의 더 깊은 이해를 촉진 수 있는 하나의 기술은 전체 마운트 제자리 교 잡 이다. 이 기술은 직접 동굴 및 표면 주거 형태 사이의 유전자 발현을 비교, 지명 후보 유전자 설립된 QTL 기본, 다음-세대 시퀀싱 연구에서 유전자 식별 또는 다른 개발을 구현할 수 있다 검색 기반 접근입니다. 이 보고서에서 우리는 널리 제시 연구 시스템을 넘어 잘 사용 하기 위해 적용할 수 있는 유연한 검사 목록에서 지 원하는 간단한 프로토콜을 제시. 그것은 기대 Astyanax 지역 사회를 넘어이 프로토콜 광범위 한 자원으로 사용할 수 있습니다.
서론
제자리 교 잡 착 고정된 조직 유전자 표현 패턴1을 시각화 하는 일반적인 방법입니다. 이 기술은 다양 한 생물 학적 연구에 대 한 다른 전통적인2 및 비 전통적인3 모델 시스템에서 년간 수행 되었습니다. 그러나, 여러 단계 및 시 약은이 절차를 성공적으로 수행 하는 데 필요한. 결코이 방법을 수행한 조사 과정을 시작 될 수 있습니다 많은 단계 때문에 협박. 또한,이 절차의 긴 자연에 빌려준다 기술적인 오류를 해결 하기 어려울 수 있습니다.
이 글의 전반적인 목표는이 교 잡 기술은 다양 한 연령층에 접근할 수 렌더링 하는 간단 하 고 간단한 방법을 제시. 오류에 대 한 소개를 줄이기 위해, 선물이 고품질 유전자 식 얼룩 및 일반적인 배경 신호를 최소화 하는 간단한 접근. 이 절차는 다른 접근 Danio rerio4와 같은 전통적인 모델 시스템에서 개발 유사 합니다. 여기, 우리는 프로토콜의 주의 구현할 다운로드 점검 (보충 파일 1)를 사용 하 여 각 단계의 주의 구현 촉진을 목표로 합니다. 이 일에 대 한 근거가이 절차에 관련 ....
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프로토콜
여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 대학 신시내티 (프로토콜 #10-01-21-01)에 의해 승인 되었습니다.
1입니다. 고정
- 번 식 탱크에서 Astyanax mexicanus 배아의 원하는 번호를 분리 하 고 한 번에 ~ 50 배아를 수정. 태아는 크고 오래 된, 경우 25도 고정 되도록 한 번에 해결 하기 위해 필요할 수 있습니다.
- 태아의 나이 따라 마 취의 IACUC 승인 방법을 이용 한다. 작동 신 시스템으로 이전 배아에 대 한 마 취 과다 통해 배아를 희생. 따라서 통증과 유기 체에 대 한 불편을 최소화 하기 위해 ~ 1 %tricaine (pH 7.4에 버퍼링)의 솔루션에 배아를 배치 합니다.
- 배아, 터치 응답 하지 일단 대체 시스템 물 tricaine를 포함 하 고 ~ 1 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, pH 7.4) x 1 추가 합니다.
- PBS 솔루션을 제거 하 고 4 %paraformaldehyde (PFA)의 1 mL를 추가 합니다. 4 ° c.에 하룻밤 배아를 수정
주의: PFA (즉, 그것은 가연성 이며 피부와 폐 자극) 유해 하, 주의 처리.
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결과
이 보고서에서 우리는 높은-품질 유전자 표정 분석에 대 한 미 발달 Astyanax 표본의 라벨 수행 하는 단순 하 고 간단 접근 방식을 제공 합니다. 이 기술은 4 개 또는 5 일에 실시 될 수 있습니다 하 고 절차의 각 주요 단계 색된 순서도 (그림 1)에 표시 됩니다. 완료 되 면, 얼룩진된 배아 관심사의 특정 유전자를 표현 하는 조직에서 어두운 자주색 반음계 레이블을 항구 합니다. 우리는 성공적으로 Pachón cavefish (그림 2A-B, E)에 표면 물고기 (그림 2C-D, F) 배아가이 프로토콜을 실행 했다.
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토론
저하로 RNA의 취약점 때문 프로토콜의 가장 중요 한 단계 중 하나는 RNA 조사 살 균 합성을 염려 한다. 그러나, 경우는 조사 신중 하 게 생성 되 고 좋은 결과 제공 합니다, 그것은 이후의 착 반응에 활용할 수 있습니다. 두 번째 중요 한 단계는 프로토콜에서 사용 하는 모든 시 약의 주의 생산 이다. 이 프로토콜 포함 하므로 몇 일 및 많은 작은 단계, 그것은 필수적인 모든 시 약은 정확 하 게, 생산과 살 균 방식에서으로 저장. 또한, 그것은 근본적으로 중요 한 탐정 프로토콜에서 각 단계의 주의 트랙을 유지입니다. 우리는 단계 제공 된 검사 목록을 매우 정확 하 고 정확한 준공이이 프로토콜의 각 부분을 확보에 유용할 수 있습니다 나타났습니다.
우리는 종종 우리가 여기에 제시 된 프로토콜을 수정 하지 마십시오. 그러나, 조사자는 제안 하는 것 보다 서로 다른 온도에서 프로브 외피를 수행할 수 있습니다 (즉, 70 ° C). 교 잡 온도에서 약간의 변화는 RNA 프로브, 바인.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
저자가이 원고에 도움이 의견에 대 한 총 연구소의 회원을 감사 하 고 싶습니다. 4 고 등 학생 들은 여름 인턴쉽 2017, 2018, 크리스틴 카오, 마이클 소장, 아키 리, 데이비드 은완코 등 동안이 프로토콜을 활용 하 길. HL은 UC 생물학 줄기 친목 2017의 여름 동안에 지원 됩니다. 이 작품은 국립 과학 재단 (뎁-1457630 JBG에), 그리고 국립 연구소의 치과 Craniofacial 연구 (NIH;에서 교부 금에 의해 지원 되었다 JBG에 DE025033)입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 10 mL 혈청학적 피펫 | VWR | 89130-888 | |
| 1000 mL 여과 장치 | VWR | 89220-698 | |
| 15 mL 원추형 | VWR-Greiner | 82050-278 | |
| 25 mL 혈청학적 피펫 | VWR | 89130-890 | |
| 250 mL 여과 장치 | VWR | 89220-694 | |
| 5 mL 혈청학적 피펫 | VWR | 89130-886 | |
| 50mL 원뿔 | VWR-Falcon | 21008-940 | |
| 500mL 여과 장치 | VWR | 89220-696 | |
| 안티-디곡시제닌-AP, 팹 단편 | Sigma-Roche | 11093274910 | |
| BCIP | Sigma-Aldrich | B8503-1G | 1g |
| 차단 용액 | Sigma-Roche | 11 096 176 001 | 50g |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A104-500 | 500 g |
| DIG RNA 라벨링 키트(SP6/T7) | Sigma-Roche | 11175025910 | |
| Eppendorf Tubes | VWR | 20170-577 | |
| 에탄올 | Fisher-Decon | 04-355-223 | 1 Gal |
| 포름아미드 | Thermo Fisher Scientific | 17899 | 100 mL |
| 유리 드람 바이알 | VWR | 66011-041 | 1 Dr |
| 유리 피펫 | Fisher Scientific | 13-678-8A | |
| HCl | Thermal-ScientificPharmco-AAPER | 284000ACS | 500mL |
| 헤파린 | 시그마 | H3393-25KU | |
| 염화마그네슘-결정질 | Fisher Scientific | M33-500 | 500g |
| 말레산 | 시그마 | M0375-100g | 100g |
| 메탄올 | Fisher Scientific | A452-4 | 4L |
| 분자 등급 물(RNase-free) | VWR | 7732-18-5 | 500mL |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | 3kg |
| NaOH 펠릿 | Fisher Scientific | S318-500 | 500g |
| NBT 기질 분말 | ThermoFisher Scientific | 34035 | 1g |
| 일반 염소 혈청 | Fisher-Invitrogen | 31873 | |
| 너트 믹서 | VWR | 82007-202 | |
| 파라포름알데히드 | 시그마 | 158127-500g | 500g |
| PBS 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 20L |
| 단백질 분해 효소 K(200mg/10ml) | Qiagen | 19133 | 10mL |
| 플라스틱 피펫 | VWR-Samco | 14670-147 | |
| RNAse | Sigma | R2020-250mL | 250mL |
| 쉐이킹 수조 12L | VWR | 10128-126 | 12L |
| 표준 아날로그 쉐이커 | VWR | 89032-092 | |
| Tris | Sigma Millipore-OmniPur | 9210-500GM | 500g |
| tRNA 효모 | Fisher-Invitrogen | 15401011 | 25mg |
| 트윈 20 | 시그마 | P9416-50mL | 50 mL |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc | 50-728-002 | |
| 염화리튬(LiCl) | 시그마-알드리치 | 203637-10G | 10g |
참고문헌
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. In situ hybridization: Application to neurobiology. , Oxford University Press. Oxford. (1987).
- Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as r....
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