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방법 논문

ATAC seq 분석 결과 주 인간의 CD4 + T 세포에서 낮은 미토 콘 드리 아 DNA 오염

12.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/59120

⸱

2019년 3월 22일

 ,  , 
1Department of Biology, Boston University, 2Department of Computer Science and Engineering, University of California San Diego, 3Bioinformatics Program, Boston University

이 논문에서

요약

여기, 우리는 transposase 액세스할 수 chromatin (ATAC-seq) 활성화 된 CD4 + 인간 림프 톨에 시퀀싱에 대 한 분석 결과 수행 하는 프로토콜을 제시. 프로토콜은 새로운 세포의 용 해 버퍼의 도입을 통해 3%로 50%에서 미토 콘 드리 아 DNA 읽기 오염 최소화 하기 위해 수정 되었습니다.

초록

ATAC seq 신속 하 고 간단한 접근 방식 게놈 넓은 접근 chromatin 매핑 때문에 epigenetics의 연구에 널리 사용 되는 방법론 되고있다. 이 문서에서 우리는 미토 콘 드리 아 DNA 읽기 오염 감소 하는 향상 된 ATAC seq 프로토콜 제시. 이 프로토콜에 최적화 된 세포의 용 해 버퍼 감소 3%의 평균에 미토 콘 드리 아 DNA 오염 이전 ATAC seq 프로토콜 분투 하는 동안 50% 오염 미토 콘 드리 아 DNA의 평균이 읽습니다. 이 향상 된 ATAC seq 프로토콜 시퀀싱 비용에 가까운 50% 감소를 허용 한다. 시연 어떻게이 높은-품질 ATAC seq 라이브러리 활성화 된 CD4 + 세포에서 준비 될 수 있다 데이터 분석을 통해 전체 혈액에서 CD4 + 림프 구 분리에서 단계별 지침을 제공 합니다. 이 향상 된 ATAC seq 프로토콜 다양 한 셀 형식에에서 검증은 고 chromatin 접근성을 공부 하는 연구원에 즉시 사용 될 것입니다.

서론

Transposase 액세스할 수 chromatin (ATAC-seq)을 시퀀싱에 대 한 분석 결과 빠르게 chromatin 구조 질의 대 한 주요 방법 되고있다. ATAC seq tagmentation, 분할 및 라이브러리는 시퀀싱 전체 게놈에서 chromatin 내게 필요한 옵션 확인 수를 생산 하는 동일한 효소에 의해 DNA의 태그의 과정을 통해 액세스할 수 있는 chromatin의 영역을 식별할 수 있습니다. 이 tagmentation 과정만 인하 nucleosomic 입체 지 장 때문 chromatin의 오픈 지역 활동적인 Tn5 transposase에 의해 중재 됩니다. 그것은 삭감으로 Tn5 transposase를 PCR에 의해 빠른 라이브러리 건설과 게놈 넓은 접근 chromatin1,2의 다음-세대 시퀀싱 시퀀싱 어댑터를 삽입 합니다.

ATAC seq 비교적 간단 하 고 빠른 프로토콜, 품질 및 그 결과, 그리고 시작 물자 필요의 작은 금액에서 결정 될 수 있는 정보의 범위 chromatin 접근성의 영역을 결정 하기 위해 선호 되는 방법 되고있다. 비해 DNase seq3 (는 또한 게놈 넓은 chromatin 접근성), MNase-seq4 (오픈 게놈 지역에 nucleosome 위치 결정), 그리고 포름알데히드 중재 시 키-seq5, ATAC seq 빠릅니다, 저렴 하 고 쉽게 재현 가능한1. 그것은 또한 더 중요 한 시작 물자의 500 핵, DNase seq3에 필요한 50 백만 핵에 비해 몇 가지 작업. ATAC seq는 또한 전사 인자 바인딩, nucleosome 위치, 및 오픈 chromatin 지역1의 영역을 포함 하 여 다른 방법 보다 chromatin 아키텍처에 대 한 자세한 정보를 얻을 수가 있다. 효과적인, 단일 셀 ATAC seq 프로토콜은 유효성이 검증, 단일 셀 레벨6,7chromatin 구조에 정보를 제공.

ATAC seq 식물8, 인간9, 그리고 다른 많은 유기 체를 포함 한 연구와 세포 종류의 넓은 스펙트럼에 걸쳐 chromatin 아키텍처의 특성에 사용 되었습니다. 그것은 또한 질병 상태7의 후 성적인 규칙 식별에 중요 한 되었습니다. 그러나, 가장 널리 사용 되는 ATAC seq 프로토콜 오염 시퀀싱 읽기 미토 콘 드리 아 DNA의 주요 단점은 포함합니다. 일부 데이터 집합에서이 오염 수준 시퀀싱 결과1의 60% 만큼 높을 수 있다. ATAC seq7,,1011의 더 효율적인 응용 프로그램을 허용 하려면 이러한 오염 미토 콘 드 리아 읽기를 줄이기 위해 필드에 공동된 노력이입니다. 여기 우리 현재 3%, 미토 콘 드리 아 DNA 오염 속도 감소 시키는 작업을 처리 하는 향상 된 ATAC seq 프로토콜 시퀀싱 비용10에서 약 50%의 감소를 허용 합니다. 이것은 CD4 + 림프 구 분리 및 활성화 및 미토 콘 드리 아 DNA 오염 최소화에 중요 한 향상 된 세포의 용 해 버퍼의 유선형된 과정에 의해 이루어집니다.

이 modifiedATAC-seq 프로토콜은 다양 한 인간의 기본 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)10, 인간의 기본 monocytes 그리고 마우스 수지상 세포 (미 발표)을 포함 하 여 기본 셀 유효성이 검증 되었습니다. 그것은 또한 사용 되었습니다 성공적으로 비 코딩 요소11의 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) 화면에서 흑색 종 세포 라인이. 또한,이 프로토콜에서 설명 하 고 GitHub에 제공 된 데이터 분석 패키지 제공 새로운 경험과 연구를 도구 ATAC seq 데이터를 분석 합니다. ATAC seq 전체 게놈에서 chromatin 접근성을 매핑하는 데 가장 효과적인 분석 결과 이며 여기에 도입 된 기존 프로토콜에 대 한 수정 연구원 낮은 미토 콘 드리 아 DNA 오염, 높은-품질 데이터를 생성 하면 시퀀싱 비용을 절감 하 고 ATAC seq 처리량을 개선.

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프로토콜

이 향상 된 프로토콜 데이터 분석 (그림 1)을 통해 전체 혈액의 시작 물자에서 CD4 + 세포의 ATAC seq를 수행 하기 위한 단계별 지침을 제공 합니다.

1. 전체 혈액에서 CD4 + T 세포의 고립

참고: 이 프로토콜에 대 한 시작 물자는 선정 될 시작 물자의 소스 연구 요구 사항에 따라 수 있도록 표준 절차를 사용 하 여 수집 하는 신선한 전 혈의 15 mL 이다. 필요에 따라 프로토콜을 확장 합니다. 미리 따뜻한 인산 염 (PBS) + 2% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) 실내 온도 (RT)를 버퍼링 하 고 CD4 + T 세포 농축 절차를 시작 하기 전에 rt 원심 분리기를 조정 합니다.

  1. 15 ml 50 mL 원뿔 튜브에 전체 혈액의 인간의 CD4 + T 세포 농축 칵테일의 750 µ L을 추가 하 고 반전에 의해 부드럽게 혼합. 20 분에 대 한 RT에서 품 어. 부 화 완료 되 면 튜브에 15 mL PBS + 2 %FCS 추가 하 고 반전에 의해 부드럽게 혼합.
  2. 15 mL 밀도 매체의 신선한 50 mL 원뿔 튜브를 준비 합니다. 조심 스럽게 희석된 혈액 샘플 밀도 매체/혈액 인터페이스를 형성을 방해 하지 않도록 되 고 밀도 매체의 상단에 레이어. 1과에서 내림차순 브레이크 설정 가속 g 와 RT x 1200에서 20 분 동안 원심 분리기.
    참고: 그것은 1과 밀도 매체에 셀 계층의 혼란을 피하기 위해 원심 분리기에 떨어져 브레이크 하강 가속도 설정 하는 중요 한.
  3. 좁은 줄기 전송 피 펫을 사용 하 여 밀도 매체/플라즈마 인터페이스에서 농축된 CD4 + T 세포를 수집 합니다. 신선한 50 mL 원뿔 튜브에 수집 된 세포를 전송. X g 와 실시간 423에서 8 분에 대 한 수집 된 CD4 + T 세포를 원심
    참고: 1.3 단계와 다음 단계를 모두를 ON 9 및 내림차순 브레이크에 원심 가속도 반환 해야 합니다.
  4. 상쾌한 고 PBS + 2 %FCS 50 mL로 두 번 셀 펠 릿을 세척, 423 x g 및 실시간 삭제에서 8 분에 대 한 최종 상쾌한 centrifuging 세척 하 고 씻어 셀 펠 릿 2 ml PBS + 2 %FCS 일시 중단.
  5. hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. ATAC seq를 계속 하려면 2.3 단계로 진행 합니다. 나중에 처리에 대 한 셀을 고정 하려면 1.6 단계를 진행 합니다.
  6. 1 백만 세포 당 신선한 냉동 매체 (FCS 90% + 10% 디 메 틸 sulfoxide)의 1 mL를 추가 합니다. 극저온 안전 튜브에 중간에 셀의 aliquot 1 mL. -80 ° c 하룻밤 느린 냉동 컨테이너에서에서 튜브를 배치 합니다. 다음 날, 장기 저장을 위한 액체 질소에 튜브를 전송 합니다.
    참고: 1 백만 CD4 + T 세포는 전체 혈액의 원래 볼륨의 2 mL 당 격리 될 것입니다. 냉동 매체의 1 mL aliquots에 500000 셀을 고정 합니다. 모든 사용에 신선한 냉동 매체를 확인 합니다.

2. 활성화 하 고 CD4 + T 세포를 정화

참고: 이 급속 한 프로토콜을 활성화 하 고 CD4 + T 세포만을 정화에 대 한 48 h와 95% 가능한 결과 CD4 + T 세포를 활성화 해야 합니다. 4 ° c 원심 분리기에서 프로토콜을 시작 하기 전에 냉각 하십시오.

  1. 얼음이 그냥 녹아 때까지 1 유리병 (500000) 37 ° C 물 목욕에 있는 CD4 + T 세포의 해 동. 부드럽게 미리 따뜻하게 로스웰 파크 기념 연구소-1640 (RPMI-1640) 미디어 라 함 완전 RPMI 10 %fcs 보충의 9 mL를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 세포를 전송 합니다.
    참고: 셀 DMSO에 노출을 피하기 위해 완전히 해빙 못하게 합니다.
  2. G 와 4 ° C x 1500 6 분 원심 분리기 삭제는 상쾌한 고 부드럽게 완전 한 RPMI의 2 mL에 펠 릿을 일시 중단. 아래로 스핀을 반복 하 고 상쾌한, 삭제 부드럽게 완전 한 RPMI의 0.5 mL에 셀을 일시 중단.
  3. hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 완전 한 RPMI 50000 셀 96 잘 라운드 바닥판의 당 200 µ L에 접시를 가진 세포 현 탁 액의 밀도 조정 합니다.
    참고: 하나에서 500 K CD4 + T 세포, 잘 당 200 µ L에서 50000 CD4 + T 세포의 접시 10 우물의 튜브를 고정.
  4. 마그네틱 구슬 인간 T-활성 제 안티-CD3 및 안티 CD28 항 체와 활용 준비.
    1. 1.5 mL 튜브에 ATAC seq 샘플 당 인간 T-활성 제 CD3/CD28 구슬의 aliquot 12.5 µ L. 1 x PBS의 1 mL와 구슬 세척 하 고 1 분에 대 한 자석에 튜브를 놓습니다.
    2. 조심 스럽게 제거 맑은 상쾌한 삭제, 자석에서 튜브를 제거 고 13에서 구슬 중단 µ L ATAC seq 샘플 당 RPMI 완료.
      참고: ATAC seq 샘플 처리의 수에 따라 필요한 구슬의 양을 계산 합니다. 이 프로토콜 당 500000 셀, CD3/CD28 구슬의 한 ATAC seq 샘플 구성 12.5 µ L를 요구 한다.
  5. CD4 + T 세포를 활성화 합니다. 2.1 ml 15 mL 원뿔 튜브에 완전 한 RPMI 매체의 500000 세포를 수집 하 고 미리 씻어 인간 T-활성 제 구슬의 12.5 µ L을 추가. 부드럽게 튜브를 거꾸로 하 여 혼합.
  6. 부드럽게는 메 마른 저수지와 접시 200 µ L 셀 당 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 둥근 바닥 96 잘 접시의 구슬의 구슬 가진 셀 전송. 37 ° C, 5% CO2 배양 기에서에서 48 h에 품 어.
  7. 인큐베이션 게시물, 원심 x g 와 실시간 제거 100 µ L 당 96 잘 접시, 구슬 손실 보장을 취소 하기 전에 원뿔 튜브에 수집에서 잘 매체의 423에서 8 분 96 잘 접시. 나머지 100 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 모두 1.5 mL 튜브에에서 수집 합니다.
    참고: 활성화 된 T 세포의 10 우물 1 mL 볼륨에 수집 됩니다.
  8. CD4 + 격리를 수행 합니다. 500000 셀 완전 RPMI의 1 mL에 미리 씻어 CD4 활용 된 구슬의 50 µ L를 추가 합니다. 피 펫, 구슬 및 셀을 결합 한다. 냉장고에서 4 ° C에서 20 분 동안 품 어. 구슬 및 셀 혼합 매 6 분 교 반 하십시오.
    참고: 이 프로토콜은 500000 셀의 한 샘플에 대 한 사용 될. 두 개 이상의 500000의 샘플에 대 한 필요에 따라 조정 합니다.
  9. 부 화 완료 되 면 2 분을 제거 하 고 상쾌한 때 분명 삭제에 대 한 자석에 튜브를 놓습니다. 자석에서 튜브를 제거, 1 mL의 PBS + 2 %FCS 구슬 바인딩된 셀을 중단, 1 분에 대 한 자석에 튜브를 교체 및 명확한 상쾌한 삭제 구슬 바인딩된 셀을 씻어. 3 세척의 총에 대 한이 프로세스를 반복 합니다.
    참고: 수 세척 하는 동안 어떤 구슬을 무시 하지 않도록 주의 하십시오.
  10. 최종 세척 후 1 분 제거에 대 한 자석에 튜브를 배치 하 고 삭제는 상쾌한 얼음에 펠 릿을 놓습니다. 섹션 3 (ATAC-seq)를 진행 합니다.

3입니다. ATAC seq

참고: 이 단계에서 핵 ATAC-이 대 한 활성화 된 CD4 + T 세포에서 격리 됩니다. 이 프로토콜에 사용 되는 세포의 용 해 버퍼 보다 효율적인 소화와 높은 품질의 결과 결과로 핵에 gentler 되도록 향상 되었습니다. 모든 원심 분리 단계 섹션 3에서에서 4 ° c.에 유지 고정 각도 원심 분리기와 수행 프로토콜을 시작 하기 전에 원심 분리기를 냉각 하십시오.

  1. 핵 격리를 수행 합니다. Resuspend 구슬 및 찬 세포의 용 해 버퍼 (10 mM Tris HCl, pH 7.4, 10 m m NaCl, 3 m MgCl2, 0.03% 폴 20 m)와 셀. 4 ° c.에서 10 분 동안 500 x g 에서 즉시 원심 제거 하 고 삭제는 상쾌한.
  2. Transposase 반응을 수행 합니다. 50 µ L Tn5 transposase 혼합 (표 1)의 고립 된 핵 펠 릿을 일시 중단 합니다. 들고 끝나면 4 ° C에서 40 ° C 뚜껑, 37 ° C에서 30 분 동안 thermocycler에서 품 어.
  3. Thermocycling, 후 즉시 다운 빠른 벤치탑 원심 분리기 회전을 수행 하 고 구슬 제품에서 제거 하려면 1 분에 대 한 자석에 튜브를 놓습니다.
  4. DNA 정화 열 튜브 자석에 분명 상쾌한 전송. 열 번 버퍼 PB의 250 µ L 고 버퍼 PE의 750 µ L로 두 번 씻는 다. 차입 버퍼의 10 µ L에서 샘플 elute 3.5 단계 직접 진행.
    참고: 이 단계는 여기 ATAC seq 라이브러리 라고 합자 어댑터와 DNA 파편을 증폭 한다. NGS 차선에서 실행 되도록 여러 ATAC seq 라이브러리 다중화 하기 위해서는 모든 예제 및 개별 샘플 (표 2)에 대 한 다른 인덱싱된 뇌관 2 인덱싱되지 않은 뇌관 1을 사용 합니다. 프라이 머는 1.25 µ M의 농도 작업에 사용 됩니다.
  5. Nuclease 무료 PCR 튜브, 순서와 볼륨에 지정 된 구성 요소를 결합 하 여 초기 PCR 증폭 반응 설정 표 3. thermocycler에 PCR 튜브를 놓고 표 4에 지정 된 대로 순환 조건 PCR 증폭 프로그램을 실행 합니다.
  6. 정량에 의해 반응을 모니터링 합니다. 정량 Pcr 반응 nuclease 무료 PCR 튜브, 순서 및 금액 표 5에 지정 된 구성 요소를 결합 하 여 설정 합니다. 정량 Pcr 기계과 지정 된 테이블 6으로 주기.
    1. 나머지 45 µ L 반응에 주기 추가 확대의 최적 수를 확인 하려면 x 축 및 y 축에 상대 형광 (RFU)에 주기 수와 음모를 만듭니다. 최적의 횟수 추가 확대의 3 분의 1 사이클 정량 반응 고원에 도달에 대 한 걸리는 수가입니다.
      참고: 정량 Pcr 반응 모니터링 PCR 주기 GC 콘텐츠 및 크기 편견을 최소화 하면서 최적의 라이브러리 조각 확대를 원하는 최적의 수의 결정에 대 한 수 있습니다.
  7. PCR 반응의 나머지 45 µ L의 최종 PCR 증폭을 완료 합니다. 다시는 thermocycler에에서 단계 3.5에서에서 증폭 반응 PCR 튜브를 놓고 표 7에 설명 된 대로 프로그램을 실행 합니다.
    참고: 이 프로토콜에서 설명 된 대로 처리 하는 샘플에 대 한 PCR 확대 주기의 최적의 총 수는 12 되도록 결정 되었다.
  8. 증폭 완료 되 면 라이브러리 제조업체의 프로토콜, 차입 버퍼의 25 µ L에서 방출 다음 PCR 정리 키트를 사용 하 여 정화.
    참고: 증폭된 라이브러리는 최대 48 h 4 ° C에서 저장 하거나 장기 저장을 위한-20 ° C에서 냉동 수 있습니다.

4. ATAC seq 도서관 품질 분석

참고: 그것은 품질과 수량 다음-세대 시퀀싱 하기 전에 시퀀스 (seq) ATAC 라이브러리의 유효성을 검사 하는 것이 중요입니다. 품질 및 수량 라이브러리의 상용 키트 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 평가 되어야 한다.

  1. 크기 조정, 정량화 및 DNA의 품질 관리에 대 한 마이크로-기반 플랫폼을 사용 하 여 ATAC seq 라이브러리의 양과 품질을 평가 합니다. 대표적인 품질 평가 결과 그림 2 를 참조 하십시오.
    참고: ATAC seq 라이브러리의 농도 여야 > 품질 시퀀싱 결과 얻기 위해 µ 1 ng/L. 평균, 30 nM 25 µ L에 취득 했다.

5. 시퀀싱 및 데이터 분석

참고: 이 분석 파이프라인 읽기 매핑 절차의 품질을 제어 하 고 실험 설계에 대 한 좌표를 조정 하 고, 다운스트림 분석에 대 한 봉우리를 호출 수 있습니다. 다음은 명령 선 및 실행의 설명입니다. 데이터 분석 패키지 (https://github.com/s18692001/bulk_ATAC_seq)에서 이용하실 수 있습니다.

  1. 샘플 당 42 백만 읽기의 평균 읽기 깊이를 다음 세대 시퀀서에 준비 된 라이브러리 순서.
  2. FastQC12 소프트웨어 패키지 명령을 사용 하 여 생성 된 파일을 선택 하 여 연속 읽기의 품질을 예상:
    fastqc-o < output_directory >< fastq_file >
  3. 트림 읽기의 기초 Trimmomatic13 소프트웨어에 의해 필요한 경우, 명령을 사용 하 여 FastQC 품질 검사에 의해 결정으로 (대 한 쌍-엔드):
    자바-병 < trimmomatic jar 파일 경로 > PE < input1 >< input2 >< 쌍된 output1 >< 홀된 output1 >< 쌍된 output2 >< 홀된 output2 > HEADCROP: < 자르기 기지 >
  4. Bowtie214 소프트웨어에 의해 인간의 참조 게놈 (hg38)에 정렬:
    bowtie2-x < 참조 게놈 >-< 입력된 쌍 1 >< 1 입력된 쌍 2 > < 출력 SAM 파일 > S
    참고: 인수-x 참조 게놈에 대 한 인덱스의 basename 이며 샘 형식 출력-S입니다.
  5. Samtools15 flagstat 패키지를 사용 하 여 매핑된 읽기의 품질 확인:
    samtools flagstat < BAM 파일 >
  6. 매핑된 읽기 파일을 정렬 하 고 중복 피16 도구를 사용 하 여 제거:
    자바-picard.jar SortSam 입력 항아리 < 입력된 SAM 파일 이름 > = 출력 = < 출력 정렬 BAM 파일 이름 > SORT_ORDER 좌표 = "및" java-picard.jar MarkDuplicates 입력 항아리 < 정렬 된 BAM 파일 > = 출력 < 중복 없이 출력 BAM 파일 > = REMOVE_DUPLICATES = TRUE
  7. 인덱스 BAM 파일을 사용 하지 않는 염색체 읽기 손질과 ATAC seq17의 실험적인 이유에 대 한 좌표를 이동:
    자바-picard.jar BuildBamIndex 입력 자 = < BAM 파일 >
    samtools idxstats < 입력 BAM 파일 > | -f 1을 잘라 | grep-v chrY | grep-v chrM | grep-v chrUn | xargs samtools 볼-b < 입력 BAM 파일 >>< 출력 트림 BAM 파일 >
    bedtools bamtobed-i < 입력 손질 BAM 파일 >>< 출력 트림 침대 파일 >
    awk ' 시작 {OFS = "\t"}; {만약 ($6 = = "+") 인쇄 $1, $2 + 4, 3 + 4 달러, $4, $5, $6, $1, $2-5, 3-5 달러, $4, $5, $6 다른 인쇄}' < 입력 손질 침대 파일 >< 트림 된 침대 파일 이동 >
  8. 삭제 부정적인 조정으로 이동 하는 읽기:
    awk '{if ($2 > 0) 인쇄 $1 "\t" $2 "\t" $3 "\t" $4 "\t" $5 "\t" 6 달러}' < 입력 침대 파일 >< 출력 음수가 아닌 조정 침대 파일 >.
  9. 다음 DiffBind18 분석용 BAM 파일 침대 파일 변환:
    bedtools bedtobam-< 입력 침대 파일 > i-g < 참조 게놈 >< 출력 BAM 파일 >
  10. 최대 호출 수행 DiffBind18 소프트웨어 패키지에 의해:
    macs2 callpeak-t < 입력 BAM 파일 >-f BAM-g hs-nomodel-nolambda-유지-dup 모든-전화-정상-outdir < 출력 디렉터리 경로 >-n < 출력 이름 >-B-q 0.01-bdg-shift-100-extsize 200
    참고: 필터링 후 샘플 당 37 백만 읽기의 중간값을 기대 합니다. 미토 콘 드리 아 DNA 오염에서 0.30%-5.39% (평균 1.96%) 범위 것입니다. 곱하기 매핑된 읽기 (평균 6.7%-56%, 19%)의 낮은 속도 그리고 핵 사용의 상대적으로 높은 비율 (60%-92%, 평균 79%)를 읽습니다.

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결과

신선한 전 혈의 15 mL에서이 프로토콜 1 백만 CD4 + T 세포의 평균을 생성합니다. 이들은 나중에 처리에 대 한 동결 하거나 즉시 사용 될 수 있습니다. 신선한 또는 해 동, CD4 + T 세포의 생존 능력은 일관 되 게 > 95%. CD4 + T 세포 고립의이 메서드는 소스 재료와 컬렉션 시간에 유연성에 대 한 수 있습니다. 이 향상 된 ATAC seq 프로토콜 시퀀싱 µ 1 ng/L 보다 큰 마지막 라이브러리를 생성합니다. 상업적으로 사용할 수 있는 시스템을 사용 하 여 수행 하는 품질 관리 200 및 1000 bp (그림 2) 사이의 DNA 파편을 입증 해야 합니다. 시퀀싱은 고품질 라이브러리만 수행 되어야 한다.

모든 라이브러리 샘플 당 읽기 40 백만 이상의 평균 깊이에 시퀀싱 했다. AT...

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토론

이 문서에 제공 된 수정된 ATAC seq 프로토콜 최소한의 미토 콘 드리 아 DNA 오염 재현 가능한 결과를 제공 합니다. 프로토콜이 되었습니다 사용 성공적으로 인간의 기본 PBMCs10, 인간 monocytes, (미 출판), 마우스 수지상 세포의 염색 질 건축 특징 및 교양된 흑색 종 세포 라인11. 우리는이 향상 된 세포 예상 상태 뿐만 아니라 다른 세포 유형 대 일 가능성이 있다. 그것 또한이 핵 격리 프로토콜 단일 핵 ATAC seq 프로토콜, 시퀀싱 결과 개선 하는 미토 콘 드리 아 DNA 오염 최소화와 호환 된다는 것을 예상 된다.

이 수정된 프로토콜의 추가 혜택을 환자 샘플의 여부에 따라 서로 다른 시간에 PBMCs에서 고립 된 CD4 + T 세포의 배치를 동결 능력입니다. ATAC seq 다음 모든 샘플에서 동시에 수행할 수 있습니다, transposase 반응 및 시퀀싱에 잠...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

우리는 기술 지원에 대 한 Atsede Siba를 감사합니다. C.S.C.는 NIH 그랜트 1R61DA047032에 의해 지원 됩니다.

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재료

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참고문헌

  1. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  2. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Current Protocols in Molecular Biology. 21, 1-29 (2015).
  3. Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2010).
  4. Pajoro, A., Muiño, J. M., Angenent, G. C., Kaufmann, K. Profiling Nucleosome Occupancy by MNase-seq: Experimental Protocol and Computational Analysis. Methods in Molecular Biology. 1675, 167-181 (2018).
  5. Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
  6. Rosenberg, A. B., et al. Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding. Science. 360 (6385), 176-182 (2018).
  7. Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
  8. Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes. Nucleic Acids Research. 45 (6), e41(2017).
  9. Lara-Astiaso, D., et al. Chromatin state dynamics during blood formation. Science. 345 (6199), 943-949 (2014).
  10. Gate, R. E., et al. Genetic determinants of co-accessible chromatin regions in activated T cells across humans. Nature Genetics. , (2018).
  11. Sanjana, N. E., et al. High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome. Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).
  12. Andrews, S. FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. Babraham Bioinformatics. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (2018).
  13. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  14. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  15. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  16. Broad Institute. Picard Tools. , Available from: http://broadinstitute.github.io/picard/ (2018).
  17. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  18. Stark, R., Brown, G. DiffBind: Differential Binding Analysis of ChIP-Seq Peak Data. , Available from: http://bioconductor.org/packages/devel/bioc/vignettes/DiffBind/inst/doc/DiffBind.pdf (2018).
  19. Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
  20. Wu, J., et al. The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos. Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).

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ATAC seqTn5
ATAC seq 분석 결과 주 인간의 CD4 + T 세포에서 낮은 미토 콘 드리 아 DNA 오염
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