절연 및 높은 소금의 입양 전송 처리 수지상 세포를 항 원 제시

요약

여기, 선물이 자기 세포 분류와 순진한 쥐로 후속 입양 전송 murine spleens에서 수지상 세포를 분리 하는 프로토콜. 높은 소금 활성화 수지상 세포의 모델 입양 전송 및 cytometry의 단계별 절차를 설명 하기 위해 선택 되었다.

초록

초과 규정식 소금 입구 염증에 기여 하 고 고혈압의 개발에 중요 한 역할을 한다. 우리는 이전 수지상 세포 항 원 선물 (DCs) 높은 extracellular 나트륨 NADPH 산화 효소의 활성화 및 isolevuglandin (IsoLG)의 형성을 느낄 수 있다 발견-단백질 adducts. 이러한 IsoLG 단백질 adducts 자기 단백질 반응 고 상태 처럼 자가 면역 질환 및 고혈압. 우리가 개발 하 고 고혈압에 DC 기능 연구-의 상태--예술 방법 최적화. 여기, 상세한 프로토콜을 제공 격리에서 높은 나트륨와 murine 비장 CD11c 입양 이전 체 외 치료 고혈압에 그들의 역할을 공부 하는 받는 사람 쥐로⁺ 세포.

서론

식이 과잉 소금은 고혈압에 대 한 주요 위험 요소. ^{1 , 그러나 2} 미국 심장 협회 권장 최대 2300 밀리 그램 (mg)의 하루 나트륨 (Na⁺) 섭취; 미국 인구의 10% 미만 관찰이 추천. ^{3 , 4} 나⁺ 입구에 있는 겸손 한 감소 혈압을 낮출 하 고 20%로 관상 동맥 심장 질환과 뇌졸중은 미국에서의 매년 새로운 사례를 감소. ⁵ 과잉 소금 소비와 주요 문제는 고혈압 인구의 50% 소금 감도, 전시 나⁺ 로드 또는 혈압에 비슷한 드롭 없음^{후 다음 혈압에서 10 mmHg 증가 정의 +} 제한 및 diuresis. ⁶ 소금 감도 또한 normotensive 개인의 25%에서 발생 하 고 심장 혈관 사건 및 죽음의 독립적인 예측 이다. ^{7 , 8} 소금 감지 메커니즘 신장과 관련 된 고혈압에 잘 공부 되었다; 그러나, 최근 연구는 면역 세포 나⁺을 느낄 수 있다 건의 한다. ^{9 , 10}

최근의 증거는 여분 신장 Na⁺ 에 변경 처리는 interstitium에 나⁺ 의 축적을 일으킬 수 있으며 염증 촉진 제안 합니다. ^{11 , 12} 우리의 실험실과 다른 사람으로 나타났습니다 모두 타고 난 및 적응형 면역 체계의 세포 고혈압의 악화에 기여. ^{9 , 13 , 14 , 15} 다양 한 성 자극, angiotensin II, 노르, 그리고 소금 원인 세포, monocytes 그리고 신장, 맥 관 구조에 침투 나⁺ 보존, vasoconstriction, 혈압을 추진 하 고 T 림프 톨을 포함 하 여 고도 고 끝-장기 손상입니다. ^{9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} 이전 연구에서 우리는 발견 Dc isolevuglandin (IsoLG) 축적-단백질 adducts angiotensin II 및 DOCA 소금 고혈압을 포함 한 다양 한 성 자극에 대 한 응답에서. ¹⁴ IsoLGs lysines 단백질에 게 신속 하 고 covalently adduct 지질 과산화의 반응성이 매우 높은 제품 이며 그들의 축적은 DC 활성화와 관련. 우리는 최근 높은 Na⁺ IsoLG 단백질에 대 한 강력한 자극은 설립 ¹⁴ adduct에 Dc에 Dc.⁹ 나⁺ 항목은 amiloride 민감한 전송기를 통해 중재 murine 형성. 나⁺ Na⁺/Ca^{2 +} 교환기를 통해 칼슘 (캘리포니아^{2 +})에 대 한 다음 교환 됩니다. 캘리포니아^{2 +} 활성화 단백질 키 니 아 제 C (PKC) 증가 초과 (₂O^·-)로 이어지는 NADPH 산화 효소를 활성화 하 고 IsoLG 단백질 adduct 형성. ⁹ 응답 angiotensin II의 하위 pressor 복용량으로 Dc 소수 고혈압 소금 노출의 입양 양도. ⁹

CD11c의⁺ Dc 조직에서 이전 immunohistochemistry RT-PCR, 제한 되었으며 Dc의 절연 cytometry 정렬 셀으로 제한 되었습니다. 교류 cytometry 셀 정렬 면역 세포의 고립에 대 한 강력한 방법 이지만, 값이 비싼, 시간이 걸리는, 이며 실행 가능한 세포의 낮은 수익률을 리드. 따라서, 우리 조직 소화, 생체 외에서 자극 및 CD11c의 입양 전송 단계 프로토콜 최적화⁺ 고혈압 연구 Dc.

프로토콜

밴 더 빌 트 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회는 여기에 설명 된 절차를 승인 했습니다. 마우스는 보관 및 관리 및 실험 동물 사용 (국가 아카데미 압박 가이드에 대 한 걱정. 수정된 2010)입니다.

1입니다. 마우스에서 Spleens의 격리

1. 1640 RPMI 준비: 10 %FBS, 0.10 mM HEPES, 1mm 나트륨 pyruvate, 50 µ M β-mercaptoethanol와 1% 페니실린/스.
2. 10-12 주를 안락사-오래 된 공동₂ 흡입에 의해 남성 마우스 C57bl/6. 가슴 및 마우스의 70% 에탄올 스프레이. 왼쪽된 측면에서 조심 스럽게 열고 피부 노출 비장 복 막 구멍.
3. 신중 하 게 마우스의 왼쪽에 창 고 간 이동 작은 집게를 사용 하 고 부드럽게 잘가 위를 사용 하 여 삭제할 비장.
   참고: 이 단계를 수행 해야 합니다 매우 신중 하 게 위장 손상 오염을 일으킬 수 있다.
4. 장소 각 레이블이 15 mL 원뿔 튜브 포함 된 RPMI 1640 매체의 3 mL에에서 비장 excised.

2. 세대 Spleens에서 단일 셀 정지의

참고: 비장은 기계적 분리 및 효소 소화를 결합 하 여 단일 세포 현 탁 액에 해리 했다 수 있습니다.

1. 콜라 (1 mg/mL; 0.29 U/mg 동결 건조 된) D를 추가 하 여 비장 소화 솔루션을 준비 하 고 DNase I (0.1 mg/mL)를 준비 RPMI 1640 매체 (단계 1.1 참조)
2. 집게를 사용 하 여 전송 비장의 소화 솔루션의 3 mL를 포함 하는 C 관 (분리 관)에 비장.
3. 제조업체의 지침에 따라 반자동된 균질 화기를 사용 하 여 기계적 분리를 수행 합니다.
   1. C 튜브 회전 팔에 밀접 하 게 배치 되도록 보장 하는 반자동된 균질 화기에 C 튜브를 놓습니다. C 관 배치 되 면 60 비장 04.01 프로토콜 실행 균질 하는 반자동된 화기에 시작 버튼을 누르면 s.
      참고: 기계적 분리 50 mL 원뿔 튜브 위에 40 μ m 필터를 배치 하 고 부드럽게 필터를 통해 비장을 연 삭 하 여 수행할 수 있습니다. 비장을 연 삭, 후 통해 RPMI 미디어의 10 mL와 함께 40 µ m 필터를 헹 굴.
4. 기계적 분리 후는 균질 화기에서 튜브를 분리 하 고 효소 소화를 수행 합니다. 연속 회전 (20 rpm)에서 37 ° C에서 15 분에 대 한 샘플을 품 어.
5. 40 µ m 스 트레이너를 통해 필터링 후 50 mL 원뿔 튜브에 pipetting 솔루션을 전송. Dulbecco의 PBS (dPBS) 10 mL와 40 µ m 여과기를 세척. 300 x g 4 ° c.에서 10 분 동안에 세포를 원심
6. 원심, 후는 상쾌한을 완전히 발음 하 고 dPBS의 10 ml에서 resuspending 하 여 펠 릿을 세척 합니다. 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g 에서 원심 분리기

3. 절연 CD11c의⁺ 비장 단일 세포 현 탁 액에서 Dc

1. 셀 펠 릿 dPBS의 5 ml에서 resuspend과 hemocytometer 고 trypan를 사용 하 여 셀 수를 계산 제외 블루.
2. 작은 셀 공의 centrifuging 300 x g, 4 ° c.에서 10 분에 의해
3. 완전히는 상쾌한 발음 하 고 자석으로 활성화 된 세포 분류 (Mac) 버퍼의 400 µ L에 펠 릿을 resuspend.
4. 1 x 10⁸ 셀 당 CD11c microbeads ( 재료의 표참조)의 100 µ L를 추가 합니다.
5. 소용돌이 셀 서 스 펜 션 및 4 ° c.에 냉장고에 10 분 동안 품 어
6. 세포를 씻어 맥 버퍼의 10 mL를 추가 합니다. 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g 에서 원심 분리기
7. 완전히는 상쾌한 발음 하 고 맥 버퍼의 500 µ L에서 resuspend.

4. 자력 분리 CD11c의⁺ Dc

참고: 자력 분리를 수동으로 수행 하 여 마그네틱 분리기 LS 열 복 ( 재료의 표참조). 자력 분리 또한 자동 자석 분리기 자동으로 수행할 수 있습니다. ( 재료의 표참조).

1. 맥 구분 하 고 각 열 흐름 통해 수집을 아래 15 mL 원뿔 튜브의 자기장에 LS 열을 배치 합니다.
2. LS 열 버퍼의 3 mL을 씻어.
3. 각 LS 열에 세포 현 탁 액 놓고는 흐름-통해 레이블이 셀을 포함 하는 수집 합니다.
4. 맥에서 버퍼를 통과 하는 레이블된 셀을 수집의 3 mL와 함께 LS 열 세척. 워시 LS 열 2 번 더.
5. 자석 분리기에서 LS 열을 제거 합니다. 각 열에 맥 버퍼의 5 mL을 추가 하 고 즉시 깨끗 한 15 mL 원뿔 튜브로 LS 열을 단단히 폭락 여 자석으로 레이블이 지정 된 셀에 밖으로 플러시.
   참고: 그것은 순도 세포 현 탁 액을 얻기 위해 CD11c 셀의 이중 절연을 수행 해야 합니다. 따라서, 단계 3.1 4.5 통해 반복 합니다. 고 순도 표준을 위한 그림 4 를 참조. 이 단계는 CD11c의 순도 향상⁺ 90-95% 세포.
6. CD11c 결정⁺ DC hemocytometer trypan 블루 제외를 사용 하 여에 번호. 0.4 %trypan 블루 솔루션에서 1:1 희석에 셀 샘플을 희석.
   참고: 비 실행 가능한 세포 물 들일 것 이다 파랑, 가능한 셀 흠 없는 유지 됩니다.
   1. 이렇게 하려면 신중 하 게는 hemocytometer 셀 샘플 희석의 10 µ L로를 1 분 동안 품 어.
   2. 셀 가능한 휴대폰 번호를 확인 하려면 로드 된 챔버에 1 x 1 m m² 의 4 제곱을 계산 합니다.

5. CD11c의 체 외가 염 치료에⁺ Dc

1. 10 %FBS, 0.1 mM HEPES, 1mm 나트륨 pyruvate, 50 µ M β-mercaptoethanol 및 1% 페니실린/스 500 mL 1640에 추가 하 여 DC 문화 매체를 준비 RPMI.
2. NaCl의 1.17 g으로 무게와 살 균 50 mL 송 골 매 관에 그것을 배치 하 여 10 배 DC 높은 소금 세포 배양 (400mm)를 준비 합니다. 솔루션에는 NaCl은 때까지 50 mL 팔 콘 튜브와 소용돌이를 살 균의 DC 세포 배양 (단계 5.1에서에서 준비) 50 mL를 추가 합니다.
3. 바로 셀 문화 후드에서 0.2 μ m 필터를 통해 진공 여과 사용 하 여 높은 소금 DC 문화 미디어 필터링.
4. 4ºC에서 10 분 동안 300 x g 에서 spleens에서 각 세포 현 탁 액 원심 1 x 10⁶ 셀/mL의 농도에서 DC 문화 미디어에서 각 셀 펠 릿을 resuspend.
5. 900 μ (약 1 x 10⁶ 셀) 24-잘 플랫 바닥 팔 콘 접시에에서 DC 서 스 펜 션의 플라스틱 각 잘 190 m m의 최종 나트륨 농도 높은 소금 DC 문화 미디어의 100 µ L를 추가 합니다. 접시를 분류 하 고 37 ° C에서 48 h에 대 한 공동₂ 인큐베이터 humified.

6. 입양 전송 높은 소금 처리 CD11c⁺ Dc

1. 48 h에 대 한 생체 외에서 자극 후 제거 37 ° C에서 접시 humified CO₂ 배양 기.
2. 플라스틱 셀 문화 미디어 및 resuspend는 CD11c 아래로⁺ Dc. 피펫은 모든 CD11c⁺ DC는 해당 정지 표시 1.6 mL 튜브. 도금도 각각에 대 한이 단계를 반복 합니다.
3. 각 CD11c 원심⁺ DC 300 x g 4 ° c.에서 10 분 동안 정지 상쾌한 발음 살 균 dPBS의 100 µ L로 DC 펠 릿 resuspend
4. 그리기 DC 1 mL 주사기 27 G ½ 인치 바늘으로 장착으로 현 탁 액.
5. 순진한 남성 10 주 된 C57bl/6 쥐 2% 아래 배치 isoflurane 안정적인 수술 비행기를 달성 하기 위해. 페달 반사의 부족으로 마 취의 수준을 확인 합니다. 일단 안정적인 수술 비행기를 달성 천천히 그리고 신중 하 게 바늘에 소개 약 30 °의 각도에서 복고풍 궤도 공간.
   참고: 27 G 니 들의 경사 눈 손상을 방지 하기 위해 눈에서, 가리키고 해야 합니다.
6. 천천히 그리고 부드럽게 주사는 CD11c⁺ DC 서 스 펜 션 (약 1 x 10⁶ 셀). 주입이 완료 되 면 조심 스럽게 눈을 손상 하지 의식 하 고 복고 궤도 공간 바늘 제거.
   참고: 후 주입, 거기 있어야 거의 없거나 전혀 없는 출혈. CD11c의 입양 전송⁺ Dc도 수행할 수 주입 (예: 꼬리 정 맥)의 I.V. 메서드를 사용 하 여. 컨트롤 마우스 받을 CD11c⁺ 일반 소금 미디어에서 경작 했다 Dc.
7. 코 콘에서 쥐를 제거 하 고 마 취에서 회복 하는 동안 약 30 분 동안 그들을 감시.

7. 14 일 낮은 복용량 Angiotensin II의 준비 (140 ng/kg/min)

1. 추가 하 여 5 M NaCl의 500 μ 그리고 아세트산의 300 μ angiotensin II 버퍼를 준비 합니다. 양자 Satis (QS) 이온된 H₂0의 최대 30 mL.
2. Angiotensin II 5 mg/mL angiotensin II 버퍼 재고 솔루션을 디졸브. 최종 농도 삼 투 minipump angiotensin II 각 마우스의 몸 무게에 따라 140 ng/kg/min의 속도 제공할 것입니다 달성 하기 위해 추가 버퍼 angiotensin II 재고 솔루션을 희석.
   참고: 필수 Angiotensin II (mg) = (마우스 무게 (g) x 0.2 mg/일 x 14 일) / 1000
   Angiotensin II (mg) 준비 (필수 angiotensin II x 260 µ L) = / 펌프 속도 (0.25 μ/hr)
   Angiotensin II 재고 볼륨 (μ) = 준비 angiotensin II 재고 농도 (5 mg/mL) x 1,000 /
   볼륨 (μ)를 희석 270-angiotensin II 재고량 =
3. Angiotensin II 재고 볼륨은 희석을 추가 (angiotensin II 버퍼) 단계 7.2에서에서 계산 하는 볼륨에 따라.
4. 살 균 세포 문화 후드 삼투성 minipump을 엽니다.
5. 희석된 angiotensin II 솔루션을 추가 하 고 주사기와 바늘에서 모든 공기를 추방. 삼 투 minipump에의 하단에 제공 된 바늘을 삽입 하 고 천천히 천천히, 그리고 신중 하 게 방광에서 바늘을 제거 하는 동안 angiotensin II 솔루션을 주입.
6. 삼 투 minipump 머리에 삽입 삼투성 방광 완벽 하 게, 안 공기를 얻기 위해 어떤 방광에 주목.

8. 14 일 낮은 복용량 Angiotensin II 삼 투 Minipumps의 주입

1. CD11c 입양 이전 후 10 일⁺ Dc, 마 취를 시작 하 고 다음 마우스를 지속적으로 달성 하 고 유지는 적절 한 수술 평면 2 %isoflurane 받을 코 콘 이동 isoflurane 챔버에 장소 마우스.
2. 수술 사이트를 준비 하는 목의 등 쪽 측에 따라서 모피를 제거 합니다. 수술의 시작 이전에 7.5 %betadine 뒤 70% 에탄올과 면도 영역을 청소.
3. 피부에 작은 절 개 (약 1.5 c m)를 만듭니다. 삼 투 minipump에의 배치를 위한 피하 주머니 만들려고 절 개에 hemostats를 삽입 합니다.
4. 피하 포켓에는 minipump를 삽입 합니다. 가까운 피부 2-3 외과 스테이플 상처와 상처에 7.5 %betadine 다른 응용 프로그램을 적용 하 고 감염을 방지 하기 위해 스테이플.
5. 마 취에서 그들의 감 금 소에 그들을 반환 하기 전에 복구 하는 동안 30-60 분에 대 한 마우스를 모니터링 합니다.
   참고: 마우스 필요 삼투성 minipump의 이식 후 3-4 일까지 모니터링.

9. 절연 Spleens 흐름 Cytometric 분석에 대 한 받는 사람 마우스의의

1. 14 일 낮은 복용량 angiotensin II 주입에의 격리 후 마우스 생체 외에서 높은 소금 수신에서 spleens 입양 송금으로 Dc 취급. (단계 1 및 2) 위에 나열 된 정확한 단계를 따릅니다.

10. 표면 얼룩

1. 폴리스 티 렌 FACS 튜브 및 4 ° c.에 8 분 350 x g 에서 원심 분리기로 1 x PBS에서 resuspended는 splenocytes 전송 원심 분리 후 상쾌한 발음. 맥 버퍼와 원심 분리 (350 x g, 8 분, 4 ° C)의 1 mL로 두 번 세척.
   1. 원하는 흐름 cytometric 패널의 수에 따라 다른 폴리스 티 렌 FACS 튜브에는 splenocytes를 동등 하 게 나눕니다.
2. 라이브/죽은 세포 생존 얼룩을 수행 하려면 1 x PBS와 원심 분리기 (350 x g, 8 분, 4 ° C) 셀 세척. 1 x PBS의 1 mL에 resuspend 및 세포 생존 능력의 1 µ L 추가 얼룩 (자료 표 참조). 4 ° C에서 15 분 동안 품 어 (냉장고 또는 얼음에) 빛 으로부터 보호 하기 위해 호 일에 커버.
3. 세포 생존 능력 얼룩의 부 화, 중 맥 버퍼의 적절 한 볼륨에 얼룩이 지는 세포 표면에 대 한 항 체의 칵테일을 준비 합니다.
4. 맥에서 버퍼, (350 x g, 8 분, 4 ° C), 원심 분리기의 1 mL로 세포 세척 하 고 항 체 칵테일의 100 µ L 각 셀 펠 릿 resuspend. 4 ° c.에 30 분 동안 빛에서 보호 품 어
   참고: 각 흐름 cytometry 항 체는 독특한, 그리고 그것은 매우 유용 하 고 권장 복용량 적정 곡선 각 특정 항 체에 대 한 수행 하 여 필요한 항 체의 최적 크기를 결정.
5. 맥에서 버퍼의 1 mL로 두 번 셀을 세척 하 고 흐름 cytometric 분석에 대 한 맥 버퍼의 적절 한 금액에는 splenocytes를 resuspend.

결과

그림 1 설명 단계 위의 회로도를 나타냅니다. 절연된 murine spleens CD11c 정렬 됩니다⁺ 마그네틱 셀 정렬 및 48 h. CD11c 일반 소금 미디어 (NS; 150 mmol NaCl) 또는 높은 소금 미디어 (HS; 190 mmol NaCl) 도금에 의해 Dc⁺ Dc 복고풍 궤도 adoptively 전송한 다음 순진한 받는 사람 쥐 하는 주입 10 일 후, 마우스는 14 일에 대 한 낮은 복용량 angiotensin II (140 ng/kg/min) 주입을 위한 삼 투 minipumps로 이식. Angiotensin II의 14 일간 주입, 동안 혈압 라디오 원격 또는 꼬리 팔목 plethysmography 기록 됩니다.

일반적인 혈압 분석 표시 됩니다 ...

토론

현재 프로토콜에서 우리 CD11c 분리 하는 절차를 최적화⁺ Dc spleens 마우스 및 adoptively에서 순진한 동물 소금 유발 고혈압에 Dc의 역할을 연구 하기에 그들을 전송. 이 프로토콜은 격리 하 고 adoptively 대 식 세포, T와 B 림프 톨을 포함 하 여 적응 면역 세포, monocytes, 등 다른 면역 세포 하위 집합을 전송 적용할 수 있습니다. 우리는 적절 한 세포 생존 및 DC 표면 식 마커의 안정성 비장 소화 프로세스를 최적화 했습니다. 또한, 우리는 최적의 DC 생존에 대 한 높은 나트륨 murine Dc의 생체 외에서 자극에 대 한 프로토콜을 최적화 했습니다.

이 프로토콜에서 중요 한 단계는 자기 세포 분류. 자기 세포 분류 질병에 면역 세포의 기능을 공부에 대 한 특정 murine 종류를 분리 하는 강력 하 고 편리한 도구입니다. 그러나, 그것 기반으로 기본 셀 표면 식 마커 CD11c를 포함 하 여 하나 이상의 면역 세...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
APC/Cy7 안티-마우스 CD11c	Biolegend	117324
autoMACS 러닝 버퍼	Miltenyi Biotec	130-091-221
CD11c MicroBeads 초순수	Miltenyi Biotec	130-108-338
Collagenase D	Roche	11088866001
DNase I	Roche	10104159001
DPBS 칼슘과 마그네슘 없음	Corning	21-031-CV
FcR 차단 시약	Miltenyi Biotec	130-092-575
FITC 안티 마우스 CD45	Biolegend	103108
GentleMACS C 튜브	Miltenyi Biotec	130-096-334
GentleMACS 해리기 장치	Miltenyi Biotec	130-093-235	사용 프로토콜 : Spleen 04.01
LIVE/DEAD fixable 바이올렛 사각 세포 염색 키트	Invitrogen	L34964
LS 컬럼	Miltenyi Biotec	130-042-401
QuadroMACs 분리기	Miltenyi Biotec	130-090-976
RPMI 1640 중간	깁코	11835-030