절연 및 높은 소금의 입양 전송 처리 수지상 세포를 항 원 제시

식이 과잉 소금은 고혈압에 대 한 주요 위험 요소. ^{1 , 그러나 2} 미국 심장 협회 권장 최대 2300 밀리 그램 (mg)의 하루 나트륨 (Na⁺) 섭취; 미국 인구의 10% 미만 관찰이 추천. ^{3 , 4} 나⁺ 입구에 있는 겸손 한 감소 혈압을 낮출 하 고 20%로 관상 동맥 심장 질환과 뇌졸중은 미국에서의 매년 새로운 사례를 감소. ⁵ 과잉 소금 소비와 주요 문제는 고혈압 인구의 50% 소금 감도, 전시 나⁺ 로드 또는 혈압에 비슷한 드롭 없음^{후 다음 혈압에서 10 mmHg 증가 정의 +} 제한 및 diuresis. ⁶ 소금 감도 또한 normotensive 개인의 25%에서 발생 하 고 심장 혈관 사건 및 죽음의 독립적인 예측 이다. ^{7 , 8} 소금 감지 메커니즘 신장과 관련 된 고혈압에 잘 공부 되었다; 그러나, 최근 연구는 면역 세포 나⁺을 느낄 수 있다 건의 한다. ^{9 , 10}

최근의 증거는 여분 신장 Na⁺ 에 변경 처리는 interstitium에 나⁺ 의 축적을 일으킬 수 있으며 염증 촉진 제안 합니다. ^{11 , 12} 우리의 실험실과 다른 사람으로 나타났습니다 모두 타고 난 및 적응형 면역 체계의 세포 고혈압의 악화에 기여. ^{9 , 13 , 14 , 15} 다양 한 성 자극, angiotensin II, 노르, 그리고 소금 원인 세포, monocytes 그리고 신장, 맥 관 구조에 침투 나⁺ 보존, vasoconstriction, 혈압을 추진 하 고 T 림프 톨을 포함 하 여 고도 고 끝-장기 손상입니다. ^{9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} 이전 연구에서 우리는 발견 Dc isolevuglandin (IsoLG) 축적-단백질 adducts angiotensin II 및 DOCA 소금 고혈압을 포함 한 다양 한 성 자극에 대 한 응답에서. ¹⁴ IsoLGs lysines 단백질에 게 신속 하 고 covalently adduct 지질 과산화의 반응성이 매우 높은 제품 이며 그들의 축적은 DC 활성화와 관련. 우리는 최근 높은 Na⁺ IsoLG 단백질에 대 한 강력한 자극은 설립 ¹⁴ adduct에 Dc에 Dc.⁹ 나⁺ 항목은 amiloride 민감한 전송기를 통해 중재 murine 형성. 나⁺ Na⁺/Ca^{2 +} 교환기를 통해 칼슘 (캘리포니아^{2 +})에 대 한 다음 교환 됩니다. 캘리포니아^{2 +} 활성화 단백질 키 니 아 제 C (PKC) 증가 초과 (₂O^·-)로 이어지는 NADPH 산화 효소를 활성화 하 고 IsoLG 단백질 adduct 형성. ⁹ 응답 angiotensin II의 하위 pressor 복용량으로 Dc 소수 고혈압 소금 노출의 입양 양도. ⁹

CD11c의⁺ Dc 조직에서 이전 immunohistochemistry RT-PCR, 제한 되었으며 Dc의 절연 cytometry 정렬 셀으로 제한 되었습니다. 교류 cytometry 셀 정렬 면역 세포의 고립에 대 한 강력한 방법 이지만, 값이 비싼, 시간이 걸리는, 이며 실행 가능한 세포의 낮은 수익률을 리드. 따라서, 우리 조직 소화, 생체 외에서 자극 및 CD11c의 입양 전송 단계 프로토콜 최적화⁺ 고혈압 연구 Dc.

밴 더 빌 트 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회는 여기에 설명 된 절차를 승인 했습니다. 마우스는 보관 및 관리 및 실험 동물 사용 (국가 아카데미 압박 가이드에 대 한 걱정. 수정된 2010)입니다.

1입니다. 마우스에서 Spleens의 격리

1. 1640 RPMI 준비: 10 %FBS, 0.10 mM HEPES, 1mm 나트륨 pyruvate, 50 µ M β-mercaptoethanol와 1% 페니실린/스.
2. 10-12 주를 안락사-오래 된 공동₂ 흡입에 의해 남성 마우스 C57bl/6. 가슴 및 마우스의 70% 에탄올 스프레이. 왼쪽된 측면에서 조심 스럽게 열고 피부 노출 비장 복 막 구멍.
3. 신중 하 게 마우스의 왼쪽에 창 고 간 이동 작은 집게를 사용 하 고 부드럽게 잘가 위를 사용 하 여 삭제할 비장.
   참고: 이 단계를 수행 해야 합니다 매우 신중 하 게 위장 손상 오염을 일으킬 수 있다.
4. 장소 각 레이블이 15 mL 원뿔 튜브 포함 된 RPMI 1640 매체의 3 mL에에서 비장 excised.

2. 세대 Spleens에서 단일 셀 정지의

참고: 비장은 기계적 분리 및 효소 소화를 결합 하 여 단일 세포 현 탁 액에 해리 했다 수 있습니다.

1. 콜라 (1 mg/mL; 0.29 U/mg 동결 건조 된) D를 추가 하 여 비장 소화 솔루션을 준비 하 고 DNase I (0.1 mg/mL)를 준비 RPMI 1640 매체 (단계 1.1 참조)
2. 집게를 사용 하 여 전송 비장의 소화 솔루션의 3 mL를 포함 하는 C 관 (분리 관)에 비장.
3. 제조업체의 지침에 따라 반자동된 균질 화기를 사용 하 여 기계적 분리를 수행 합니다.
   1. C 튜브 회전 팔에 밀접 하 게 배치 되도록 보장 하는 반자동된 균질 화기에 C 튜브를 놓습니다. C 관 배치 되 면 60 비장 04.01 프로토콜 실행 균질 하는 반자동된 화기에 시작 버튼을 누르면 s.
      참고: 기계적 분리 50 mL 원뿔 튜브 위에 40 μ m 필터를 배치 하 고 부드럽게 필터를 통해 비장을 연 삭 하 여 수행할 수 있습니다. 비장을 연 삭, 후 통해 RPMI 미디어의 10 mL와 함께 40 µ m 필터를 헹 굴.
4. 기계적 분리 후는 균질 화기에서 튜브를 분리 하 고 효소 소화를 수행 합니다. 연속 회전 (20 rpm)에서 37 ° C에서 15 분에 대 한 샘플을 품 어.
5. 40 µ m 스 트레이너를 통해 필터링 후 50 mL 원뿔 튜브에 pipetting 솔루션을 전송. Dulbecco의 PBS (dPBS) 10 mL와 40 µ m 여과기를 세척. 300 x g 4 ° c.에서 10 분 동안에 세포를 원심
6. 원심, 후는 상쾌한을 완전히 발음 하 고 dPBS의 10 ml에서 resuspending 하 여 펠 릿을 세척 합니다. 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g 에서 원심 분리기

3. 절연 CD11c의⁺ 비장 단일 세포 현 탁 액에서 Dc

1. 셀 펠 릿 dPBS의 5 ml에서 resuspend과 hemocytometer 고 trypan를 사용 하 여 셀 수를 계산 제외 블루.
2. 작은 셀 공의 centrifuging 300 x g, 4 ° c.에서 10 분에 의해
3. 완전히는 상쾌한 발음 하 고 자석으로 활성화 된 세포 분류 (Mac) 버퍼의 400 µ L에 펠 릿을 resuspend.
4. 1 x 10⁸ 셀 당 CD11c microbeads ( 재료의 표참조)의 100 µ L를 추가 합니다.
5. 소용돌이 셀 서 스 펜 션 및 4 ° c.에 냉장고에 10 분 동안 품 어
6. 세포를 씻어 맥 버퍼의 10 mL를 추가 합니다. 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g 에서 원심 분리기
7. 완전히는 상쾌한 발음 하 고 맥 버퍼의 500 µ L에서 resuspend.

4. 자력 분리 CD11c의⁺ Dc

참고: 자력 분리를 수동으로 수행 하 여 마그네틱 분리기 LS 열 복 ( 재료의 표참조). 자력 분리 또한 자동 자석 분리기 자동으로 수행할 수 있습니다. ( 재료의 표참조).

1. 맥 구분 하 고 각 열 흐름 통해 수집을 아래 15 mL 원뿔 튜브의 자기장에 LS 열을 배치 합니다.
2. LS 열 버퍼의 3 mL을 씻어.
3. 각 LS 열에 세포 현 탁 액 놓고는 흐름-통해 레이블이 셀을 포함 하는 수집 합니다.
4. 맥에서 버퍼를 통과 하는 레이블된 셀을 수집의 3 mL와 함께 LS 열 세척. 워시 LS 열 2 번 더.
5. 자석 분리기에서 LS 열을 제거 합니다. 각 열에 맥 버퍼의 5 mL을 추가 하 고 즉시 깨끗 한 15 mL 원뿔 튜브로 LS 열을 단단히 폭락 여 자석으로 레이블이 지정 된 셀에 밖으로 플러시.
   참고: 그것은 순도 세포 현 탁 액을 얻기 위해 CD11c 셀의 이중 절연을 수행 해야 합니다. 따라서, 단계 3.1 4.5 통해 반복 합니다. 고 순도 표준을 위한 그림 4 를 참조. 이 단계는 CD11c의 순도 향상⁺ 90-95% 세포.
6. CD11c 결정⁺ DC hemocytometer trypan 블루 제외를 사용 하 여에 번호. 0.4 %trypan 블루 솔루션에서 1:1 희석에 셀 샘플을 희석.
   참고: 비 실행 가능한 세포 물 들일 것 이다 파랑, 가능한 셀 흠 없는 유지 됩니다.
   1. 이렇게 하려면 신중 하 게는 hemocytometer 셀 샘플 희석의 10 µ L로를 1 분 동안 품 어.
   2. 셀 가능한 휴대폰 번호를 확인 하려면 로드 된 챔버에 1 x 1 m m² 의 4 제곱을 계산 합니다.

5. CD11c의 체 외가 염 치료에⁺ Dc

1. 10 %FBS, 0.1 mM HEPES, 1mm 나트륨 pyruvate, 50 µ M β-mercaptoethanol 및 1% 페니실린/스 500 mL 1640에 추가 하 여 DC 문화 매체를 준비 RPMI.
2. NaCl의 1.17 g으로 무게와 살 균 50 mL 송 골 매 관에 그것을 배치 하 여 10 배 DC 높은 소금 세포 배양 (400mm)를 준비 합니다. 솔루션에는 NaCl은 때까지 50 mL 팔 콘 튜브와 소용돌이를 살 균의 DC 세포 배양 (단계 5.1에서에서 준비) 50 mL를 추가 합니다.
3. 바로 셀 문화 후드에서 0.2 μ m 필터를 통해 진공 여과 사용 하 여 높은 소금 DC 문화 미디어 필터링.
4. 4ºC에서 10 분 동안 300 x g 에서 spleens에서 각 세포 현 탁 액 원심 1 x 10⁶ 셀/mL의 농도에서 DC 문화 미디어에서 각 셀 펠 릿을 resuspend.
5. 900 μ (약 1 x 10⁶ 셀) 24-잘 플랫 바닥 팔 콘 접시에에서 DC 서 스 펜 션의 플라스틱 각 잘 190 m m의 최종 나트륨 농도 높은 소금 DC 문화 미디어의 100 µ L를 추가 합니다. 접시를 분류 하 고 37 ° C에서 48 h에 대 한 공동₂ 인큐베이터 humified.

6. 입양 전송 높은 소금 처리 CD11c⁺ Dc

1. 48 h에 대 한 생체 외에서 자극 후 제거 37 ° C에서 접시 humified CO₂ 배양 기.
2. 플라스틱 셀 문화 미디어 및 resuspend는 CD11c 아래로⁺ Dc. 피펫은 모든 CD11c⁺ DC는 해당 정지 표시 1.6 mL 튜브. 도금도 각각에 대 한이 단계를 반복 합니다.
3. 각 CD11c 원심⁺ DC 300 x g 4 ° c.에서 10 분 동안 정지 상쾌한 발음 살 균 dPBS의 100 µ L로 DC 펠 릿 resuspend
4. 그리기 DC 1 mL 주사기 27 G ½ 인치 바늘으로 장착으로 현 탁 액.
5. 순진한 남성 10 주 된 C57bl/6 쥐 2% 아래 배치 isoflurane 안정적인 수술 비행기를 달성 하기 위해. 페달 반사의 부족으로 마 취의 수준을 확인 합니다. 일단 안정적인 수술 비행기를 달성 천천히 그리고 신중 하 게 바늘에 소개 약 30 °의 각도에서 복고풍 궤도 공간.
   참고: 27 G 니 들의 경사 눈 손상을 방지 하기 위해 눈에서, 가리키고 해야 합니다.
6. 천천히 그리고 부드럽게 주사는 CD11c⁺ DC 서 스 펜 션 (약 1 x 10⁶ 셀). 주입이 완료 되 면 조심 스럽게 눈을 손상 하지 의식 하 고 복고 궤도 공간 바늘 제거.
   참고: 후 주입, 거기 있어야 거의 없거나 전혀 없는 출혈. CD11c의 입양 전송⁺ Dc도 수행할 수 주입 (예: 꼬리 정 맥)의 I.V. 메서드를 사용 하 여. 컨트롤 마우스 받을 CD11c⁺ 일반 소금 미디어에서 경작 했다 Dc.
7. 코 콘에서 쥐를 제거 하 고 마 취에서 회복 하는 동안 약 30 분 동안 그들을 감시.

7. 14 일 낮은 복용량 Angiotensin II의 준비 (140 ng/kg/min)

1. 추가 하 여 5 M NaCl의 500 μ 그리고 아세트산의 300 μ angiotensin II 버퍼를 준비 합니다. 양자 Satis (QS) 이온된 H₂0의 최대 30 mL.
2. Angiotensin II 5 mg/mL angiotensin II 버퍼 재고 솔루션을 디졸브. 최종 농도 삼 투 minipump angiotensin II 각 마우스의 몸 무게에 따라 140 ng/kg/min의 속도 제공할 것입니다 달성 하기 위해 추가 버퍼 angiotensin II 재고 솔루션을 희석.
   참고: 필수 Angiotensin II (mg) = (마우스 무게 (g) x 0.2 mg/일 x 14 일) / 1000
   Angiotensin II (mg) 준비 (필수 angiotensin II x 260 µ L) = / 펌프 속도 (0.25 μ/hr)
   Angiotensin II 재고 볼륨 (μ) = 준비 angiotensin II 재고 농도 (5 mg/mL) x 1,000 /
   볼륨 (μ)를 희석 270-angiotensin II 재고량 =
3. Angiotensin II 재고 볼륨은 희석을 추가 (angiotensin II 버퍼) 단계 7.2에서에서 계산 하는 볼륨에 따라.
4. 살 균 세포 문화 후드 삼투성 minipump을 엽니다.
5. 희석된 angiotensin II 솔루션을 추가 하 고 주사기와 바늘에서 모든 공기를 추방. 삼 투 minipump에의 하단에 제공 된 바늘을 삽입 하 고 천천히 천천히, 그리고 신중 하 게 방광에서 바늘을 제거 하는 동안 angiotensin II 솔루션을 주입.
6. 삼 투 minipump 머리에 삽입 삼투성 방광 완벽 하 게, 안 공기를 얻기 위해 어떤 방광에 주목.

8. 14 일 낮은 복용량 Angiotensin II 삼 투 Minipumps의 주입

1. CD11c 입양 이전 후 10 일⁺ Dc, 마 취를 시작 하 고 다음 마우스를 지속적으로 달성 하 고 유지는 적절 한 수술 평면 2 %isoflurane 받을 코 콘 이동 isoflurane 챔버에 장소 마우스.
2. 수술 사이트를 준비 하는 목의 등 쪽 측에 따라서 모피를 제거 합니다. 수술의 시작 이전에 7.5 %betadine 뒤 70% 에탄올과 면도 영역을 청소.
3. 피부에 작은 절 개 (약 1.5 c m)를 만듭니다. 삼 투 minipump에의 배치를 위한 피하 주머니 만들려고 절 개에 hemostats를 삽입 합니다.
4. 피하 포켓에는 minipump를 삽입 합니다. 가까운 피부 2-3 외과 스테이플 상처와 상처에 7.5 %betadine 다른 응용 프로그램을 적용 하 고 감염을 방지 하기 위해 스테이플.
5. 마 취에서 그들의 감 금 소에 그들을 반환 하기 전에 복구 하는 동안 30-60 분에 대 한 마우스를 모니터링 합니다.
   참고: 마우스 필요 삼투성 minipump의 이식 후 3-4 일까지 모니터링.

9. 절연 Spleens 흐름 Cytometric 분석에 대 한 받는 사람 마우스의의

1. 14 일 낮은 복용량 angiotensin II 주입에의 격리 후 마우스 생체 외에서 높은 소금 수신에서 spleens 입양 송금으로 Dc 취급. (단계 1 및 2) 위에 나열 된 정확한 단계를 따릅니다.

10. 표면 얼룩

1. 폴리스 티 렌 FACS 튜브 및 4 ° c.에 8 분 350 x g 에서 원심 분리기로 1 x PBS에서 resuspended는 splenocytes 전송 원심 분리 후 상쾌한 발음. 맥 버퍼와 원심 분리 (350 x g, 8 분, 4 ° C)의 1 mL로 두 번 세척.
   1. 원하는 흐름 cytometric 패널의 수에 따라 다른 폴리스 티 렌 FACS 튜브에는 splenocytes를 동등 하 게 나눕니다.
2. 라이브/죽은 세포 생존 얼룩을 수행 하려면 1 x PBS와 원심 분리기 (350 x g, 8 분, 4 ° C) 셀 세척. 1 x PBS의 1 mL에 resuspend 및 세포 생존 능력의 1 µ L 추가 얼룩 (자료 표 참조). 4 ° C에서 15 분 동안 품 어 (냉장고 또는 얼음에) 빛 으로부터 보호 하기 위해 호 일에 커버.
3. 세포 생존 능력 얼룩의 부 화, 중 맥 버퍼의 적절 한 볼륨에 얼룩이 지는 세포 표면에 대 한 항 체의 칵테일을 준비 합니다.
4. 맥에서 버퍼, (350 x g, 8 분, 4 ° C), 원심 분리기의 1 mL로 세포 세척 하 고 항 체 칵테일의 100 µ L 각 셀 펠 릿 resuspend. 4 ° c.에 30 분 동안 빛에서 보호 품 어
   참고: 각 흐름 cytometry 항 체는 독특한, 그리고 그것은 매우 유용 하 고 권장 복용량 적정 곡선 각 특정 항 체에 대 한 수행 하 여 필요한 항 체의 최적 크기를 결정.
5. 맥에서 버퍼의 1 mL로 두 번 셀을 세척 하 고 흐름 cytometric 분석에 대 한 맥 버퍼의 적절 한 금액에는 splenocytes를 resuspend.

그림 1 설명 단계 위의 회로도를 나타냅니다. 절연된 murine spleens CD11c 정렬 됩니다+ 마그네틱 셀 정렬 및 48 h. CD11c 일반 소금 미디어 (NS; 150 mmol NaCl) 또는 높은 소금 미디어 (HS; 190 mmol NaCl) 도금에 의해 Dc+ Dc 복고풍 궤도 adoptively 전송한 다음 순진한 받는 사람 쥐 하는 주입 10 일 후, 마우스는 14 일에 대 한 낮은 복용량 angiotensin II (140 ng/kg/min) 주입을 위한 삼 투 minipumps로 이식. Angiotensin II의 14 일간 주입, 동안 혈압 라디오 원격 또는 꼬리 팔목 plethysmography 기록 됩니다.

일반적인 혈압 분석 표시 됩니다 그림 2 (바르 바로 외.9에서 수정) DCs의 낮은 복용량 angiotensin II 주입에 대 한 삼 투 minipumps 입양 전송 다음 이식 하는. 메모, angiotensin II의이 낮은 복용량의 (140 ng/kg/min)은 일반 마우스에 혈압을 증가 하지 않는 하위 pressor 복용량. 일반 소금 치료 CD11c 받는 마우스+ Dc (검은 원) 유지 정상적인 혈압 angiotensin II 주입 동안 높은 수신 쥐 소금 치료 CD11c 동안+ 심장 수축 혈액 압력에 있는 증가는 DCs (빨간색 원) 전시. 그림 2 에서는 높은 소금 CD11c 치료+ Dc 주요 고혈압 angiotensin II의 하위 pressor 복용량에 대 한 응답에서.

격리 CD11c의 순도 확인 하려면+ 세포, 우리 그림 3A제어 전략을 사용 하 여 흐름 cytometry 분석 수행. 우리는 발견 우리 CD11c의 증가 풍부 달성 총 splenocytes에 비해,+ (그림 3B) 세포. 그림4에서는 제조 업체의 프로토콜 문제를 해결 하려면 다른 CD11c microbead 농도 활용 하 고. 100 μ(그림 4)를사용 하 여 splenocytes의 자력 분리, 다음 200 μ (그림 4B), 또는 CD11c microbeads의 300 μ (그림 4C

저자는 공개 없다.