여기 우리는 다양 한 유형의 전기 자극 및 osteogenic 차별화를 향상 시키기 위해 중간 엽 줄기 세포를 치료에 사용 하는 셀을 표시 하도록 셀 문화 챔버의 건설에 대 한 프로토콜을 제시.
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방법 논문
건설 및 생체 외에서 중간 엽 줄기/Stromal 세포 Osteogenic 차별화를 강화 하기 위한 전기 자극 챔버의 사용
이 논문에서
요약
초록
중간 엽 줄기/stromal 세포 (MSCs) 뼈 조직 공학 접근에에서 치유를 촉진 하 광범위 하 게 사용 되었습니다. 전기 자극 (EStim) MSC osteogenic 차별화 생체 외에서 증가 하 여 뼈 임상 설정에서 치유를 촉진 입증 되었습니다. 여기 우리가 EStim 셀 문화 챔버의 건설을 설명 하 고 치료에 사용 쥐 뼈 골 수 유래 MSC osteogenic 차별화를 강화 하. 우리는 osteogenic 분화에 상당한 증가 결과 MSCs EStim와 7 일 동안 치료 하 고이 프로 osteogenic 효과 (7 일) EStim 단종 후에 오랫동안 지속 되는 중요 한 것은, 발견. 이 이렇게 pretreating EStim osteogenic 차별화를 강화 하기 위하여와 MSCs의 뼈 조직 공학 치료 결과 최적화 하 고, 따라서, 그들의 전체 치료 잠재력을 달성 하는 데 도움이 사용 될 수 있습니다. 이 응용 프로그램 뿐 아니라이 EStim 셀 문화 실과 프로토콜 또한 사용할 수 있습니다 다른 EStim 민감한 셀 동작, 마이그레이션, 확산, apoptosis, 비 계 첨부 파일 등을 조사 하.
서론
외상 또는 질병 유발 뼈 결함 증가 세포 치료 및 재생 의학 기술의 다양 한 조합을 사용 하 여 치료를 받고 있다. MSCs 이러한 치료 그들의 상대적으로 높은 osteogenic 활동, 격리 및 확장, 효율과 안전1때문에 선택의 셀입니다. Osteogenic 그들의 활동을 극대화 하 고, 따라서 그들의 치료 효과 최적화, 여러 가지 방법은 조작 하 MSCs 이러한 치료에 그들의 사용에 앞서 (Mauney 외.2검토) 도입 되었습니다. 하나 이러한 방법은 EStim 시험관3 MSC osteogenic 차별화를 강화 하 고 뼈 vivo에서4치유 촉진을 보여줘 왔다. MSCs EStim와 치료에 집중 하는 연구의 증가도 불구 하 고 EStim의 프로 osteogenic 효과 극대화 하기 위한 최적의 처방 아직 정의할 수 있다.
EStim를 사용 하 여 다른 생체 외 방법 금속 전극5에서 세포를 분리 배양에 빠져들 소금 다리를 이용 한다. 이것의 장점은 EStim 소금 다리를 통해 제공 세포 독성 수 있습니다 화학 부산물 (예를 ....
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프로토콜
1. 전기 자극 세포 문화 챔버의 건설
- 표준 6-잘 세포 배양 배지;의 두 뚜껑 수집 EStim 챔버를 빌드하려면 99.99% 백 금 철사, 직경 0.5-1의 길이 60 cm m m; 코팅 구리 와이어, 0.6 m m;의 직경을 가진 길이에서 70 cm 건설 클램프; 납땜 장비; 초전도 접착제;의 한 관 1 와이어 터미널 블록 커넥터, 6 개의 작은 2.2 V Led (옵션); 스테인레스 실리콘 접착제 (선택 사항); 코팅의 1 개의 관 검은 절연 테이프;의 한 롤 표준, 유연한, 절연 구리 전선 (0.14 m m2), 2 m 길이 (자료의 테이블).
- 6 잘 플레이트 뚜껑, 마크와 다음 드릴 두 구멍 (~ 1 m m의 직경), 25 m m 6의 각각의 외부 가장자리 근처에 떨어져 우물 (총에서 12 구멍), 1A, B 그림에서 같이.
- 클램프와 백 금 철사의 12 5 cm 길이 잘라. L-모양, 한쪽 길이 3 m를 떠나으로 수동으로 전선의 각 구 부하 고는 다른 2 cm. 두 35 cm 길이에 실버 코팅 와이어를 잘라.
- 1 개의 백 금 철사의 더 긴 (3 cm) 구부러진 끝 (에서 밖으로 내부) 각 드릴된 구멍에 1-2 m m, 뚜껑의 외부에서....
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결과
100 mV/mm EStim의 MSCs, 셀 EStim 3에 대 한 치료의 osteogenic 차별화에의 효과 평가 하기 위해 7 그리고 14 일 또는 nontreated (제어) 형태학 상 변화 고 칼슘 증 착 (그림 2를 평가 하 여 경작의 14 날에 분석 되었다 ). 밝은 분야 현미경 검사 법 (형태 변화)를 사용 하 여 셀 이미징 하거나 4 %paraformaldehyde 솔루션에서 세포를 고정, 0.02% 알리자린 레드 솔루션 얼룩을 다음 이미징 그들은 이렇게 밝은 분야 현미경 검사 법 (칼슘 증 착을 사용 하 여 분석)입니다.
Osteogenic 마커 유전자 표현의 변화에 대 한 자세한 분석은 3, 7, 및 자란 (그림 3)의 14 일에 수행 되었.......
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토론
여기 우리는 챔버와 향상 된 osteogenic 차별화 결과 EStim와 중간 엽 줄기 세포를 치료 하는 방법의 건설을 설명 합니다.
제시 EStim 설치 특수 장비/지식이 필요로 하지 않습니다 하 고 주니어 연구자에 의해 표준 줄기 세포 생물학/생화학 실험실에서 수행할 수 있습니다. 그러나, 건물 EStim 챔버를 사용 하는 경우에, 몇 가지 중요 한 단계에서 특별 한 배려를가지고 한다. 백 금 전극 처리,이 금속은 매우 유 순 하 고 섬세 한 여분 배려를가지고 한다. 다른 금속, 강철 또는 텅스텐, 사용할 수 있지만 이러한 세포 독성13수 있는 부식에 수 그리 다는 권장 하지 않습니다. 또한, 전극과 뚜껑 청소/살 균으로 때문에이 메서드를 반복적으로 테스트 하 고 문제 오염 제거에 효과가 있어야 발견 프로토콜에 설명 된 대로 정확 하 게 수행 되어야 합니다. 마지막으로,이 챔버 다른 공부 하는 데 사용 될 수 EStim 민감한 세포 .......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 작품은 AO 기초 시작 그랜트 (S-14-03 H) 및 프랑크푸르트, 독일에에서 본사를 둔 Friedrichsheim 재단 (재단 Friedrichsheim) 부분에서 지원 되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Estim fabrication | |||
| Banana connector/Jack adaptor | Poppstars | 1008554 | 2개 |
| 절단 펜치 | Knipex | 78 03 125 | |
| DC 전원 공급 장치(0-30V/0-3A) | B& K Precision | 모델 9130B | 모든 유사 모델을 사용할 수 있습니다 |
| . 절연 유연한 전선 (0.14 mm2) | Conrad Electronic International | 604794, 604093 | 2개 |
| 비부식성 실리콘 고무 | Dow Corning | 3140 RTV | *많은 상점에서 구입할 수 있습니다 |
| 플래티넘 와이어 (999,5/1000; 1mm ø) | Junker Edelmetalle | 00D-3010 | 0.6 m 1 Estim 챔버 |
| 70 % 에탄올 용액 | 모든 | Estim 챔버 | |
| 은도금 구리선 (0.6 mm &lslash;) | 콘래드 일렉트로닉 인터내셔널 | 409334 - 62 | ≈ 1 Estim 장치에 70cm 필요 |
| 납땜 인두 세트 | Conrad Electronic International | 1611410 - 62 | 모든 simular 모델을 사용할 수 있습니다 |
| TPP 6웰 플레이트 뚜껑 | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | Estim 챔버용 뚜껑 |
| 2.2V 유선 원형 LED | Conrad Electronic International | 599525 - 62 | 6개 |
| UHU Super glue | UHU GmbH & Co. KG | 해당 없음 | *많은 상점에서 구입할 수 있습니다 |
| MSC culture | |||
| β-Glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G9422 | 골생성 세포 배양 |
| DMEM, 저포도당, GlutaMAX 보충제, pyruvate | Thermo-Fischer Scientific | 21885025 | 배양 |
| DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음 | Thermo-Fischer 과학적 | 14190144 | 세포 배양 |
| 덱사메타손 | Sigma-Aldrich | D4902 | 골형성 세포 배양 |
| 소 태아 혈청 | Thermo-Fischer 과학적 | 10500064 | 배양 |
| 50ml Falcon tube | Sarstedt | 62,547,004 | 세포 배양 |
| L-아스코르브산 | Sigma-Aldrich | A4544 | 골형성 세포 배양 |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Thermo-Fischer Scientific | 15140122 | 배양 |
| Sprague-Dawley(SD) 쥐 중간엽 줄기세포, 골수 유래 | Cyagen | RASMX-01001 | |
| 세포 박리 용액 | Thermo-Fischer Scientific | A1110501 | 배양, 세포 박리 |
| TC 플라스크, T75 | Sarstedt | 833911302 | 세포 배양 |
| TPP 6웰 플레이트 | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | 세포 배양 |
| Trypan Blue Dye, 0.4% 용액 | Bio-Rad | 1450021 | 세포 수 |
참고문헌
- Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence? Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).
- Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L.
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재인쇄 및 허가
