건설 및 생체 외에서 중간 엽 줄기/Stromal 세포 Osteogenic 차별화를 강화 하기 위한 전기 자극 챔버의 사용

요약

여기 우리는 다양 한 유형의 전기 자극 및 osteogenic 차별화를 향상 시키기 위해 중간 엽 줄기 세포를 치료에 사용 하는 셀을 표시 하도록 셀 문화 챔버의 건설에 대 한 프로토콜을 제시.

초록

중간 엽 줄기/stromal 세포 (MSCs) 뼈 조직 공학 접근에에서 치유를 촉진 하 광범위 하 게 사용 되었습니다. 전기 자극 (EStim) MSC osteogenic 차별화 생체 외에서 증가 하 여 뼈 임상 설정에서 치유를 촉진 입증 되었습니다. 여기 우리가 EStim 셀 문화 챔버의 건설을 설명 하 고 치료에 사용 쥐 뼈 골 수 유래 MSC osteogenic 차별화를 강화 하. 우리는 osteogenic 분화에 상당한 증가 결과 MSCs EStim와 7 일 동안 치료 하 고이 프로 osteogenic 효과 (7 일) EStim 단종 후에 오랫동안 지속 되는 중요 한 것은, 발견. 이 이렇게 pretreating EStim osteogenic 차별화를 강화 하기 위하여와 MSCs의 뼈 조직 공학 치료 결과 최적화 하 고, 따라서, 그들의 전체 치료 잠재력을 달성 하는 데 도움이 사용 될 수 있습니다. 이 응용 프로그램 뿐 아니라이 EStim 셀 문화 실과 프로토콜 또한 사용할 수 있습니다 다른 EStim 민감한 셀 동작, 마이그레이션, 확산, apoptosis, 비 계 첨부 파일 등을 조사 하.

서론

외상 또는 질병 유발 뼈 결함 증가 세포 치료 및 재생 의학 기술의 다양 한 조합을 사용 하 여 치료를 받고 있다. MSCs 이러한 치료 그들의 상대적으로 높은 osteogenic 활동, 격리 및 확장, 효율과 안전¹때문에 선택의 셀입니다. Osteogenic 그들의 활동을 극대화 하 고, 따라서 그들의 치료 효과 최적화, 여러 가지 방법은 조작 하 MSCs 이러한 치료에 그들의 사용에 앞서 (Mauney 외.²검토) 도입 되었습니다. 하나 이러한 방법은 EStim 시험관³ MSC osteogenic 차별화를 강화 하 고 뼈 vivo에서⁴치유 촉진을 보여줘 왔다. MSCs EStim와 치료에 집중 하는 연구의 증가도 불구 하 고 EStim의 프로 osteogenic 효과 극대화 하기 위한 최적의 처방 아직 정의할 수 있다.

EStim를 사용 하 여 다른 생체 외 방법 금속 전극⁵에서 세포를 분리 배양에 빠져들 소금 다리를 이용 한다. 이것의 장점은 EStim 소금 다리를 통해 제공 세포 독성 수 있습니다 화학 부산물 (예를 들면, 금속 전극의 부식)의 도입을 없앤다. 이 장점에도 불구 하 고 소금 교량 작업할 복잡 고 제공 EStim 어려운 두 시스템을 사용할 때 얻은 결과 연결 하 고 그 전달된에 vivo에서 모델에서 다릅니다. 셀 문화 우물 안에 고정 하는 금속 또는 탄소 전극을 통해 EStim 제공 하는 설정 (Hronik-Tupaj와 카 플 란⁶검토)으로 더 나은 시뮬레이션 한다 vivo;에 사용 되는 장치 그러나,이 소자 들은 어려운 사용 하는 사이 청소/소독 하 고 실험 당 공부 될 수 있다 셀 수는 제한 됩니다. 우리는 여기에 이러한 다른 설정의 한계를 해결 하기 위해 구체적으로 제시 EStim 챔버 설계. 반면이 EStim 챔버를 사용 하 여 우리의 경험의 대부분은 2d 되었습니다 이며 골 수 및 지방-조직-파생 MSCs^3,4포함 된 3D 문화,이 챔버의 주요 장점은 그것 다목적 이며, 상대적으로 사소한 변경, 다양 한 다른 조건에서 다른 세포 유형 공부를 적용할 수 있습니다.

여기 우리가 EStim 셀 문화 챔버;의 건설을 설명 다음, 우리 EStim osteogenic 차별화에 효과 측정의 다른 식이요법으로 치료 MSCs에서 그것의 사용을 보여 줍니다. MSC osteogenic 차별화 칼슘 증 착, 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활동, 및 osteogenic 마커 유전자 발현을 통해 평가 됩니다. 중요 한 것은,에이 설치를 사용 하는 실험 과거 관찰 이러한 프로 osteogenic 효과 EStim 치료 중단 후에 오랫동안 지속 합니다.

프로토콜

1. 전기 자극 세포 문화 챔버의 건설

1. 표준 6-잘 세포 배양 배지;의 두 뚜껑 수집 EStim 챔버를 빌드하려면 99.99% 백 금 철사, 직경 0.5-1의 길이 60 cm m m; 코팅 구리 와이어, 0.6 m m;의 직경을 가진 길이에서 70 cm 건설 클램프; 납땜 장비; 초전도 접착제;의 한 관 1 와이어 터미널 블록 커넥터, 6 개의 작은 2.2 V Led (옵션); 스테인레스 실리콘 접착제 (선택 사항); 코팅의 1 개의 관 검은 절연 테이프;의 한 롤 표준, 유연한, 절연 구리 전선 (0.14 m m²), 2 m 길이 (자료의 테이블).
2. 6 잘 플레이트 뚜껑, 마크와 다음 드릴 두 구멍 (~ 1 m m의 직경), 25 m m 6의 각각의 외부 가장자리 근처에 떨어져 우물 (총에서 12 구멍), 1A, B 그림에서 같이.
3. 클램프와 백 금 철사의 12 5 cm 길이 잘라. L-모양, 한쪽 길이 3 m를 떠나으로 수동으로 전선의 각 구 부하 고는 다른 2 cm. 두 35 cm 길이에 실버 코팅 와이어를 잘라.
4. 1 개의 백 금 철사의 더 긴 (3 cm) 구부러진 끝 (에서 밖으로 내부) 각 드릴된 구멍에 1-2 m m, 뚜껑의 외부에서 튀어나와 떠나 구 부 집게를 사용 하 여. 초전도 접착제 뚜껑 구멍에 백 금 철사를 장악 하 고 약 6 h 동안 건조를 두고.
5. (그는 나중에 음극 역할 참조 하십시오 그림 1A) 모든 6 개의 백 금 철사의 팁 솔더 실버 코팅 와이어 중 뚜껑에서 튀어나와. 다른 실버 코팅 와이어를 (그는 나중에 역할을 양극) 나머지 6 개의 백 금 철사를 납땜 하는 동일한 절차를 반복 합니다.
   1. (선택 사항) 실험 동안 기능을 확인 하려면 6 양극-음극 백 금 전극 쌍 사이 회로에 Led를 추가 합니다. 각 LED 빛 (그림 1C) 문화 접시에 있는 세포를 노출 방지 하기 위해 주도 아래 검은 절연 테이프의 조각을 넣으십시오.
6. 와이어 터미널 블록 커넥터 6 잘 플레이트 뚜껑의 왼쪽된 위 모퉁이를 접착제와 두 실버 코팅 와이어 그림 1C에서 같이 입력된 단자에 연결 하십시오.
7. (그림 1B, 뚜껑 Nr. 2) 첫 번째 뚜껑에 터미널 블록 커넥터에 맞게 두 번째 6 잘 플레이트 뚜껑의 왼쪽된 위 모퉁이에서 20 m m x 20 m m 섹션을 잘라. 전극, 두 번째 뚜껑을 갖춘 첫 번째 뚜껑을 커버 하 고 접착 테이프와 함께 테이프.
   1. 를 개선 하기 위해 두 개의 뚜껑의 접합 실리콘 접착제 코팅 (선택 사항)을 사용 합니다. 이렇게 하려면 실리콘 접착제의 3-5 m m 층은 전극으로 뚜껑을 커버 하 고 다른 뚜껑, 12 h 건조 접착제에 대 한 수 있도록 그것을 커버.
8. 와이어 커넥터와 바나나 남성 커넥터 (4 mm)을 다른 끝의 출력 단자를 2 개의 표준 절연된 구리 철사의 한쪽 끝을 연결 합니다.
   참고:이 전선의 길이 어디 셀 지켜질 것 이다, 인큐베이터 (그림 1D) 외부 전원 공급 장치에는 인큐베이터에 선반에서 거리에 따라 달라 집니다.
9. (전압) 복용량을 조정 하 고 처방 EStim의 DC 전원 공급 장치를 조절 하 여 세포에 전달.
   1. 전면 패널에 ON/OFF 버튼을 눌러 전원 공급 장치를 켭니다. 버튼 1을 누르면 채널 1을 활성화 합니다.
   2. 버튼 Nr. 4 (V-집합) 전압 설정을 누릅니다. 프레스 버튼 2, . 2.5 V. 프레스 Enter에 부하 출력 설정 5 .
   3. 2.5 V의 출력 로드 되도록 (2500 mV) 다음, 단순화 된 방정식에 따라 100 mV/mm의 EStim에 해당.
      V _EStim = ; 또는
      V = V_EStim × d
      여기, V = 밀리; 출력 전원 공급 전압 d = 밀리미터; 전극 사이의 거리 V _EStim 밀리미터 당 밀리에 자극 전압 =.
      참고:이 단순화 일정 DC 전압의 경우에 적용 됩니다. 매체와 세포 사이의 저항 전극 셀;와 직접 접촉에서 하지 않습니다 무시할 수는 대신, EStim 매체를 통해 세포에 전달 된다.

2. 중간 엽 줄기 세포 문화 osteogenic 매체에

1. 구입 하 고 실험의 날까지 액체 질소에 상용 쥐 MSCs ( 재료의 표참조)를 저장 합니다. 또는 프로토콜에 따라 다른 동물에서 MSCs 분리 실험 동물의 사용에 대 한 지역 기관 규정^7,8 다른 곳에서 출판.
2. 실험 당일, 액체 질소 저장에서 MSCs의 한 유리병 (1 x 10⁶ 세포)를 제거 하 고 신속 하 게 (1 분) 이내 37 ° c.에 preheated 물 욕조에 세포를 해 동
   1. 층 류 흐름 후드에서 무 균 조건 하에서 50 mL 팔 콘 튜브로 유리병 콘텐츠를 플라스틱 고 정상 매체 (NM) 37 ° c, Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM; 1 x)으로 구성 된 prewarmed의 9 mL 10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 추가 페니실린/스 솔루션입니다. 300 x g에서 원심 분리 하 여 5 분에 대 한 셀을 펠 렛.
   2. 층 류 두건에는 상쾌한을 제거 하 고 신중 하 게 37 ° c.에 prewarmed NM의 12 mL에서 셀 펠 릿 resuspend Resuspended 셀 T-75 세포 배양 플라스 크를 전송 합니다.
3. (약 3-5 일 후)는 80%-90%의 합류를 도달할 때까지 37 ° C, 5% CO₂, 5% O₂ 에 셀 문화.
4. 셀 통로
   참고: 층 류 두건에 원심 분리 및 무 균 조건 하에서 부 화를 제외 하 고 모든 작업을 수행 합니다.
   1. 도달 후 80%-90% 합류, 세포 분리 솔루션으로 셀을 검색 합니다. 세포 배양 매체 발음, 세척 2 x 1 x 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 세포 분리 솔루션, x 1의 5 mL을 추가 하 고 5 분 동안 인큐베이터에 셀을 반환.
   2. 일단 셀 분리는 분리 솔루션 비활성화 문화 매체의 동일한 금액을 추가 합니다. 50 mL 팔 콘 튜브에 세포를 수집 하 고 5 분 동안 300 x g 에서 그들을 회전.
   3. 매체를 삭제 하 고 셀 신선한 일반 매체의 1 mL에 resuspend. Trypan 푸른 얼룩 가능한 셀의 개수를 평가 합니다.
   4. 씨앗 1 x 10⁶ 셀 prewarmed NM의 12 mL와 함께 새로운 T-75 플라스 크에. 80%-90%의 합류를 도달할 때까지 37 ° C, 5% CO₂, 5% O₂ 에 셀 문화.
      참고: 셀 뿌리고 (단계 2.4.1–2.4.4) 반복할 수 있습니다 몇 번 셀의 필요한 수를 얻을 때까지. 통로 8 보다 오래 된 세포를 사용 하지 마십시오.
5. 씨앗 9 x 10 NM (10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청, 1% 페니실린/스, DMEM) 문화 6 잘 플레이트의 각 잘에서 3 mL에⁴ 셀. 37 ° C, 5% CO₂, 5% O₂에 1 일에 대 한 셀을 품 어.
6. 다음 날, 문화 매체를 발음 하 고 osteogenic 차별화 매체 (OM, 일반 매체와 10^-7 M dexamethasone, 10 m m β-glycerophosphate, 0.05 m m ascorbic 산-2-인산 보충)의 3 mL을 적용 합니다.
7. 6 잘 플레이트 세포와 인큐베이터에 배치 하 고 37 ° C, 5% CO₂, 5% O₂ 에서 밤새 품 어.

3. 치료 EStim와 MSCs

1. 셀 EStim 처리 됩니다 하루에 30 분;에 대 한 70% 에탄올 용액에서 전극 소독 그런 다음, 추가 30 분에 대 한 캐비닛 안전에 자외선에서 그들을 건조.
2. 층 류 흐름 후드에서 커버 뚜껑 장착 전극, 전극 완전히 중간에 빠져들 다는 것을 확인 된 교양된 MSCs를 포함 6 잘 플레이트 (필요한 경우, 추가 매체). 인큐베이터에 셀으로 덮여 6 잘 플레이트 (EStim 챔버)를 전송 및 전원 공급 장치에는 와이어를 연결.
3. 2.5 V 부하 출력 전원 공급 장치를 설정 하 고 1 h^3,9EStim 셀 치료.
4. 자극, 후 전원 공급 장치를 분리 하 고 인큐베이터에서 EStim 챔버를 제거 합니다. 무 균 조건 하에서 표준 6-잘 접시 뚜껑 전극 장착 뚜껑을 교환 합니다.
5. 인큐베이터에 있는 셀을 반환 하 고 그들을 떠나 하룻밤. 전극, 먼저 PBS 그리고 70% 에탄올 솔루션을 청소. 정밀한 사 포로 전극 표면에서 축적 된 부식 제품을 청소.
6. 6 일 연속 3.1-3.5 단계를 반복 합니다. 하루에 4, EStim를 적용 하기 전에 조건 하에서 무 균, 매체의 1.5 mL를 발음 하 고 prewarmed 신선한 OM.의 1.5 mL와 함께 그것을 대체 하 여 문화 매체 변경
7. 7 일 연속 EStim를 적용 한 후 유지 문화에 셀 추가 7 일 교환 매체 매 3-4 일.

4. osteogenic 차별화 측정

1. 현미경으로 세포 형태학 변화 분석.
2. 으로 MSC osteogenic 차별화, 측정 칼슘 증 착, 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활동, 및 osteogenic 마커 유전자 발현, EStim의 효과 평가 하기 위해^3,9다른 곳에서 설명 합니다.

결과

100 mV/mm EStim의 MSCs, 셀 EStim 3에 대 한 치료의 osteogenic 차별화에의 효과 평가 하기 위해 7 그리고 14 일 또는 nontreated (제어) 형태학 상 변화 고 칼슘 증 착 (그림 2를 평가 하 여 경작의 14 날에 분석 되었다 ). 밝은 분야 현미경 검사 법 (형태 변화)를 사용 하 여 셀 이미징 하거나 4 %paraformaldehyde 솔루션에서 세포를 고정, 0.02% 알리자린 레드 솔루션 얼룩을 다음 이미징 그들은 이렇게 밝은 분야 현미경 검사 법 (칼슘 증 착을 사용 하 여 분석)입니다.

Osteogenic 마커 유전자 표현의 변화에 대 한 자세한 분석은 3, 7, 및 자란 (그림 3)의 14 일에 수행 되었...

토론

여기 우리는 챔버와 향상 된 osteogenic 차별화 결과 EStim와 중간 엽 줄기 세포를 치료 하는 방법의 건설을 설명 합니다.

제시 EStim 설치 특수 장비/지식이 필요로 하지 않습니다 하 고 주니어 연구자에 의해 표준 줄기 세포 생물학/생화학 실험실에서 수행할 수 있습니다. 그러나, 건물 EStim 챔버를 사용 하는 경우에, 몇 가지 중요 한 단계에서 특별 한 배려를가지고 한다. 백 금 전극 처리,이 금속은 매우 유 순 하 고 섬세 한 여분 배려를가지고 한다. 다른 금속, 강철 또는 텅스텐, 사용할 수 있지만 이러한 세포 독성¹³수 있는 부식에 수 그리 다는 권장 하지 않습니다. 또한, 전극과 뚜껑 청소/살 균으로 때문에이 메서드를 반복적으로 테스트 하 고 문제 오염 제거에 효과가 있어야 발견 프로토콜에 설명 된 대로 정확 하 게 수행 되어야 합니다. 마지막으로,이 챔버 다른 공부 하는 데 사용 될 수 EStim 민감한 세포 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Estim fabrication
Banana connector/Jack adaptor	Poppstars	1008554	2개
절단 펜치	Knipex	78 03 125
DC 전원 공급 장치(0-30V/0-3A)	B& K Precision	모델 9130B	모든 유사 모델을 사용할 수 있습니다
. 절연 유연한 전선 (0.14 mm2)	Conrad Electronic International	604794, 604093	2개
비부식성 실리콘 고무	Dow Corning	3140 RTV	*많은 상점에서 구입할 수 있습니다
플래티넘 와이어 (999,5/1000; 1mm ø)	Junker Edelmetalle	00D-3010	0.6 m 1 Estim 챔버
70 % 에탄올 용액	모든		Estim 챔버
은도금 구리선 (0.6 mm &lslash;)	콘래드 일렉트로닉 인터내셔널	409334 - 62	≈ 1 Estim 장치에 70cm 필요
납땜 인두 세트	Conrad Electronic International	1611410 - 62	모든 simular 모델을 사용할 수 있습니다
TPP 6웰 플레이트 뚜껑	Sigma-Aldrich	Z707759-126EA	Estim 챔버용 뚜껑
2.2V 유선 원형 LED	Conrad Electronic International	599525 - 62	6개
UHU Super glue	UHU GmbH & Co. KG	해당 없음	*많은 상점에서 구입할 수 있습니다
MSC culture
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G9422	골생성 세포 배양
DMEM, 저포도당, GlutaMAX 보충제, pyruvate	Thermo-Fischer Scientific	21885025	배양
DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음	Thermo-Fischer 과학적	14190144	세포 배양
덱사메타손	Sigma-Aldrich	D4902	골형성 세포 배양
소 태아 혈청	Thermo-Fischer 과학적	10500064	배양
50ml Falcon tube	Sarstedt	62,547,004	세포 배양
L-아스코르브산	Sigma-Aldrich	A4544	골형성 세포 배양
페니실린/스트렙토마이신	Thermo-Fischer Scientific	15140122	배양
Sprague-Dawley(SD) 쥐 중간엽 줄기세포, 골수 유래	Cyagen	RASMX-01001
세포 박리 용액	Thermo-Fischer Scientific	A1110501	배양, 세포 박리
TC 플라스크, T75	Sarstedt	833911302	세포 배양
TPP 6웰 플레이트	Sigma-Aldrich	Z707759-126EA	세포 배양
Trypan Blue Dye, 0.4% 용액	Bio-Rad	1450021	세포 수