Method Article

눈 Microvessels의 질량 분석 기반 Proteomics 분석을 위한 시료 준비

DOI:

10.3791/59140

⸱

February 22nd, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University Medical Centre of the Johannes Gutenberg University Mainz

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

눈 microvascular 침대의 프로테옴 특성은 인 간에 있는 많은 눈 병 리의 깊이 있는 이해를 위해. 이 연구에서는 단백질 추출 및 질량 분석 기반 proteomics 분석 모델 선박으로 돼지 짧은 후부 속눈썹 동맥을 사용 하는 작은 혈관에서 샘플 준비, 급속 한, 효과적이 고 강력한 방법 보여 줍니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

격리 된 눈 혈관 고급 기술 접근을 사용 하 여 눈의 병 태 생리 상태를 해독 하기 위해 생체 외에서의 사용은 크게 특정 질병의 우리의 이해 확대. 질량 분석 (MS)-기반된 단백질 분자 메커니즘 및 신호 통로 건강 및 질병에 혈관 침대에서 단백질에 있는 변경은 해명 하는 강력한 도구로 떠오르고 있다. 그러나, MS 분석 이전 샘플 준비 단계 재현할 결과 및 복잡 한 프로테옴의 깊이 있는 설명에 결정적 이다. 이것은 눈 microvessels, 분석에 사용할 수 있는 샘플의 크기는 종종 제한 됩니다 및 따라서, 최적의 단백질 추출에 대 한 도전 포즈의 준비를 위해 특히 중요 하다. 이 문서는 모범적인 retrobulbar 안구 혈관 베드 채용 돼지 짧은 후부 속눈썹 동맥에서에서 샘플 준비에 대 한 효율적인 신속 하 고 강력한 프로토콜을 제공 하기 위해 노력. 현재 메서드 맞추고 상쾌한 균질, 다음 샘플의 펠 릿에서 단백질 추출 절차 샘플 이전 1 차원 젤 전기 이동 법 및 펩 티 드 정화 원심 필터 장치 청소 액체 착 색 인쇄기-분무 이온화 선형 이온 함정 Orbitrap MS 시스템에서 레이블 없는 정량화에 대 한 단계. 이 방법은 눈 microvessels의 proteomics 분석을 위해 특별히 개발 되었습니다, 하지만 우리 또한 설득력 있는 증거는 그것 또한 채택 될 수 있다 쉽게 다른 조직 기반 샘플에 대 한 제공가.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteomics, 어떤 허가 통합 및 탁월한 데이터 수집 능력의 분야에서 발전 크게 반영에서 특정 질병 조건 뿐만 아니라 기본 분자 메커니즘에 대 한 우리의 이해에 혁명을는 특정 세포 인구 또는 조직1,2,,34의 생리 적인 상태입니다. Proteomics 또한 때문에 감도 및 편견된 분석으로 최종 진단 및 예 후, 잠재적인 질병 마커의 식별을 용이 하 게 다른 눈 샘플의 안과 연구에 중요 한 플랫폼으로 입증 했다 입증 우아하게 많은 연구에 의해 최근 몇 년 동안, 우리의 일부를 포함 하 여1,5,6,7,8,,910. 그러나, 그것은 종종 특히 신뢰할 수 있는 비교 분석에 대 한 건강 한 개인에서 제어 자료에 대 한 필요성을 고려 하 고 윤리적인 이유로 proteomic 분석에 대 한 인간의 샘플을 얻기 어렵다. 다른 한편으로, 그것은 또한 충분 한 양의 최적의 안정적인 대량 spectrometric 분석에 대 한 샘플을 얻기 위해 도전입니다. 이것은 눈의 혈관 마이크로 등 대량 제한 생물 재료 특히 중요 합니다. 하나 같은 주요 retrobulbar 혈관 눈 피 흐름의 규정에서 중추적인 역할을 수행 하는 짧은 후부 속눈썹 동맥 (sPCA). 어떤 섭 동 또는이 혈관 침대에 이상이 녹 내장 및 nonarteritic 이전 허 혈 성 시 신경 병 (NAION)11 등 여러 가지 광경을 위협 질병의 병 인으로 이어질 수 있는 심각한 임상 영향에 발생할 수 있습니다. , 그러나 12.,이 동맥 침대 위에서 언급 한 단점 때문에 프로테옴 변화 elucidating 연구의 부족이 있다. 따라서, 최근 몇 년 동안, 집 돼지 (Sus scrofa 부채, Linnaeus 1758)로 떠오르고 있다 좋은 동물 모델 안과 연구 인간과 돼지13, 사이 높은 형태 론 적과 계통 발생 유사성 때문에 , 1415. 돼지 눈 샘플은 쉽게 사용할 수 있으며, 가장 중요 한 것은, 인간의 조직의 더 정확한 표현.

이 microvessels에서 효율적인 단백질 추출 및 분석에 대 한 음식을 장만 하는 방법론의 부족 뿐 아니라 눈, 이러한 혈관의 중요 한 역할을 고려 하면 우리가 이전 한 사내를 사용 하 여 돼지 sPCA의 프로테옴 특징 있다 프로토콜 귀착되 었 다 단백질16의 높은 숫자의 id입니다. 이 연구를 바탕으로, 우리는 추가 최적화 고 깊이 있는 설명 모델 조직으로 돼지 sPCA를 사용 하 여 샘플의 총계에서 프로테옴 분석 수 있는이 문서에서 우리의 방법론. 이 연구의 주요 목적은 질량 제한 눈 혈관에 대 한 MS 호환 방법론을 확립 하는, 이기는 하지만 우리는 설명된 워크플로 또한 광범위 하 게에 적용할 수 있는 다양 한 조직 기반 샘플 실질적인 실험 증거 제공.

그것은이 작은 양의 종합 프로테옴 분석에 대 한 자료에서 높은-품질 MS 호환 샘플의 준비를 위한 도구가 될 것 이다 상상.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

동물 샘플을 사용 하 여 모든 실험 절차는 비전에서 연구를 위한 협회와 안과 (ARVO) 문을 사용의 동물 안과 및 비전 연구 기관 지침에 대 한 엄격한 준수에서 수행 했다. 이 연구는 실시 하 고 안 과학의 부, 대학 의료 센터 마인츠에 승인 했다.

참고: 시 신경 및 extraocular 조직 돼지 눈 신선한 로컬 도살 장에서 가져온 즉시 사후. Enucleated 눈 버퍼링 차가운 인산 염 (PBS)에 실험실으로 이송 되었고 즉시 사용. 그림 1에 표시 된 워크플로 고용의 도식 개요가입니다.

1입니다. 솔루션

  1. Krebs-Henseleit (K-H)를 준비 하려면 버퍼, 한 건조 하 고 깨끗 한 50 mL 원뿔 원심 분리기 관으로 다음 화학 물질 (NaCl의 27.68 g, NaHCO3의 8.4 g, KCl의 1.4 g, MgSO4, 1.18 g와 KH2포4의 0.64 g)를 무게 및 1.47 g CaCl2 와 다른 관으로 포도의 8.0 g.
    참고: 이러한 화학 물질의 분말 혼합물은 차가운 건조 한 장소에 저장 되어야 합니다. CaCl2 포도 당 분말 혼합 가장 신선한 습기와 응집의 흡수를 방지 하기 위해 준비가 되어 있습니다.
  2. 준비를 추출 버퍼 2a 펠 렛 샘플, 시 약 A 막 횡단 단백질 추출에서의 추출 버퍼 2와 100 µ L의 믹스 100 µ L 당 200 µ L 키트 ( 재료의 테이블에에서 b 6 참조).
    참고: Aliquot 작업 부분-20 ° C에서 저장소로 구성 된 추출 버퍼 2, 시 약 A와 프로 테아 제 억제 물 칵테일 막 횡단 단백질 추출 키트의 구성 요소를 사용 하 여를 연장 한다. 반복 중지 및 재개를 하지 마십시오. 펠 렛 추출 절차의 시작 전에 실내 온도 (RT) 시 약을 녹여.
  3. 암모늄 탄산염 (ABC, 100 mM) 솔루션을 준비, 이온된 물 50 mL에 ABC의 0.39 g을 분해.
  4. 10mm를 준비 하려면 1, 4-dithiothreitol (DTT) 솔루션, 100 mM ABC의 20 ml에서 DTT의 30 mg 분해.
  5. 55 m m Iodoacetamide (IAA) 솔루션을 준비, 100 mM ABC의 20 mL에서 IAA의 200 mg을 디졸브.
    참고: IAA는 어둠 속에서 유지 되어야 한다. 빛에 민감한 솔루션 튜브 포장 알루미늄 호 일을 사용 합니다.
  6. 10 mM ABC와 10%를 포함 하는 트립 신 버퍼를 준비 (vol / vol) 이기 (ACN). 20 µ g 13 ng / µ L 트립 신 작업 솔루션을 준비 하는 콘텐츠를 분해 하는 트립 신의의 한 유리병에 트립 신 버퍼의 1.5 mL를 추가 합니다.
    참고: 제공 학년 수정 trypsin 시퀀싱 동결 건조 된과 사용까지-20 ° C에 저장 해야 합니다.
  7. 펩타이드 추출 버퍼를 준비 하려면 ACN 5% 포 름 산의 1:2 (v/v) 혼합.
    참고: 1.3-1.7 신선한 사용 직전 단계에서 모든 솔루션을 준비 하 고 사용 하지 않는 볼륨 삭제.
  8. 0.1 %trifluoroacetic 산 (TFA), 혼합 준비 TFA의 10 µ L 이온된 물 10 mL로 한다.

2입니다. 짧은 후부 속눈썹 동맥의 격리

참고: 돼지 눈 앞쪽 (그림 2A) 및 후부 섹션 (그림 2B)으로 기본적으로 나누어져 있습니다.

  1. 얼음 처럼 차가운 K H 버퍼를 포함 하는 해 부 챔버에 눈 지구를 놓습니다. 조심 스럽게 잘라 거리 주변 근육과 조직을 날카로운가 위를 마요네즈의 한 쌍.
  2. 메스로 절 개 하 고 눈 앞쪽 및 후부 반으로 분리 될 때까지 한 쌍의 날카로운가 위를 마요네즈와 적도 면을 따라 세계를 잘라. 제거 가능한 표준 패턴 집게의 쌍을 사용 하 여 눈의 후부 절반에서 훨씬 유리 몸.
    참고: 눈 세계의 2 개 반으로 분리 해 부 접시에 눈을 이동 하지 않고 쉽게 sPCA의 격리를 지원 합니다. 그러나,이 단계는 필수. 혈관 눈 세계를 열지 않고 격리 된 수도 있습니다.
  3. 신중 하 게 눈의 후부 절반 아래로 핀 절 개 핀을 사용 하 여 아래로 망막 사이드와는 실험으로 향하도록 시 신경.
  4. 부드럽게 잘라 멀리 학생 욕실이 봄이 기본 retrobulbar 맥 관 구조를 폭로 시 신경을 둘러싼 결합 조직.
  5. SPCA는 sclera를 관통 하 고 원주 (그림 2C) 시 신경 머리를 둘러싸고 (5-8 분기) 사이의 혈관의 짧은 가지로 볼 수 있습니다. Paraoptic 및 주변 결합 조직 유형 5 정밀 핀셋과 욕실이 capsulotomy가 위 (그림 2D)의 쌍과 함께 원심 sPCA 격리 합니다.
    참고: K H 버퍼 격리 절차 동안 차가운 유지 확인 합니다. 그것은 주위 온도 따라 20-30 분 마다 버퍼를 변경 하려면 좋습니다.

3. 샘플 준비

  1. 부드럽게 추가 뾰족한 타입 5 정밀 핀셋과 욕실이 capsulotomy가 위 아래는 stereomicroscope 사용 하 여 동맥 세그먼트에서 결합 조직을 제거 하 고 오염 물질을 제거 하 고 혈액 잔류물을 얼음 처럼 차가운 PBS에 격리 된 동맥을 씻어.
    참고: 샘플은 다음 단계에 즉시 적용 되지 않습니다, 경우 스냅-동결 그들 액체 질소와-80 ° C에 게 추가 사용까지.
  2. 풀 한 생물 복제를 얻고, 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 그들을 전송 하 고 무게 분석 균형을 사용 하 여 샘플을 두 눈에서 동맥.
  3. 각 튜브를 추가 다음 조직 단백질 추출 시 약 0.5 m m와 1.0 m m 지르코늄 구슬의 혼합물 (T-당; B7 테이블의 자료를 참조).
    참고: T의 볼륨-당 샘플의 50 밀리 그램을 시 약 1 mL의 비율로 각 관에서 샘플의 무게에 따라 달라 집니다. 균질 1의 볼륨 비율에 대 한 튜브를 로드할 때 따라 엄지손가락의 일반적인 규칙: 1:2 = 샘플: 구슬: T-(그림 3A) 당. 비효율적인 균질 화를 방지 하기 위해 추출 버퍼와 구슬의 너무 작은 금액의 너무 큰 볼륨을 사용 하지 마십시오.
  4. 믹서 균질 화기에 샘플 튜브를 로드 (D6 테이블의 재료에 참조). 2 분 및 속도 레벨 6에 타이머를 설정 하 고, 균질을 시작. 실행 후 샘플까지 완전 한 균질 및 반복에 대 한 샘플은 완전히 확인 (그림 3B) 무 균.
    참고: 총 24 샘플 튜브의 한 실행에는 무 균 수 있습니다. 그것은 단백질 변성을 최소화 하기 위해 균질 과정 샘플을 차가운 유지 하는 것이 중요입니다. 이 연구에 사용 된 총알 믹서 균질 화기는 샘플을 차가운 유지 하는 고유의 냉각 기능이 있습니다. 아니 내부 냉각 기능이 균질 화기에서 사용할 수 있는 경우에 각 실행 사이 얼음에 샘플을 보관할 수 있습니다.
  5. 신중 하 게 신선한 microcentrifuge 튜브 homogenate 플라스틱. 불용 성 단백질 및 수용 성 단백질을 포함 하는 별도 상쾌한 펠 렛을 4 ° C에서 20 분 동안 10000 x g 에서 샘플 원심 조심 스럽게 플라스틱는 상쾌한 밖으로 신선한 microcentrifuge 튜브에 펠 릿 레이어 (그림 3C)를 건드리지 않고.
    참고: 추가 사용까지-80 ° C에 상쾌한와 펠 릿을 저장할 수 있습니다.

4. 펠 릿 소화

  1. 각 펠 릿 샘플을 추출 버퍼 2A의 200 µ L 및 프로 테아 제 억제 물 칵테일의 5 µ L를 추가 합니다. 여러 번은 피 펫으로 펠 릿을 일시 중단 합니다.
    참고: 펠 릿에 추가 하기 전에 잘 추출 시 약을 혼합. 추출 절차에 걸쳐 RT에서 얼음 및 프로 테아 제 억제 물에 추출 버퍼 2A를 유지.
  2. 초음파 균질 화기를 사용 하 여 완전히 균질 펠 릿.
    1. 60을 1 주기 진폭을 설정 합니다. 티타늄 (Ø 0.5 m m, 길이 80 m m), 작은 볼륨 (10-500 µ L)와 샘플의 균질에 대 한 적합 한 프로브를 사용 합니다.
    2. 펠 릿 및 추출 버퍼 혼합물에 프로브를 담가 그리고 초음파를 샘플 폭로 시작 버튼을 누릅니다.
    3. 펠 렛 덩어리는 완전히 무 균 때까지 샘플을 sonicate. 각 쥡니다 사이 몇 초 동안 일시 중지 합니다.
    4. 시각적으로 완전 한 균질에 대 한 확인 하십시오. 믹스는 homogenate 여러 번 아니 수 풀을 피 펫.
      참고: 펠 렛 추출 절차는 균질 (그림 4) 중에 생성 된 열으로 인해 단백질 변성을 방지 하기 위해 얼음에 밖으로 실행 되어야 한다.

5. 샘플 청소 및 교환 버퍼

  1. 3 kDa 컷오프와 원심 필터 장치를 사용 하 여 참조 테이블의 자료에서 D3 수정 제조업체의 지침에 따라이 절차에 대 한 해당 되는 경우. 첫째, microcentrifuge 튜브 (필터 팩에서 제공)에 필터 장치를 삽입 합니다.
  2. 하나의 필터 장치 샘플 homogenate의 200 µ L 플라스틱 고 같은 필터에 이온된 수의 200 µ L를 추가 합니다. 안전 하 게 모자(그림 5).
  3. 장소 필터 단위 분리기 및 14000 x g 4 ° c.에서 15 분에 대 한 회전
  4. 원심 분리기에서 장치를 제거 하 고는 여과 액을 포함 하는 microcentrifuge 튜브에서 샘플 집중을 포함 하는 필터 단위를 구분. 여과 액 (그림 5B)를 삭제 합니다.
  5. 필터에 이온된 수의 400 µ L을 추가 하 여 집중을 다시 구성. 5.3 및 5.4 3 번 단계를 반복 합니다. 조심 스럽게 플라스틱 깨끗 한 microtube로 '청소' 샘플 집중.
    참고: 일반적으로, 200 µ L 원유 샘플 보장할 수 50 ~ 70 여과 후 농축의 µ L.
  6. 나머지 샘플 homogenates 단계 5.1-5.5 반복 합니다.

6. 단백질 측정

  1. Bicinchoninic 산 (BCA) 단백질 분석 결과 사용 하 여 키트 (참조 테이블의 재료에 B5) 플레이트 리더에 sPCA 샘플의 상쾌한 및 펠 릿 분수의 단백질 농도 결정 하.
  2. 제조업체의 지침에 따라 한 1 mL 앰 풀 2 mg/mL BSA, 구성 된에서 알 부 민 표준 (BSA) 희석 (최종 BSA 농도 범위 2000 25 µ g/mL)를 준비 합니다.
  3. 각 BSA 표준 희석의 10 µ L 플라스틱 고 샘플 바닥이-96-잘 빠진 미 판의 각 음에 (상쾌한 및 펠 릿)를 복제 합니다.
  4. BCA 시 약 50 부분 BCA 시 약 A의 BCA 시 약 b 1 부분에 추가 하 여 작업 준비
    참고: 준비에 앞서 각 측정에 필요한 작업 시 약의 총 볼륨을 계산 하 고 갓 샘플 및 분석 될을 표준 희석의 수에 따라 충분 한 볼륨을 준비.
  5. 신중 하 게 각 음에 시 약을 작동 하는 BCA의 200 µ L 플라스틱. 커버는 미 판 하 고 30 분 동안 37 ° C에서 품 어. 562에서 흡 광도 측정 하는 냉각 후 rt 플레이트, 플레이트 리더에 nm (D13 테이블의 재료에 참조).
  6. 각 BSA 표준 농도 (µ g/mL)에 대해 생성 된 표준 곡선에 따라 달라 집니다, 샘플의 단백질 농도 결정 합니다.

7. 1 차원 젤 전기 이동 법 (1DE)

  1. (대 한 한 샘플) 표 1 에서 같이 1DE에 대 한 샘플을 준비 합니다. 피 펫 잘 샘플 혼합 믹스. 15 분 및 실시간 멋진 70 ° C에서 샘플을 열
  2. 950 mL 이온된 물 50 mL MES SDS 실행 버퍼를 추가 하 여 실행 버퍼 x 1을 준비 합니다. 잘 믹스.
  3. 캐스트 4-12% 두번째-트리 스 단백질 젤 (자료의 테이블에 b 4를 참조)를 준비 합니다.
    1. 젤 카세트 제거 하 고 카세트 이온된 물으로 린스를 플라스틱 주머니 오픈 컷.
    2. 한 움직임, 우물을 손상 하지 않도록 주의 복용에 젤 카세트에서 빗을 제거 합니다.
    3. 부드럽게 로드 웰 스는 피 펫을 사용 하 여 실행 버퍼 x 1와 2-3 번 씻어. 반전 하 고 부드럽게 제거 되도록 거기 우물에서 없음 기포 버퍼에 젤 카세트를 흔들.
    4. 젤 카세트의 하단에 흰색 테이프를 제거 합니다.
  4. 일단 완벽 하 게 조립 및 탱크를 실행 하는 젤으로 젤 (최대 2 개의 카세트)를 삽입, 젤 긴장 쐐기 잠금.
  5. 채우기 위 (음극) 버퍼 챔버 실행 버퍼의 200 mL와 함께 우물 완전히 덮여 때까지. 어떤 누출 든 지 확인 하십시오.
  6. 항 산화의 500 µ L 추가 (참조 테이블의 자료에서 A14) 실행 버퍼를.
    참고: 항 산화는 샘플 환 원제와 감소와 함께 사용 해야 하는 타당성 시 약 (참조 표 1) 전기 이동 법 동안 감소 상태를 유지 하 고 다시-트립토판 등 중요 한 아미노산의 산화를 방지 하 고 메티오닌입니다.
  7. 신중 하 게는 피 펫을 사용 하 여 차선 당 샘플의 50 µ g를 로드 합니다. 그런 다음, 분자 질량 표식으로 전 얼룩진된 단백질 표준 로드 (A18 테이블의 재료에 참조).
  8. 실행 버퍼의 600 mL로 낮은 (양극) 버퍼 챔버를 채우십시오.
  9. 175 V의 정 전압에서 ~ 60 분 젤을 실행 합니다. 실행의 끝에, 신중 하 게 젤 칼을 사용 하 여 카세트 판에서 젤을 제거 합니다.
  10. 조심 스럽게 상자를 얼룩 젤으로는 젤을 전송 합니다.
    1. 신선한 얼룩이 질, 제조업체의 지침에 따라 표 2에 설명 된 대로 하는 젤의 총 수에 따라 고정 솔루션을 준비 합니다.
    2. 락 플랫폼에 RT에서 10 분 동안 고정 솔루션에는 gel(s)를 흔들어.
  11. 담합 솔루션을 삭제 하 고는 젤 콜 로이드 블루 키트를 얼룩 얼룩.
    1. 준비 얼룩 솔루션 신선한 얼룩이 질 필요가 있는 젤의 총 수에 따라 표 3에 설명 된 대로 제조업체의 지시에 따라.
    2. 첫째, 적절 한 볼륨을 측정 하 고 직접 젤 얼룩 상자에에서 별표 (*)로 표시 된 구성 요소를 믹스. 락 플랫폼에 RT에서 10 분 동안 염색기 B 없이 얼룩 솔루션에는 gel(s)를 흔들어.
    3. 얼룩 상자 포함에 직접 염색기 B 추가 * 솔루션 얼룩. 염색기 B를 사용 하기 전에 잘 흔들어 있는지 확인 합니다.
      주의: 7.10.1과 연기 후드 7.11.1 준비 단계를 실시 합니다.
  12. 최상의 전반적인 결과 위해 밤새 얼룩 솔루션에는 gel(s)를 흔들어.
    참고: 얼룩진된 밴드 염색기 B. 얼룩의 추가 3 h의 최소 필요 하 고 얼룩 솔루션에 더 많은 시간에 대 한 경우 강도 다양 하지 않습니다 후 10 분 내에 표시 될 것입니다.
  13. 신중 하 게 얼룩 솔루션을 가만히 따르다 하 고 이온된 물 200 mL를 바꿉니다. 흔들어 취소 배경 물에 적어도 7-8 h에 대 한 gel(s).
    참고: 이온된 수는 더 나은 과도 한 얼룩을 제거 하는 destaining 절차 동안 여러 번 변경 되어야 합니다. gel(s) 수 있습니다 또한 남아 있을 물에서 최대 3 일 동안 단백질 밴드 강도 손상 시 키 지 않고. 경우는 gel(s) 다음 단계를 즉시 대상이 되지 않습니다, 그것은 장기 저장을 위한 4 ° C에서 20% 황산 용액에 저장할 수 있습니다.

8. 젤 Tryptic 소화

참고: 이 프로토콜 메서드에 솁첸코 외.17, 약간의 수정에 의해 따라 이다. 층 류에이 절차를 실시 한다 후드와 펫, 팁, 튜브, 유리의 전용된 세트를 사용 하 여이 목적을 위해 특별히. 착용 장갑 및 적절 한 실험실 복 각 질 및 다른 오염을 방지 하기 위해 모든 시간에. 모든 솔루션 및 곧 사용 하기 전에이 절차에 사용 된 시 약을 준비 합니다.

  1. 깨끗 하 고 새로운 톰 블레이드와 젤에서 단백질 밴드를 삭제할. 작은 조각 (약 1 m m x 1 m m 2 m m x 2 m m)으로 밴드를 잘라. 신중 하 게 1.5 mL microcentrifuge 튜브 젤 조각 전송 합니다.
    참고: 너무 작은 조각 피 펫 팁을 방해할 수 있는 하 고 더 큰 펩 티 드 복구를 줄일 것입니다. 매우 날카로운 톰 블레이드를 사용 하 여 때 주의 합니다.
  2. Destaining
    1. 100 mM ABC 솔루션 / = (1:1, v/v)를 포함 하는 destaining 솔루션의 500 μ를 추가 하 고 가끔 흔들어 또는 vortexing 30 분 RT에서 샘플을 품 어.
    2. Destaining 솔루션을 신중 하 게 플라스틱. 잔여 얼룩과 어떤 튜브를 시각적으로 확인 합니다. 젤 조각 여전히 파란색 얼룩이 진 경우 8.2.1 단계를 반복 합니다.
  3. 감소 및 알
    1. 갓된 DTT 솔루션의 ~ 400 µ L을 추가 하 고 솔루션 완전히 젤 조각 커버 해야 30 분 56 ° C에서 품 어. 신중 하 게 줄이는 솔루션 플라스틱 하 고 삭제.
    2. 갓된 IAA 솔루션의 ~ 400 µ L을 추가 하 고 30 분 제거는 피 펫으로 버퍼는 alkylating 및 삭제에 대 한 실시간에 어둠 속에서 품 어.
  4. 소화
    1. 깔끔한 ACN의 500 µ L RT에 대 한 추가 10-15 분 젤 조각 축소 하 고 불투명 하 게 될 때까지. ACN 개 pipette 고 젤 조각 후드 5-10 분에 대 한 건조.
    2. 완전히 커버 젤 조각에 각 관으로 트립 신 솔루션의 50 µ L 플라스틱. 30 분 동안 4 ° C에 튜브를 품 어.
    3. 30 분 후 모든 트립 신 솔루션 젤 조각에 의해 흡수 되어 각 튜브를 선택 합니다. 필요한 경우 완전히 커버 젤 조각에 충분 한 양의 trypsin 버퍼 (50-100 µ L, 튜브에서 볼륨에 따라)를 추가 합니다. 37 ° c.에 하룻밤 샘플을 품 어
  5. 펩타이드 추출
    1. 조심 스럽게 플라스틱 튜브 및 청소 microtubes 전송에서 추출 된 펩타이드 솔루션. 원심 진공 증발 기에 상쾌한 드라이.
      참고: 남은 젤 조각을 버리지 마십시오.
    2. 추출 버퍼의 100 µ L를 추가 (단계 1.7 참조) 각 관을 떨고와 37 ° C에서 30 분 동안 품 어.
    3. 각 밴드에 따라 추출 된 펩 티 드를 포함 하는 동일한 microtubes에는 상쾌한 플라스틱 고 진공 원심 분리기에서 아래로 건조.
      참고: 즉시 사용 하지, 말린된 펩타이드 추출 물 추가 사용까지 몇 개월-20 ° C에 저장할 수 있습니다.

9. 펩타이드 정화

참고: 이 펩 티 드 샘플 담 고 정화 절차 C18 피 펫 팁의 사용 실시 (C15 테이블의 재료에 참조). 각 샘플에 대 한 새로운 팁을 사용 합니다.

  1. 준비 원뿔 원심 분리기 튜브에 약 수 다음 솔루션 신선한 2 mL microcentrifuge 튜브로 펩 티 드 정화 절차에 대 한 표 4와 같이. 펩 티 드 정화에 대 한 튜브의 개요는 다음과 같습니다: (샘플 솔루션), 튜브 튜브 B (일로 솔루션), 튜브 C (평형 솔루션), 튜브 D (세척 솔루션), 튜브 F (는 빈 2 mL 또는 5 mL microcentrifuge 튜브에 따라 튜브 E (차입 솔루션) 청소, 폐기물 처리에 대 한 샘플의 수), 및 튜브 G (깨끗 하 고 빈 microtube, 용량 0.2 mL).
  2. 단계 8.6.3 0.1%의 10 µ L에서에서 말린된 펩타이드 추출 reconstitute TFA. 이 튜브는 튜브 A. 지정
  3. 5 분 동안 얼음 초음파 목욕에서 튜브 A sonicate
  4. 1 분에 1000 x g 벤치탑 원심 분리기에서 샘플 솔루션 아래로 회전 합니다.
  5. P10 micropipette 10 µ L의 최대 볼륨 설정으로 설정 하 고 C18 피 펫 팁을 단단히 부착.
  6. 일로 솔루션 (B 관)으로 피 펫 팁을 담가 그리고 신중 하 게 포장 소재에 발음. 천천히 분배 튜브 F. 반복으로 폐기물이이 단계 적어도 7-8 시간.
    참고: 죽은 중지 피 펫 플런저를 우울 하 게 천천히 해제 또는 절차에 걸쳐 플런저를 분배. 주의 사항 C18 열에 최대 펩타이드 바인딩 되도록 pipetting 동안 팁으로 공기 방울을 소개를 하지.
  7. 펩 티 드 바인딩 위한 팁 발음 10 equilibrate 튜브 C. µ L 평형 솔루션 솔루션을 삭제 하 고이 절차를 반복 3-4 회.
  8. 다음, 발음 하 고 열 팁을 펩 티 드를 바인딩할 여러 번 (두께 따라 해당 젤 밴드) 관 A에서에서 샘플 솔루션을 분배 합니다.
    주의: 포부와 바인딩 절차 (단계 9.8) 동안 분배 단계 관 A. 내의 실시 샘플 솔루션을 낭비를 분배 하지 않습니다.
  9. 튜브 d에서 세척 솔루션을 발음 하 고 낭비 (튜브 F) 4 ~ 5 배 그것을 삭제 하 여 C18 피 펫 팁을 세척.
  10. 마지막으로, pipetting 차입 솔루션 (튜브 E) 하 고는 eluant 관 g.로 분배 하 여 바인딩된 펩 티 드를 elute
  11. 샘플 샘플 복구 증가 당 2 ~ 3 사이클 전체 단계를 반복 합니다.
  12. 하나의 샘플 정화 후 끝을 삭제 하 고 샘플에 대 한 새로운 팁을 사용 하 여.
  13. 드라이 진공 집중 장치에 순화 된 펩 티 드 있다.
    참고: 순화 샘플 LC ESI LTQ Orbitrap MS 시스템에서 LC-MS/MS 분석에 대 한 준비가 있다. 추가 사용까지-20 ° C에서 말린된 견본을 저장 합니다.

10. 액체 착 색 인쇄기-분무 이온화-MS/MS 분석

참고: 레이블 없는 양적 proteomics 분석 액체 착 색 인쇄기-분무 이온화 선형 이온 함정-Orbitrap (LC-ESI-LTQ-Orbitrap) MS 시스템에서 수행 됩니다. LC는 Rheos Allegro 제 사기 펌프 (HTS PAL autosampler 결합 그리고 시스템 구성 30 m m x 0.5 m m C18 사전 열 150 m m x 0.5 m m C18 열에 연결 온라인 degasser를 장착의 구성 합니다. 사용 단계 수성 용 매 A 역방향 0.1% (v/v) 포 름 산 및 유기 용 매 B LC MS 학년 이기 0.1% (v/v) 포 름 산으로 구성 된 LC MS 학년 물으로 구성 된. 젤 밴드 당 60 분의 상영 시간으로 그라디언트를 사용 하 여 우리의 이전 연구6,16에서 자세히 설명 된 대로.

  1. 0.1%의 10 µ L에서 순화 된 펩 티 드 샘플을 분해 TFA. 5 분 동안 얼음에 샘플 sonicate
  2. V-하단 96 잘 접시에 10 µ L 샘플을 플라스틱을 명확 하 고, 접착 커버 필름으로 봉인.
  3. 접시는 autosampler 전송.
  4. 60 분: 0의 각 실행 시간에 대 한 다음 그라디언트를 사용 하 여-35 분 (15-40% 용 매 B), 35-40 분 (40-60% 용 매 B), 40-45 분 (60-90% 용 매 B), 45-50 분 (90% 용 매 B), 50-53 분 (90-10% 용 매 B), 그리고 53-60 분 (10% 용 매 B).
  5. 사용 하는 악기의 대량 spectrometric 다음과: 긍정적인 이온 분무 이온화 모드, 스프레이 전압 (2.15 kV), 모 세관 온도 (220 ° C), 종속 데이터 수집 모드, 자동 수집 Orbitrap MS 사이 전환 하 고 LTQ MS/MS, orbitrap 해상도 (30000), m/z 범위 (1600을 300), 대상 자동 이득 제어 (AGC, 1.0 x 106 이온), 내부 재 (polydimethlycyclosiloxane [PCM] 실시간으로 m/z 445.120025 이온에), MS 모드에서 사용 하는 대량 옵션을 잠금 상위 5 개 가장 강렬한 선구자 이온, 추가 조각화 충돌 유도 된 분리 (CID)에 의해 정규화 충돌 에너지 (후부 터, 3의 반복 횟수와 30 ms의 활성화 시간 35%), 및 동적 제외 기간을 선택 하 여 가져온 연동 데이터 (600 s).
    참고: 결과 조각난된 이온 LTQ는에 기록 됩니다.
  6. 각 샘플에 대 한 적어도 3 개의 생물 복제를 실행 합니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

제한 된 샘플 가용성 안과 연구에 주요 단점 중 하나입니다. 대응 하 게, 최적의 단백질에 대 한 추출 방법 같은 안구 혈관은 종종 논란의 여지가 적은 양의 샘플에서 얻을. 날짜 하려면, 특히 retrobulbar 혈관에서 단백질 추출에 대 한 음식을 장만 하는 방법의 부족이입니다. 방법 최적화의 첫 번째 단계와의 증거-원칙 일반적으로 효능과 몇몇의 견고성을 비교 하는 상대적으로 새로운 시 약, T 단백질 추출 세제를 고용 하는 따라서-당, 우리 심장 조직을 사용 하 여 파일럿 연구 실시 쥐 (때문에 간단 하 고 충분 한 샘플 가용성 최적화 단계). 우리는 총 단백질 농도 다음과 같은 시 약을 사용 하 여 식별 하는 총 단백질 비교 하 여 단백질 수익률 비교: T-당 0.02 %n-라우릴-β-D-maltoside (DDM), 1 %3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-프로 판 된 (챕) 1 %amidosulfobetaine-14 (A...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

다양 한 안구 샘플의 프로 파일링 종합 프로테옴 분자 메커니즘 및 신호 통로 건강 및 질병에 연루를 명료 하 게 하는 중요 하 고 필수적인 첫 번째 단계입니다. 위의 샘플 준비 단계는 강조 표시 된 검토에 의해만 달 호텔 외. 심도 있는 논의로 중요 한 고품질 데이터를 얻을 하 고 이러한 분석에서 얻은 결과의 재현성을 보장, 샘플 처리 절차 눈의 다른 부분에 대 한 2 차원 젤 전기 이동 법 질량 분석 전략1을 채용합니다. 이러한 조사의 라인, 우리의 현재 연구 준비를 위한 급속 한, 강력 하 고 매우 효율적인 MS 호환 샘플 모델 눈 microvessels로 돼지 sPCA를 사용 하 여 최적화 된 단계별 프로토콜을 제공 합니다. 이 조사는 고품질 MS 데이터를 생성 하기 위해 수량 제한 동맥 샘플에서 충분 한 양의 단백질을 추출 하는 특정 방법론의 부족에 따라 시작 되었다. 우리의 방법은 우수한 프로테옴 매핑18수 있도록 마이크로 스케일 기술...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 없다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

박사 Manicam 내부 대학 연구 자금 (Stufe 1) 요하네스 구텐베르크 대학 마인츠와 도이치 가운데 (석사 8006/1-1)에서 부여의 대학 의료 센터에서 지원 됩니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
A. Chemicals
1, 4-Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich1.11474
염화칼슘 이수화물 (CaCl2)   칼 로스 5239.12.5 미터 
둘베코의 인산염 완충 식염수(PBS) Thermo Fisher Scientific14190169
포름산(CH2O2)AppliChemA0748
HPLC 등급 아세토니트릴(ACN, C2H3N)AppliChemA1605
HPLC 등급 메탄올(CH3OH)Fisher ScientificM/4056/17
HPLC 등급 물 AppliChemA1589
요오도아세트아미드 (IAA)시그마-알드리치I6125
염화칼륨 (KCl)   칼 로스 6781.14.7 밀리미터 
인산이수소칼륨(KH2PO4)  칼 로스 3904.21.2 미터 
LC-MS 등급 아세트산  칼 로스 AE69.1
황산마그네슘(MgSO4)     칼 로스 261.21.2 mM 
NuPAGE 항산화Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP0005
NuPAGE LDS 샘플 버퍼 Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP00074x
NuPAGE MES SDS 러닝 버퍼 Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP000220x
NuPAGE 시료 환원제 Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP000410x
SeeBlue Plus2 사전 염색 단백질 표준 Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)LC5925
시퀀싱 등급 수정된 트립신PromegaV5111
염화나트륨 (NaCl)  칼 로스 9265.2118.3 미터 
탄산수소나트륨(NaHCO3)  칼 로스 965.325 미터 
트리플루오로아세트산(TFA,  C2HF3O2)Merck Millipore108178
α-(D)-(+)- 포도당 일수화물  칼 로스 6780.111 미터 
B. 시약 및 키트
0.5mm 산화 지르코늄 비드 다음 AdvanceZROB05
1.0mm 산화 지르코늄 비드 다음 AdvanceZROB10
콜로이드 블루 염색  키트Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)LC6025염색 키트 당 25개의 미니 젤
NuPAGE 4-12 % Bis-Tri 겔Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP0321BOX1.0 mm, 10-well
Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) 단백질 분석 키트 Thermo Fisher Scientific23227
ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEKMerck Millipore71772-3키트당 20회 반응
조직 단백질 추출 시약(T-PER)Thermo Scientific78510
C. Tools
96-well V-bottom platesGreiner Bio-One651180
Corning 96-well 플랫-바텀 플레이트Sigma-AldrichCLS3595-50EA
일회용 마이크로톰 블레이드pfm 의료207500014
일회용 메스 #21pfm 의료200130021
해부 핀 Carl RothPK47.1
엑스트라 파인 본 가위  Fine Science Tools14084-08
Falcon 원뿔형 원심분리기 튜브 (50 mL)Fisher Scientific14-432-22
마요 가위, 터프 컷  Fine Science Tools14130-17
정밀 트위저  Fine Science Tools11251-10타입 5
정밀 핀셋, 스트레이트와 엑스트라 파인 팁Carl RothLH53.1타입 5
자체 접착 밀봉 필름, 마이크로플레이트용Ratiolab (vWR)RATI6018412
표준 패턴 펜치  Fine Science Tools11000-12
학생 Vannas 스프링 가위  Fine Science Tools91501-09
Vannas 캡슐 절개술 가위   Geuder19760  직선, 77 mm
ZipTipC18 피펫 팁Merck MilliporeZTC18S096
D. 장비 및 장치
150 × 0.5 mm BioBasic C18 컬럼Thermo Scientific, Rockford, USA72105-150565
30 × 0.5 mm BioBasic C18 pre-column Thermo Scientific, Rockford, USA72105-030515
Amicon Ultra-0.5 3K 원심 필터 장치 Merck MilliporeUFC50039696 팩
분석 저울SartoriusH51
Autosampler CTC Analytics AG, Zwingen, SwitzerlandHTS Pal
BBY24M 총알 블렌더 스톰 다음 AdvanceNA-BB-25
Eppendorf 집중 장치, 모델 5301Sigma-AldrichZ368172
Eppendorf 마이크로 원심분리기, 모델 5424Fisher Scientific05-403-93비냉장
Heraeus Primo R 원심분리기Thermo Scientific75005440냉장
Labsonic M 초음파 호모게나이저 SartoriusBBI-8535027
LC-MS 펌프, 모델 Rheos AllegroThermo Scientific, Rockford, USA22080
LTQ Orbitrap XL 질량분석기 Thermo Scientific, 독일
Multiskan Ascent Plate reader Thermo Labsystemsv2.6
회전기와 소용돌이 neoLab7-0045
티타늄 프로브 (Ø 0.5mm, 80mm 길이)SartoriusBBI-8535612
초음파 수조, 유형 RK 31Bandelin329
Xcell Surelock Mini CellLife TechnologiesEl0001
브레멘

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mandal, N., Heegaard, S., Prause, J. U., Honoré, B., Vorum, H. Ocular proteomics with emphasis on two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Biological Procedures Online. 12, 56-88 (2010).
  2. Gregorich, Z. R., Ge, Y. Top-down proteomics in health and disease: Challenges and opportunities. Proteomics. 14, 1195-1210 (2014).
  3. Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422, 198-207 (2003).
  4. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537, 347-355 (2016).
  5. Cehofski, L. J., Mandal, N., Honoré, B., Vorum, H. Analytical platforms in vitreoretinal proteomics. Bioanalysis. 6, 3051-3066 (2014).
  6. Manicam, C., et al. Proteomics Unravels the Regulatory Mechanisms in Human Tears Following Acute Renouncement of Contact Lens Use: A Comparison between Hard and Soft Lenses. Scientific Reports. 8, 11526(2018).
  7. Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR 4) in human tear proteome. Proteomics. 14, 1698-1709 (2014).
  8. Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proteomics analysis of human tears from aqueous-deficient and evaporative dry eye patients. Scientific Reports. 6, 29629(2016).
  9. Perumal, N., Funke, S., Wolters, D., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of human reflex tear proteome reveals high expression of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR4). Proteomics. 15, 3370-3381 (2015).
  10. Perumal, N., et al. Characterization of the human aqueous humour proteome: A comparison of the genders. PloS ONE. 12, 0172481(2017).
  11. Hayreh, S. S. Posterior ciliary artery circulation in health and disease the Weisenfeld lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 749-757 (2004).
  12. Zeitz, O., et al. Glaucoma progression is associated with decreased blood flow velocities in the short posterior ciliary artery. British Journal of Ophthalmology. 90, 1245-1248 (2006).
  13. Verma, N., Rettenmeier, A. W., Schmitz-Spanke, S. Recent advances in the use of Sus scrofa (pig) as a model system for proteomic studies. Proteomics. 11, 776-793 (2011).
  14. Foulds, W. S., Kek, W. K., Luu, C. D., Song, I. C., Kaur, C. A porcine model of selective retinal capillary closure induced by embolization with fluorescent microspheres. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6700-6709 (2010).
  15. Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249, 475-482 (2011).
  16. Manicam, C., Perumal, N., Pfeiffer, N., Grus, F. H., Gericke, A. First insight into the proteome landscape of the porcine short posterior ciliary arteries: Key signalling pathways maintaining physiologic functions. Scientific Reports. 6, 38298(2016).
  17. Shevchenko, A., Tomas, H., Havli, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1, 2856-2860 (2006).
  18. Feist, P., Hummon, A. B. Proteomic challenges: sample preparation techniques for microgram-quantity protein analysis from biological samples. International Journal of Molecular Sciences. 16, 3537-3563 (2015).
  19. Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1, 1872-1878 (2006).
  20. Zhang, L., et al. Proteomic analysis of mouse liver plasma membrane: use of differential extraction to enrich hydrophobic membrane proteins. Proteomics. 5, 4510-4524 (2005).
  21. Zhou, H., et al. Improved recovery and identification of membrane proteins from rat hepatic cells using a centrifugal proteomic reactor. Molecular & Cellular Proteomics. 10, 111(2011).
  22. de la Cuesta, F., Mourino-Alvarez, L., Baldan-Martin, M., Moreno-Luna, R., Barderas, M. G. Contribution of proteomics to the management of vascular disorders. Translational Proteomics. 7, 3-14 (2015).
  23. Cottingham, K. 1DE proves its worth... again. Journal of Proteome Research. 9, 1636(2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Ocular MicrovesselsProtein ExtractionMass Spectrometry ProteomicsSample PreparationCentrifugal Filter DevicesOne Dimensional Gel ElectrophoresisPeptide PurificationLiquid Chromatography MSTissue Protein ExtractionPorcine Short Posterior Ciliary Arteries

Related Articles