여기, 우리는 작은 세포 외 소포 (EVs) 뇌와 종양 견본을 포함 하 여 전체 조직에서 분리 하는 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 이 방법은 추가 다운스트림 분석에 대 한 단단한 조직에서 EVs를 추출 하는 재현 기법을 제공 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
순환 및 중간 작은 막 도약 extracellular 소포 (EVs) 새로운 진단 이나 예 후 바이오 마커 분석, 개발을 위한 유망한 목표를 대표 하 고 가능성이 역할의 광범위 한 스펙트럼의 진행에 중요 한 선수 질병입니다. 현재 연구는 여러 세포에서 분 비 소포 특성에 집중 하 고 하기 위해서는 더 나은 조직 종류 조건 neurodegeneration, 염증, 암 등의 병 인에서 EVs의 역할을 이해. 그러나, 세계적으로 일관 되 고 재현 가능한 기술을 분리 하 고 소포를 정화 진행에 남아 있습니다. 또한, ex vivo 단단한 조직에서 EVs의 추출 방법 부족 하 게 설명 합니다. 여기, 우리는 추가 특성에 대 한 뇌와 종양 견본을 포함 하 여 전체 신선 또는 냉동 조직에서 관심의 작은 EVs를 추출 하기 위한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 여러 다운스트림 분석, 전자 현미경 검사 법 및 소포의 immunophenotypic 특성 EV 단백질의 양이 많은 질량 분석을 포함 하 여이 방법의 적응성을 설명 합니다.
서론
작은 세포 외 소포 (EVs) endosomal에서 파생 된 exosomes 등의 광범위 한 생물은 작은 막 창 고 microvesicles. 작은 EVs는 이기종 인구의 50-250 nm 막 도약 소포 포함 하는 생물학적으로 활성 단백질, 지질, 그리고 공동으로 다양 한 질병 과정에에서 중요 한 역할을 믿고 핵 산의 구성 됩니다. 특히 신경 프리온 질환, 전염 성 프로세스, 면역 이나 염증, 및 종양 성장 및 전이1,2,3 에이 소포를 연루는 연구 발전 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 ,
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프로토콜
전체 두뇌에서 기관 동물 사용 및 관리 위원회 (IACUC) 플로리다 주립 대학교의 승인을 획득 했다. 12 마우스 두뇌의 총 (각 연령 집단에서 두뇌를 3: 2, 4, 6, 및 8 개월) C57BL/6 J에서 배경 앞에서 설명한16EV 추출에 사용 되었다. 폐 종양 표본은 프로 리 다 농업과 기계적인 대학 IACUC의 승인 아래 박사 Mandip Sachdeva에 의해 아낌없이 기부 했다. 폐 종양은 인간의 선 암 세포 선 immunodeficient Balb/c 뉴/뉴 누드 쥐에서 성장 하는 H1975에서에서 파생 되었다. 2 대표적인 종양 복제에서 데이터는이 연구에는 강조 표시 됩니다.
참고: 기 격리 및 정화 방법의 개요 개요는 그림 1에 제공 됩니다.
1. 조직 분리 및 차등 원심 분리
- 약 0.4-1.0 당 최대 절전 모드-전자 매체에서의 분리 버퍼 (papain 10 mg, 5.5 m m L-시스테인, 67 µ M 2-mercaptoethanol, 1.1 mM EDTA) 10 mL를 준비 조직의 g. Note EV 농축 및 정화에 사용 되는....
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결과
조직 분리, 차등 원심 분리 및 소포의 그라데이션 정화의 도식 개요는 그림 1에 표시 됩니다. 그라데이션 정화 EVs의 형태 론 적과 immunophenotypic 확인은 그림 2에 강조 표시 됩니다. 재현할 수 밀도의 10-30 %iodixanol 그라데이션 ultracentrifugation 다음 다이어그램 표시 됩니다, 분수 2 (빛 EVs) 및 분수 5 (밀도 EVs), 위쪽으로 마이그레이션 두 가지 기 인구와 조직의 종류에 따라. 그라데이션 분수의 대표 immunoblots 전시 효율적인 분리와 분수 5 작은 종양에서 파생 된 EVs의 정화. 메모의 풍부한 빛 EVs (분수 2) 이전 뇌 조직에서 수확에 비해 밀도 EVs에 등장 하는 폐 종양 표본은 다시 여기 강조. EVs의 글로벌 조직 분석으로 등장, 독특한 조직에 의해 생산 EVs의 뚜렷한 밀도 결정 .......
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토론
많은 과학적인 관심사 작은 EVs 종양 microenvironment 뿐만 아니라 장기 개발, 성숙, 및 기능을 재생 하는 역할에 관하여 생성 되었다. 전반적으로,이 연구 전체 뇌 또는 종양 표본에서 그대로 EVs의 추출에 대 한 최적화 된 워크플로 제공합니다. 여기 단순히 폐 종양에서 파생 된 EVs에이 기술의 적용 시연,이 방법은 쉽게 수 추가의 작은 분 비 소포 ex vivo 특성에 대 한 기회를 제공, 다른 단단한 조직에 대 한 작업에 대 한 적응 광범위 한 생물 의학 관심입니다. 이 연구의 범위를 넘어 발생 하는 조직 식의 EV 콘텐츠의 미래 비교가 됩니다 생체 조직과 질병으로 고립 된 소포의 유틸리티를 설정 하는 것이 중요.
이전 우리 연구소에 의해 발표 된 연구에서 명확 하 게 침전 그라디언트 풍부한 작은 소포의 정화에 대 한 부양 기반 밀도 기울기의 이점을 설명 합니다. 본질적으로, 부 력 기반 분리의 분수를 통해 오염 마이그레이션 방지 하 여 소포의 정화를 향상 .......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
저자는 박사 리처드 Nowakowski와 플로리다 주립 대학 실험실 동물의 리소스를 제공 하 고 정중 하 게이 프로토콜을 개발 하는 데 사용 하는 동물에 대 한 배려 감사 합니다. 우리는 다운스트림 소포 특성 뿐만 아니라 FSU 생물 과학 이미징 리소스 시설 사용 질량 분석 작업과 쌰 Liu, 박사 Rakesh 싱, 그리고 지원에 대 한 플로리다 주립 대학 변환 과학 연구소 감사 이 연구에서 전송 전자 현미경의 사용. 마지막으로, 우리는이 방법의 개발에 사용 되는 종양 견본의 기부에 대 한 박사 Mandip Sachdeva (플로리다 A & M 대학) 감사 합니다. 이 연구는 플로리다 학과의 건강에 드와 델 무어 Alzheimer의 질병 연구 프로그램에서 D.G.M. 및 J.M.O (6AZ11)와 보너스 번호 아래 국립 보건원의 국립 암 연구소 수 여 교부 금에 의해 지원 되었다 R01CA204621 D.G.M.에 게 수 여
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.45 & 마이크로; m 필터 | VWR | 28145-505 | |
| 12 mL 초원심분리기 튜브 | Beckman Coulter | 331372 | |
| 5.5 mL 초원심분리기 튜브 | Beckman Coulter | 344057 | |
| anti-Alix 항체 | Santa Cruz | sc-7129 | |
| anti-Calnexin 항체 | Santa Cruz | sc-11397 | |
| anti-CD63 항체 | Abcam | ab59479 | |
| CD81 항체 | Santa Cruz | sc-9158 | |
| Flotillin 2, 항체 | , Santa Cruz | sc-25507 | |
| HSC70 항체 | Santa Cruz | sc-7298 | |
| Syntenin-1 항체 | Santa Cruz | sc-100336 | |
| TSG101 항체 | Santa Cruz | sc-7964 | |
| EZQ 단백질 수량화 키트 | ThermoFisher Scientific | R33200 | |
| FA-45-6-30 로터 | Eppendorf | 5820715006 | |
| FEI CM120 전자 현미경 | TSS 현미경 | ||
| 염소 anti-rabbit IgG (Fab fragment) | Genetex | 27171 | |
| HALT phosphatase inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78420 | |
| HALT protease inhibitor (100x solution) | ThermoFisher Scientific | 78438 | |
| Hibernate E medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| MLS-50 스윙 버킷 로터 | Beckman Coulter | 367280 | |
| NanoSight LM10 | Malvern | ||
| Optima MAX-XP 벤치탑 초원심분리기 | 벡크만쿨터 | 393315 | |
| 옵티마 XE-100 초원심분리기 | 벡크만쿨터 | A94516 | |
| 옵티프렙 | 시그마 | D1556 | 60% 요오딕산올 멸균수 용액 |
| Q Exactive HF 질량분석기 | ThermoFisher Scientific | ||
| 토끼 안티 염소 IgG | Genetex | 26741 | |
| 토끼 안티 마우스 IgG | Genetex | 26728 | |
| Refracto 30PX (굴절계) | Mettler Toledo | 51324650 | |
| S-4-104 로터 | Eppendorf | 5820759003 | |
| SW 41 Ti 스윙 버킷 로터 | Beckman Coulter | 333790 | |
| Tabletop 5804R centrifuge | Eppendorf | 22623508 |
참고문헌
- Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses. Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).
- Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology.
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