제시 된 방법은 감자의 분리 된 잎에 만두카 sexta 애벌레의 응용 프로그램을 통해 자연 초식 동물 손상된 식물 조직을 만듭니다. 식물 조직은 곤충 허브에 대한 초기 반응에 관여하는 6개의 전사 인자 호몰로그의 발현을 위해 분석된다.
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방법 논문
분리 된 잎 어설아는 곤충 만두카 sexta를 츄잉에 의해 감염 하는 동안 감자에 유전자 발현 연구를 단순화 하기 위해
이 논문에서
요약
초록
곤충 초본의 유전자 발현 연구의 다영양 성질은 많은 수의 생물학적 복제본을 요구하며, 더 간단하고 능률적인 허브 프로토콜에 대한 필요성을 만듭니다. 츄잉 곤충의 교란은 일반적으로 전체 식물 시스템에서 연구된다. 이 전체 유기체 전략이 대중적이지만, 유사한 관찰이 단일 분리 된 잎에서 복제 될 수 있다면 필요하지 않습니다. 가정은 신호 변환에 필요한 기본 요소가 리프 자체 내에 존재한다는 것입니다. 신호 전달에 있는 초기 사건의 경우에, 세포는 섭동으로부터 신호를 수신하고 유전자 발현을 위해 분석되는 이웃 세포에 그 신호를 전송하기 만 하면 됩니다.
제안 된 방법은 단순히 분리의 타이밍을 변경합니다. 전체 식물 실험에서, 애벌레는 결국 식물에서 분리 되고 유전자 발현을 위해 분석되는 단 하나 잎에 수감됩니다. 절제의 순서가 반전되면, 전체 식물 연구에서 마지막에서, 분리 된 연구에서 첫 번째로, 공급 실험이 단순화됩니다.
솔라눔 튜트로섬 var. 케네벡은 간단한 조직 배양 배지에서 절달 전달에 의해 전파되고 원하는 경우 추가 성장을 위해 토양으로 옮겨질 수 있다. 잎은 모 공장에서 절제되어 페트리 접시로 옮겨져 먹이 분석이 M. sexta의애벌레 단계로 수행됩니다. 손상된 잎 조직은 신호 환전에서 비교적 초기 사건의 발현을 위해 분석된다. 유전자 발현 분석은 감염 특이적 Cys2-His2(C2H2) 전사 인자를 확인하, 초기 반응 연구에서 분리된 잎을 사용하는 성공을 확인하였다. 이 방법은 전체 식물 감염보다 수행하기 쉽고 적은 공간을 사용합니다.
서론
초초는 식물이 공격을 식별하고 생존을위한 적절한 반응을 탑재 할 수있는 일련의 분자 이벤트를 움직입니다. 식물은 곤충을 먹어도 두 가지 기본 단서를 받습니다. 하나는 조직에 물리적 인 손상에서 다른 하나는 곤충 특정 물질에서. 손상 관련 분자 패턴(DAMPs)은 애벌레 입부분에 의해 생성된 손상에 반응하여 방출되고 호르몬 자스몬산 및 방어 유전자의 전사증가를 초래하는 잘 정의된 상처 반응을 유발한다1. 가장 잘 알려진 DAMPs 중 하나는 체계인이며, 잎이 상처입은 후 더 큰 프로젠틴단백질의 절단에 의해 형성되는 폴리펩티드는 2,3. 자스몬산 상처 반응은 애벌레 타액, 장 내 분당 (역류제) 및 대변 (frass)에서 유래 될 수있는 허브 관련 분자 패턴 (HAMPs)에 의해 더욱 변조된다. 곤충은 이러한 물질을 사용하여 방어 반응을 향상시거나 회피합니다5. 전사 인자는 다운스트림 방어 유전자 6,7,8의<....
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프로토콜
참고: 다음 프로토콜은 한 사람이 설정하고 관찰하고 샘플을 수집할 수 있도록 설계되었습니다. 생물학적 복제를 증가시키기 위해 동일한 설정의 다중 실행이 결합될 수 있다. 실험의 추가 반복은 유전자 발현에 가능한 일주 영향을 제거하기 위해 하루 중 동시에 설정되어야합니다. 이 프로토콜은 5개의 개별 수확 시간 지점에 대해 3개의 '감염된' 잎을 생성하도록 설계되었습니다. 각 시점마다 일치하는 컨트롤 잎은 총 30개의 샘플을 만듭니다. 실험은 다양한 잎 크기 및 애벌레 단계로 수행 될 수 있지만 잎 크기, 애벌레 단계 및 감염 시간은 절차 전반에 걸쳐 일관되게하는 것이 좋습니다.
1. 감자 식물의 준비
참고 : 멸균 기술을 필요로하는 모든 단계는 조직 배양 후드18,19에서수행해야합니다.
- 베플랜트 소스에서 케네벡 식물을 준비합니다.
- 전파 매체를 준비합니다.
- 비타민 파우더를 함유한 무라시게와 스쿠그(MS) 4.43 g, 자당 20g, 한천 대체물 2g을 스핀바가 있는 2L 플라스크에 역삼투(RO) 정제수 1L에 넣습니다. 플라스크를 저어접시에 옮기고....
- 전파 매체를 준비합니다.
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결과
리프 소비는 프로토콜의 성공을 정의합니다. 건강하고 정확하게 준비된 유충은 잎 표면에 배치 한 직후에 먹이를 시작해야하며 수유는 감염 시간 내내 상당히 일관된 방식으로 계속되어야합니다. 비디오1에서, 상단의 애벌레는 배치 직후에 먹기 시작하고 먹이를 주는 동안 일관된 속도를 유지한다. 이것은 감염 후에 초기 유전자 발현 사건을 계산하는 경우에 특히 중요합니다. 하단의 유충은 잎 물질을 소비하지 않았으며 실패한 감염의 예입니다.
잎 소비 중 시각적 근사치를 모니터링하여 충분한 손상이 발생하도록 합니다. 소비된 잎 재료의 양은 감염 전후의 나뭇잎 이미지를 사용하여 손상의 백분율로 계산할 수 있습니다. 도 2는 상이한 유형의 감자 식물에 대한 M. sexta 유충의 상이.......
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토론
기존의 전체 식물 약초 방법론의 사용은이 특정 연구의 목표를 달성하기 위해 불필요합니다 (즉, 감염에 대한 반응을위한 후보 유전자세트를 스크리브). 분리 된 잎 정제의 명백한 장점은 허브 분석 을 수행하는 데 걸리는 시간을 단축하는 것입니다. 클립 케이지가있는 전체 식물의 다루기 힘든 특성이 제거되고 2 주 어린 식물이 잎을 수확하는 데 사용할 수 있기 때문에 더 빨리 수행됩니다. 또한 수유 시 훨씬 더 작은 설치 공간과 적은 성장 챔버 공간이 필요합니다. 이러한 리소스가 제한될 때 모두 중요합니다.
이 분석의 한계, 즉 분리는 방어 유전자 발현이 분석될 때 발생합니다. 분리 자체는 상처 반응을 일으키고 따라서 분리가 방어 유전자 발현의 기저 수준에 어떤 영향을 미치는지 평가하는 것이 중요합니다. 모의 허브를 포함 한 연구에서, 잘 알려진 방어 유전자 프로테아제 억제제 II의 성적 증명서 수준(PIN2)때문에 가능성이 분리 감자 잎의 제어 잎에서 예기치 않게 높았.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
저자는 이 연구에 사용된 곤충을 제공하고 애벌레 준비에 있는 그들의 전문지식에 대한 밥 패러와 알렉시스 공원에 감사하고 싶습니다. 원고의 비판적 검토에 대한 마이클 블랙번과 Saikat 고쉬에 추가 감사.
이 출판물의 상품명 또는 상업용 제품에 대한 언급은 특정 정보를 제공하기 위한 목적으로만 사용되며 미국 농무부의 추천 또는 보증을 의미하지 않습니다.
USDA는 평등한 기회 제공자 이자 고용주입니다.
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참고문헌
- Choi, H. W., Klessig, D. F. DAMPs, MAMPs, and NAMPS in plant innate immunity. BMC Plant Biology. 16, 1-10 (2016).
- Pearce, G., Strydom, D., Johnson, S., Ryan, C. A. A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins. Science.
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재인쇄 및 허가
