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방법 논문

인간의 DNA 시퀀스에 바인딩 전사 요소를 식별 하기 위해 향상 된 효 모 한 하이브리드 화면

8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/59192

⸱

2019년 2월 11일

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Boston University, 2Bioinformatics Program, Boston University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기, 우리는 향상 된 효 모 프로토콜 식별 관심 인간의 DNA 영역을 바인딩할 수 있는 녹음 방송 요인 (TFs)을 심사 한 하이브리드 제시. 이 메서드 사용 하 여 높은 처리량 검열 파이프라인의 바인딩 심문 수입니다 > 1000 TFs 단일 실험에서.

초록

각 인간의 유전자를 조절 하는 전사 인자 (TFs)의 집합을 확인 하는 것은 수많은 실험과 전산 접근을 통합 발굴 작업입니다. 하나 이러한 방법은 효 모 한 하이브리드 (Y1H) 분석 결과, TFs와 DNA 사이 어떤 상호 작용 지역 리포터 유전자를 사용 하 여 효 모 핵의 환경에서 테스트 합니다. 두 가지 구성 요소를 포함 하는 Y1H 분석 실험:는 ' DNA-미끼 ' (예., 발기인, 증강, 달 았 죠, 등)와 ' TF-먹이,' 취재 원 유전자 활성화에 대 한 상영 될 수 있는. Y1H 스크린을 수행 하기 위한 가장 게시 프로토콜 DNA 미끼 효 모 종자로 TF 먹이 라이브러리 또는 배열 변환 기반으로 합니다. 여기, 우리는 파이프라인 기술, 향상 된 Y1H 이라고 (eY1H) 분석 실험, TF DNA 상호 작용 고밀도 어레이 사용 하 여 TF 먹이 긴장의 기준점과 컬렉션으로 DNA 미끼 긴장 짝짓기에 의해 심문 하는 1536에서 심사를 허용 (HDA) 로봇 플랫폼 식민지 형식입니다. 이로써 처리량의 극적인 증가 (60 DNA 미끼 시퀀스에 대 한 > 1000 TFs 연구원 당 2 주 소요) 및 재현성. 우리는 스크린 및 그들을 해결 하는 방법 하는 동안 발생할 수 있는 문제의 예제로 서 1,086 인간의 TFs의 배열에 대 한 인간의 발기인 시퀀스를 테스트 하 여 예상된 결과의 종류를 설명 합니다.

서론

생물 의학 분야에서 주요 문제는 각 인간의 유전자는 규제 메커니즘을 결정 하 고. 전사 유전자 식 수준을 제어 하는 첫 번째 단계 이며 고유한 각 유전자 녹음 방송 요인 (TFs)의 세트에 의해 통제 된다. 그 인 간에 대 한 인코딩 > 1500 TFs1,2, 각 유전자의 표현을 제어 하는 TFs의 완전 한 세트를 식별 오픈 도전 남아 있다.

두 가지 유형의 방법 TF DNA 상호 작용 지도를 사용할 수 있습니다: TF를 중심으로 하 고 DNA를 중심으로 방법3 (그림 1A). TF를 중심으로 방법에 관심의 TF genomic DNA 영역 또는 그것의 DNA 의무적인 특이성을 결정 하는 바인딩에 대 한 조사입니다. 이 방법은 높은 처리량 시퀀싱, 단백질 바인딩 microarrays 그리고 SELEX4,,56다음 chromatin immunoprecipitation (칩)를 포함 합니다. DNA 중심 방법에 관심사의 DNA 순서 DNA 시퀀스에 바인딩할 TFs의 세트를 결정 하기 위해 시험 되 다. 이러한 방법 중 가장 널리 적용 되는 효 모 한 하이브리드 (Y1H) 분석 실험, TFs와 DNA 사이 어떤 상호 작용 지역 리포터 유전자7,,89를 사용 하 여 효 모 핵의 환경에서 테스트.

두 가지 구성 요소를 포함 하는 Y1H 분석 실험:는 ' DNA-미끼 ' (예를 들면, 발기인, 증강, 달 았 죠, 등)와 ' TF-먹이,' 취재 원 유전자 활성화9,10 (그림 1B)에 상영 될 수 있는. DNA-미끼를 업스트림 복제 두 기자의 유전자 (LacZ HIS3)와 두 DNA bait::reporter 구조는 chromatinized 'DNA-미끼 긴장'을 생성 하는 효 모 게놈으로 통합 TF-먹이, TF Gal4 TF, 효 모의 활성화 도메인 (AD) 융합을 표현 하는 플라스 미드에 인코딩된 TF DNA 상호 작용에 대 한 물고기 미끼 DNA 스트레인에 소개 된다. TF-먹이 미끼 DNA 시퀀스에 바인딩하는 경우 TF 먹이 광고 두 리포터 유전자의 활성화로 끌 것입니다. 결과적으로 긍정적인 상호 작용으로 세포 성장 판 히스티딘, 부족으로 극복 하 고 경쟁력 있는 억제제, 3-아미노-1,2,4-triazole (3-AT)에 대해 선택 하 고 X-여자의 블루 식민지로 시각 수 수 있습니다. 때문에 강력한 효 모 Gal4 광고 사용, Y1H 분석 transcriptional 활성 제 뿐만 아니라 repressors를 포함 하는 상호 작용을 검색할 수 있습니다. 더하여, TF 먹이 강한 효 모 발기인 (ADH1)에서 표현, 그 상호 작용 수치가 낮은 생 식, 도전 칩11,12로 감지 하는 TFs에도 감지할 수 있습니다.

Y1H 분석 실험을 수행 하기 위한 가장 게시 프로토콜 다음 선택, 식민지, 및 상호 작용 TF를 식별 하는 시퀀스 또는 풀링된 TF 먹이 라이브러리를 변환 하 여 효 모 DNA 미끼 종자에 TF-먹이 도입 기반 개별 변형 복제8,9. 이들은 시간이 걸리는 프로토콜, 연구원 당 테스트할 수 있는 DNA 시퀀스의 수를 제한 합니다. Y1H 분석 실험, 이라는의 최근 개선 향상 Y1H (eY1H), 극적으로 각각 표현 하는 다른 효 모 종자의 컬렉션으로 효 모 DNA 미끼 종자 짝 고밀도 배열 (HDA) 로봇 플랫폼을 사용 하 여 심사 처리량을 증가 했다 TF-먹이10,13 (그림 1C). 이 화면만 세 접시를 사용 하 여 quadruplicate에서 가장 인간의 TFs를 테스트 수 있도록 1,536 식민지 형식을 사용 합니다. 또한, TF DNA 상호 작용 없음을 방식 테스트는이 이렇게 상호 작용 (예: 2 개의 noncoding 단일 뉴클레오티드 이체) DNA 미끼 및 다른 TFs 비교에 대 한 허용 또는 TF 변종11,12 ,14.

EY1H 분석 실험을 사용 하 여, 우리는 구분 된 큰 인간, 꼬마 선 충 DNA를 중심으로 TF-DNA 상호 작용 네트워크 최신. 특히, 우리는 246 인간의 발달 강화 및 283 TFs12사이의 2230 상호 작용을 확인 했습니다. 또한, 우리 eY1H 분석 실험 변경된 TF 바인딩을 109 단일 뉴클레오티드 noncoding 변종 발달 기형, 암, 신경 질환 등 유전 질병와 관련 된 폭로를 고용 했다. 더 최근에, 사용 eY1H을 2576 C. 선 충 유전자 발기인 및 366 TFs11사이 21,714 상호 작용으로 구성 된 네트워크를 나타냅니다. 이 네트워크는 수십 선 충 C. TFs의 기능 역할을 밝히기 위해 쓸모 있었다.

DNA-미끼 얼룩을 생성 하 고 배경 기자 활동의 수준을 평가 프로토콜 되었습니다 다른15,,1617보고. 여기는 1,086 인간의 TFs의 배열에 대 한 모든 인간 게놈 DNA 영역을 화면에 사용할 수 있는 eY1H 파이프라인에 설명 합니다. 효 모 DNA 미끼 변형 생성 되 고 TF 먹이 배열의 해당 접시에 발견, 일단 전체 프로토콜 2 주 (표 1)에서 수행할 수 있습니다. 더 중요 한 것은, 프로토콜 단일 연구원 60 DNA 미끼 시퀀스를 동시에 화면 수 있도록 병렬화 할 수 있습니다. 프로토콜을 설명 하기 위해 우리는 CCL15와 IL17F 두 cytokine 유전자의 발기인 상영. 또한, 우리는 종류의 eY1H 분석 실험 및 그들을 해결 하는 방법을 수행할 때 발생할 수 있는 문제를 설명 하기 위해 실패 한 화면에서 결과 보여줍니다.

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프로토콜

1입니다. 준비

  1. Sc −U −H 플레이트 (150 mm 페 트리 접시)
    참고: 이 접시는 성장 DNA 미끼 효 모 종자에 대 한 사용 됩니다.
    1. 드롭 아웃 믹스, 효 모 질소 기지 (YNB), 아데닌 hemisulfate와 물, 그리고 pH 5 M NaOH (약 미디어의 리터 당 1 mL, 구성에 대 한 표 2 참조)와 5.9의 920 mL에 황산 암모늄을 디졸브. 2 L 플라스 크에 부 어와 볶음 바 추가.
    2. 두 번째 2 L 플라스 크에 950 mL의 물에는 agar 추가 (추가 하지 않으면 저 어 바는 압력솥에 끓여 한 천 발생할 것입니다).
    3. 고압 액체 사이클에 15 psi에서 40 분.
    4. 즉시 플라스 크를 포함 한 천으로 저 어 바를 포함 하 여 첫 번째 플라스 크의 내용을 붓는 다. 포도 당, 추가 잘 저 어 접시에 섞어 고 물 욕조에 55 ° C에 냉각.
    5. 언론에는 신 고는 트립토판을 추가 합니다. 잘 저 어 접시에 혼합 하 고 150 m m 멸 균 페 트리 접시 (접시 당 ~ 80 mL)에 부 어. 실 온에서 3-5 일 동안 건조, 비닐 봉투에서 포장 하 고 최대 6 개월 동안 상 온에서 저장.
  2. YAPD 직사각형 플레이트
    참고: 이 접시는 DNA 미끼 스트레인 및 TF 배열 컬렉션 짝짓기 잔디 성장에 대 한 사용 됩니다.
    1. 분말 (구성 표 3 참조), 한 천, 제외 2 L 플라스 크에 물 950 mL에 녹이 고 저 어 바 추가.
    2. 두 번째 2 L 플라스 크에 950 mL의 물에는 agar 추가 (추가 하지 않으면 저 어 바는 압력솥에 끓여 한 천 발생할 것입니다).
    3. 고압 액체 사이클에 15 psi에서 40 분.
    4. 즉시 플라스 크를 포함 한 천으로 저 어 바를 포함 하 여 첫 번째 플라스 크의 내용을 붓는 다.
    5. 포도 당, 추가 믹스 잘 저 어 접시와 멋진 55 ° c 직사각형 접시에 미디어를 붓고 ( 재료의 표를참조; 접시 당 ~ 70 mL) 연동 펌프 (5 mL/sec)와 6 mm 튜브를 사용 하 여. 실 온에서 1 일 건조 비닐 봉지에 포장 하 고 최대 6 개월까지 콜드 룸에 있는 저장.
      참고: 비록 제안 된 미디어 볼륨은 접시 당 70 mL, 접시 당 50-80 mL 사용할 수 있습니다. 고려 때 붓는 접시 1에 3 개의 중요 한 문제) 그들은 한 미디어는 접시에 걸쳐 동일한 두께 파괴는 (격판덮개 쏟아져 대 한 수준별된 테이블 또는 표면 사용 하 고 이상 7 접시의 부 어 하지 않습니다) 2)는 agar에 거품의 부재를 보장 하기 위해 미디어 (거품 해야 될 팝 무 균 바늘을 사용 하 여), 및 3)만 하루 동안 접시를 건조 하 고 번호판을 고정 하는 효 모에 실패를 피하기 위해 비닐 봉지에 포장.
  3. Sc −Trp 및 Sc −U −Trp 직사각형 플레이트
    참고: 이 접시는 TF 배열 컬렉션 (Sc −Trp) 성장 (Sc −U −Trp) 짝짓기 후 2 중 누 룩을 선택 하 고 사용 됩니다.
    1. 드롭 아웃 믹스, YNB, 아데닌 hemisulfate, 그리고 물, 그리고 5.9 NaOH 5 M (미디어의 리터 당 약 1 mL)와 pH의 920 mL에 황산 암모늄 분해 (구성 표 4 참조). 2 L 플라스 크에 부 어와 볶음 바 추가.
    2. 두 번째 2 L 플라스 크에 950 mL의 물에는 agar 추가 (추가 하지 않으면 저 어 바는 압력솥에 끓여 한 천 발생할 것입니다).
    3. 고압 액체 사이클에 15 psi에서 40 분.
    4. 즉시 플라스 크를 포함 한 천으로 저 어 바를 포함 하 여 첫 번째 플라스 크의 내용을 붓는 다. 포도 당, 추가 잘 저 어 접시에, 혼합 하 고 55 ° c에 냉각
    5. 추가 신, 히스티딘, uracil (Sc −U −Trp 격판덮개 uracil 생략).
    6. 잘 저 어 접시에 혼합 및 직사각형 플레이트 (접시 당 ~ 70 mL)에 부 어 연동 펌프 (5 mL/sec)와 6 m m 튜브를 사용 하 여. 건조 한 실내 온도에 1 일, 비닐 봉투, 접시 포장 및 최대 3 개월까지 콜드 룸에 있는 저장.
  4. Sc −U −H −Trp + 3AT + X gal 직사각형 플레이트
    참고:     이 번호판 eY1H 분석 실험에 대 한 판독 판으로 사용 됩니다.
    1. 드롭 아웃 믹스, YNB, 아데닌 hemisulfate, 및 물의 850 mL에 황산 암모늄 분해 (구성 표 5 참조). 전화 하지 마십시오. 2 L 플라스 크에 부 어와 볶음 바 추가.
    2. 두 번째 2 L 플라스 크에 850 mL의 물에는 agar 추가 (추가 하지 않으면 저 어 바는 압력솥에 끓여 한 천 발생할 것입니다).
    3. 고압 액체 사이클에 15 psi에서 40 분.
    4. 물 900 mL, 나2HPO4∙7H2O, 70 g, NaH2포4∙H2볶음 막대를 사용 하 여 분말을 녹이 고 5 M NaOH를 사용 하 여 7.0에 pH를 조정 하는 오 믹스의 34.5 g 결합 하 여 배 부 소금 (1 리터)를 준비 합니다. 물을 1 리터와 오토 클레이 브를 추가 합니다.
    5. 포함 하는 디 메 틸 formamide의 42.5 mL 50 mL 플라스틱 튜브에 X-여자 분말의 3.5 g를 추가 하 여 gal X 솔루션을 준비 합니다. 더 쉽게 분해 하 디 메 틸 formamide X 여자 분말 추가 (이 분 소요). (사용 불투명 50 ml 튜브 또는 호 일에 커버) 어둠 속에서 재고 솔루션을 유지. -20 ° c.에 게
    6. 즉시 플라스 크를 포함 한 천으로 저 어 바를 포함 하 여 첫 번째 플라스 크의 내용을 붓는 다. 포도 당 추가 10 부 소금 (조성 표 5 참조), 배 잘 저 어 접시에, 혼합 그리고 55 ° c에 냉각
    7. 신, 3AT, 및 X-여자 (구성에 대 한 표 5 를 참조)를 추가 합니다.
    8. 잘 저 어 접시에 혼합 및 직사각형 플레이트 (접시 당 ~ 70 mL)에 부 어 연동 펌프 (5 mL/sec)와 6 mm 튜브를 사용 하 여. 실 온에서 1 일 건조, 비닐 봉투에서 포장 및 알루미늄 호 일에 덮여 추운 방에 저장 (3AT 및 X-여자는 빛에 민감한) 최대 1 개월.

2. 안보 TF 배열

  1. TF-먹이 배열 녹고
    1. 얼음에 TF 먹이 배열 효 모 글리세롤 주식 접시 녹여
      참고: 이전에 게시10,12,,1318TF 먹이 어레이 생성할 수 있습니다.
    2. 다음 단계는 전에 1-3 분 이내 12 채널 피 펫을 사용 하 여 효 모 resuspend
  2. 직사각형 플레이트 Sc −Trp에 누 룩을 보 이나
    1. HDA 로봇에서 소스, 대상, 그리고 96 긴 핀 패드 96 한 천 배지 ( 재료의 표참조) 선택 다 잘 96 접시.
      참고: 핀 패드는 재사용 하지 않으며 무시 해야 합니다.
    2. 96 잘 접시 당 두 개의 복사본을 만들기 위해 많은 복제 프로그램을 선택 합니다. 사용 하는 재활용 하거나 냉동 주식 다시 오염을 방지 하는 옵션을 다시 마십시오.
    3. 누 룩을 섞어 소스에 아래로 소용돌이를 옵션을 선택 합니다.
    4. 가방 발견된 배열 하 고 2-3 일 동안 30 ° C에서 최대 천-사이드를 품 어.
  3. 사우스 캐롤라이나 −Trp 직사각형 접시에 384 식민지 배열 생성
    1. 로봇에서 소스, 대상, 384 천 배지 및 96 짧은 핀 패드 96 한 천 배지를 선택 합니다.
    2. 1:4 배열 프로그램을 선택 합니다. 이 방법에서는, 4 96 식민지 접시 (각 포함 하는 다른 TF) 한 384 식민지 접시로 통합 됩니다. 재활용을 사용 하 여 또는 다른 판 사이의 오염을 방지 하는 옵션을 다시 방문 하지.
    3. 판 가방 하 고 2 일 동안 30 ° C에서 최대 발견된 384-식민지 배열 한 사이드를 품 어.
  4. 사우스 캐롤라이나 −Trp 직사각형 플레이트에서 1,536 식민지 배열 생성
    참고: 이 각 TF 먹이 대 한 4 개의 식민지를 포함 하는 배열 발생 합니다.
    1. 로봇에서 소스, 대상,으로 1,536 한 천 배지 및 384 짧은 핀 패드 384 한 천 배지를 선택 합니다.
    2. 1:4 분석 결과 단일 소스 프로그램을 선택 합니다. 목표는 quadruplicates를 4 개의 식민지 각 식민지를 복사 하는 것입니다. 재활용을 사용 하 고 그것은 복사 4 번 각 식민지 수반으로 옵션을 다시.
    3. 판 가방 하 고 3 일 동안 30 ° C에서 최대 발견된 1536-식민지 배열 한 사이드를 품 어.
  5. 사우스 캐롤라이나 −Trp 직사각형 접시에 1,536 식민지 배열 증폭
    1. 로봇에서 소스, 대상,으로 1,536 한 천 배지 및 1,536 짧은 핀 패드 1,536 한 천 배지를 선택 합니다.
    2. 3-4 부 복제 복제 많은 프로그램을 선택 합니다. 재활용을 사용 하 여 옵션을 다시 하지만 교차 오염을 피하기 위하여 배열의 다른 접시에 전환할 때 패드에 밖으로 던져.
    3. 판 가방 하 고 짝짓기 단계 (아래 참조) 사용 하 여 3 일 동안 30 ° C에서 최대 발견된 1536-식민지 배열 한 측을 품 어. 그 후, 심사의 새로운 라운드에 대 한 일 후에 다시 사용 실내 온도 복사에서 번호판을 유지.

3. eY1H 화면

  1. DNA-미끼 스트레인 잔디 짝짓기에 대 한 준비
    1. 효 모 DNA 미끼 긴장 Sc −U −H 접시에 고 30 ° c.에 3 일 동안 성장
    2. 각 접시 12-16 다른 긴장에 맞도록 15 cm 살 균 이쑤시개를 사용 하 여 Sc −U −H 플레이트에 누 룩을 행진. 1 일 30 ° c.에 품 어
    3. 각 접시에 맞도록 4 가지 변종이 Sc −U −H 플레이트 메 마른이 쑤 시 게를 사용 하 여 15 cm에 누 룩을 행진. 30 ° c.에 1 일 동안 품 어
    4. 효 모 살 균 이쑤시개, 어떤 agar를 긁 고 살 균 물의 500 µ L 1.5 튜브에 추가 하지 않도록 만들기를 사용 하 여 다쳤어요.
    5. 10-15 불 임 유리 구슬 YAPD 사각형 접시에 추가 합니다. 접시에 효 모 현 탁 액을 추가 하 고 누 룩 모든 격판덮개를 통해 서 전염 됩니다 보장 하기 위해 1 분에 대 한 모든 방향에서 철저 하 게 흔들어.
    6. 접시를 즉시 반전 하 고 뚜껑에 비즈가 되도록 누릅니다. 제거 하 고 구슬을 재활용.
    7. 판 가방 및 30 ° c.에 1-2 일 동안 아래로 천 쪽을 품 어 다음 짝짓기 단계를 진행 합니다.
  2. 효 모 DNA 미끼 및 TF 배열 긴장의 짝짓기
    1. 로봇으로 TF 배열 YAPD 직사각형 접시에 전송. 소스 및 대상 및 1,536 짧은 핀 패드 1,536 한 천 배지를 선택 합니다. 많은 복제 프로그램을 선택 합니다. 각 TF 배열 판 (배열에 있는 접시의 수)에 따라 3-4 YAPD 번호판을 사용할 수 있습니다. 짝짓기에 사용 되는 TF 배열 접시 2-3 일 하지만 짝짓기로 더 효율적일 수 있습니다.
    2. 이미 로봇 TF 배열을 포함 하는 YAPD 번호판 DNA 미끼 스트레인의 잔디를 전송 합니다. 소스 및 대상 및 1,536 짧은 핀 패드 1,536 한 천 배지를 선택 합니다. 많은 복제 프로그램을 선택 합니다. ~0.6 밀리미터의 반경으로 소스에서 임의 오프셋을 사용 하 여 같은 자리에서 효를 복용 하지 않도록 하 고 효 모 종자 사이 접촉을 촉진 하기 위하여 목표에 혼합. DNA 미끼 긴장 (3.1 단원)를 포함 하는 소스로, 잔디를 사용 하 고 TF 배열을 포함 하는 YAPD 접시 단계 대상으로 3.2.1에서에서 발견.
    3. 판 가방 하 고 1 일 30 ° C에서 최대 천-사이드를 품 어.
  3. 선택 2 중 효
    1. 로봇으로 YAPD 격판덮개에서 Sc −U −Trp 플레이트 성관계 누 룩을 전송. 소스 및 대상 및 1,536 짧은 핀 패드 1,536 한 천 배지를 선택 합니다. 복제 프로그램을 선택 합니다. 대상 및 소스에 섞는다.
    2. 판 가방 하 고 (더 이상 외피 리드 높은 배경 기자 활동) 2-3 일 동안 30 ° C에서 최대 천-사이드를 품 어.
  4. 판독 판 전송
    1. 전송 2 중 효 모 Sc −U −Trp 판에서 판독 직사각형 접시 Sc −U −H −Trp + 5mm 3AT + 0.4 m m X-여자 로봇을 사용 하 여. 소스 및 대상 및 1,536 짧은 핀 패드 1,536 한 천 배지를 선택 합니다. 복제 프로그램을 선택 합니다.
    2. 판 가방 하 고 최대 7 일 동안 30 ° C에서 최대 천-사이드를 품 어.
  5. 판독 판 영상
    1. DNA-미끼 긴장 높은 배경 기자 활동, 2, 3, 4 일에 사진을 걸릴. 그렇지 않으면, 4 및 7 일에서 사진을 찍을. 긍정적인 상호 작용 효 모 식민지의 성장 및 파랑 색으로 식별 하 고 수동으로 결정 될 수 있다, 또는 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 확인할 수 있습니다.

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결과

때 eY1H 분석 실험에서 결과 분석 세 가지 주요 요소를 고려 한다: DNA-미끼 긴장의 배경 기자 활동, TF DNA 상호 작용, 및 긍정적인 식민지의 수에 해당 하는 기자 활동의 강도. DNA-미끼 긴장의 배경 기자 활동 (즉, autoactivity) 전반적인 성장 및 판독 접시 TF 먹이의 부재에도 효 모 식민지의 색상을 말합니다. 이상적으로, 비 autoactive 긴장 표시 배경 흰색 또는 밝은 갈색 색상, 긍정적인 상호 작용에 대 한 식민지 되는 크고 푸른. Autoactive DNA-미끼 종자 미디어 히스티딘과 DNA 미끼8효 모 transcriptional 활성의 바인딩 관련 가능성이 있는 접시에 있는 모든 식민지에 대 한 X-여자의 파란색에에서 효 모 성장을 보여줍니다. 기자 활동 감지 TF DNA 상호 작용에 해당 (즉, 식민지의 크기) 및 파란색의 강도 강도 선호도, 효 모에 TF 식 수준, 바인딩 사이트 및 거리의 수 많은 매개 변수에 따라 달라 집니다. 효 모...

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토론

로봇 eY1H 짝짓기 심사 방법은 크게 여기에 설명 된 이전 라이브러리 심사에 비해 관심의 기준점과 심사 방식 변화에 따라 DNA 영역에 바인딩되는 TFs의 집합을 식별 하려면 처리량을 증가 시킵니다. 또한, TF DNA 상호 작용 상호 작용의 90%가 감지 당 TF, 모든 4 개의 식민지에 대 한 긍정적인 테스트 및 상호 작용의 90%는 동일한 DNA 미끼 효 모 스트레인10 의 독립적인 화면에서 다시 테스트 분석 실험은 높은 재현 eY1H에 의해 감지 , 12 , 19. 더 중요 한 것은, eY1H에 의해 감지 TF DNA 상호 작용 인간 기자 분석12,20, 기본 인간 세포 (게시 되지 않은 결과), 그리고 선 충 C. 녹아웃 동물 테스트...

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공개 사항

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

감사의 글

이 작품은 건강의 국가 학회 [R35-GM128625 J.I.F.B.]에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLCSigmaA8056-100GHIS3 유전자 제품에 대한 경쟁력 있는 억제제
아데닌 설페이트(헤미설페이트), 이수화물US BiologicalsA0865적절한 효모 성장에 필요
한천 높은 젤 강도 - 세균학 등급American International ChemicalAGHGUP효모 성장을 위한 영양 매체
황산 암모늄US BiologicalsA1450합성 효모 매체의 질소
D+ 포도당 무수US BiologicalsG3050효모 성장에 필요
Drop-Out Mix 마이너스 His, Leu, Tryp 및 Uracil, 효모 질소 염기가 없는 아데닌 풍부BiologicalsD9540-02효모 성장 가장자리에 필요한 합성 완전
배지 다성분 pH 측정기Hanna InstrumentsHI2020-01선택적 매체의 pH를 측정하려면
편평한 이쑤시개 750 ct다이아몬드페트리디쉬에 효모를 줄무늬
유리 구슬 WalterStern100C만들 때 효모를 빨아들이기 위해
글리세롤 ≥ 99%Millipore SigmaG9012-1L냉동 효모 스톡을 만드는 데 필요
L-히스티딘US BiologicalsH5100선택적 배지에서 효모 성장 선택용
L-LeucineUS BiologicalsL2020-05선택적 배지에서 효모 성장 선택용
L-트립토판SigmaT-0254선택적 배지 N에서 효모 성장 선택용
, N-DimethylformamideSigma319937-1LX-gal 용액을 만들기 위해
Omnipense EliteWheatonW375030-ASinger 플레이트에 정확한 양의 매체를 분배하기 위해
펩톤, 효모 성장에 필요한American International ChemicalPEBAUP
페트리 접시, 150 mm x15 mmVWR10753-950성장 효모 미끼 스크리닝
PlusPlatesSinger InstrumentsPLU-003Singer Robot
Precision Low Temperature BOD 냉장 인큐베이터ThermoFisher ScientificPR205745R일정한 온도에서 효모 플레이트를 배양하려면
RePads 1,536 짧은Singer InstrumentsREP-005TF-먹이 어레이를 옮기고, 효모를 짝짓고, 효모를 이배체 선택 및 판독 플레이트로 옮기기 위해
RePads 384 짧은Singer InstrumentsREP-004TF-먹이 배열을 384에서 1,536 콜로니 형식으로 옮기려면
RePads 96 긴Singer InstrumentsREP-001TF-먹이 어레이를 글리세롤 스톡에서 한천 플레이트로 옮기려면
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Singer HDA RoToR 로봇Singer Instruments고처리량 방식으로 효모를 전송하는 데 사용됩니다
수산화나트륨 (펠릿/인증된 ACS)Fishers318-1선택적 매체의 pH를 조정하기 위해
인산나트륨 이염기성 헵타하이드레이트Santa Cruz Biotechnologysc-203402CX-gal에서 LacZ 리포터 활동에 필요합니다 
Sodium Phosphate monobasic monohydrateSanta Cruz Biotechnologysc-202342BX-gal의 LacZ 리포터 활동에 필요 
UracilSigmaU0750-100G선택적 매체에서 효모 성장 선택용
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside)Gold BiotechnologyX4281C100β-galactosidase는 단백질-DNA 상호 작용을 감지하기 위해 무색 X-gal 파란색으로 변합니다
모 추출물US BiologicalsY2010효모
의 성장 및 번식을 위한 영양 배지효모 질소 베이스 (분말) AA, 탄수화물 및 AS 없음 US BiologicalsY2030활발한 효모 성장에 필요
원 US 잔디밭을 세균학 단백질 소스. . 효

참고문헌

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