인간의 DNA 시퀀스에 바인딩 전사 요소를 식별 하기 위해 향상 된 효 모 한 하이브리드 화면

요약

여기, 우리는 향상 된 효 모 프로토콜 식별 관심 인간의 DNA 영역을 바인딩할 수 있는 녹음 방송 요인 (TFs)을 심사 한 하이브리드 제시. 이 메서드 사용 하 여 높은 처리량 검열 파이프라인의 바인딩 심문 수입니다 > 1000 TFs 단일 실험에서.

초록

각 인간의 유전자를 조절 하는 전사 인자 (TFs)의 집합을 확인 하는 것은 수많은 실험과 전산 접근을 통합 발굴 작업입니다. 하나 이러한 방법은 효 모 한 하이브리드 (Y1H) 분석 결과, TFs와 DNA 사이 어떤 상호 작용 지역 리포터 유전자를 사용 하 여 효 모 핵의 환경에서 테스트 합니다. 두 가지 구성 요소를 포함 하는 Y1H 분석 실험:는 ' DNA-미끼 ' (예., 발기인, 증강, 달 았 죠, 등)와 ' TF-먹이,' 취재 원 유전자 활성화에 대 한 상영 될 수 있는. Y1H 스크린을 수행 하기 위한 가장 게시 프로토콜 DNA 미끼 효 모 종자로 TF 먹이 라이브러리 또는 배열 변환 기반으로 합니다. 여기, 우리는 파이프라인 기술, 향상 된 Y1H 이라고 (eY1H) 분석 실험, TF DNA 상호 작용 고밀도 어레이 사용 하 여 TF 먹이 긴장의 기준점과 컬렉션으로 DNA 미끼 긴장 짝짓기에 의해 심문 하는 1536에서 심사를 허용 (HDA) 로봇 플랫폼 식민지 형식입니다. 이로써 처리량의 극적인 증가 (60 DNA 미끼 시퀀스에 대 한 > 1000 TFs 연구원 당 2 주 소요) 및 재현성. 우리는 스크린 및 그들을 해결 하는 방법 하는 동안 발생할 수 있는 문제의 예제로 서 1,086 인간의 TFs의 배열에 대 한 인간의 발기인 시퀀스를 테스트 하 여 예상된 결과의 종류를 설명 합니다.

서론

생물 의학 분야에서 주요 문제는 각 인간의 유전자는 규제 메커니즘을 결정 하 고. 전사 유전자 식 수준을 제어 하는 첫 번째 단계 이며 고유한 각 유전자 녹음 방송 요인 (TFs)의 세트에 의해 통제 된다. 그 인 간에 대 한 인코딩 > 1500 TFs^1,2, 각 유전자의 표현을 제어 하는 TFs의 완전 한 세트를 식별 오픈 도전 남아 있다.

두 가지 유형의 방법 TF DNA 상호 작용 지도를 사용할 수 있습니다: TF를 중심으로 하 고 DNA를 중심으로 방법³ (그림 1A). TF를 중심으로 방법에 관심의 TF genomic DNA 영역 또는 그것의 DNA 의무적인 특이성을 결정 하는 바인딩에 대 한 조사입니다. 이 방법은 높은 처리량 시퀀싱, 단백질 바인딩 microarrays 그리고 SELEX^4,,56다음 chromatin immunoprecipitation (칩)를 포함 ....

프로토콜

1입니다. 준비

1. Sc −U −H 플레이트 (150 mm 페 트리 접시)
   참고: 이 접시는 성장 DNA 미끼 효 모 종자에 대 한 사용 됩니다.
   1. 드롭 아웃 믹스, 효 모 질소 기지 (YNB), 아데닌 hemisulfate와 물, 그리고 pH 5 M NaOH (약 미디어의 리터 당 1 mL, 구성에 대 한 표 2 참조)와 5.9의 920 mL에 황산 암모늄을 디졸브. 2 L 플라스 크에 부 어와 볶음 바 추가.
   2. 두 번째 2 L 플라스 크에 950 mL의 물에는 agar 추가 (추가 하지 않으면 저 어 바는 압력솥에 끓여 한 천 발생할 것입니다).
   3. 고압 액체 사이클에 15 psi에서 40 분.
   4. 즉시 플라스 크를 포함 한 천으로 저 어 바를 포함 하 여 첫 번째 플라스 크의 내용을 붓는 다. 포도 당, 추가 잘 저 어 접시에 섞어 고 물 욕조에 55 ° C에 냉각.
   5. 언론에는 신 고는 트립토판을 추가 합니다. 잘 저 어 접시에 혼합 하 고 150 m m 멸 균 페 트리 접시 (접시 당 ~ 80 mL)에 부 어. 실 온에서 3-5 일 동안 건조, 비닐 봉투에서 포장 하 고 최대 6 개월 동안 상 ....

결과

때 eY1H 분석 실험에서 결과 분석 세 가지 주요 요소를 고려 한다: DNA-미끼 긴장의 배경 기자 활동, TF DNA 상호 작용, 및 긍정적인 식민지의 수에 해당 하는 기자 활동의 강도. DNA-미끼 긴장의 배경 기자 활동 (즉, autoactivity) 전반적인 성장 및 판독 접시 TF 먹이의 부재에도 효 모 식민지의 색상을 말합니다. 이상적으로, 비 autoactive 긴장 표시 배경 흰색 또는 밝은 갈색 색상, 긍정적인 상호 작용에 대 한 식민지 되는 크고 푸른. Autoactive DNA-미끼 종자 미디어 히스티딘과 DNA 미끼⁸효 모 transcriptional 활성의 바인딩 관련 가능성이 있는 접시에 있는 모든 식민지에 대 한 X-여자의 파란색에에서 효 모 성장을 보여줍니다. 기자 활동 감지 TF DNA 상호 작용에 해당 (즉, 식민지의 크기) 및 파란색의 강도 강도 선호도, 효 모에 TF 식 수준, 바인딩 사이트 및 거리의 수 많은 매개 변수에 따라 달라 집니다. 효 모.......

토론

로봇 eY1H 짝짓기 심사 방법은 크게 여기에 설명 된 이전 라이브러리 심사에 비해 관심의 기준점과 심사 방식 변화에 따라 DNA 영역에 바인딩되는 TFs의 집합을 식별 하려면 처리량을 증가 시킵니다. 또한, TF DNA 상호 작용 상호 작용의 90%가 감지 당 TF, 모든 4 개의 식민지에 대 한 긍정적인 테스트 및 상호 작용의 90%는 동일한 DNA 미끼 효 모 스트레인¹⁰ 의 독립적인 화면에서 다시 테스트 분석 실험은 높은 재현 eY1H에 의해 감지 ^{, 12 , 19}. 더 중요 한 것은, eY1H에 의해 감지 TF DNA 상호 작용 인간 기자 분석^12,20, 기본 인간 세포 (게시 되지 않은 결과), 그리고 선 충 C. 녹아웃 동물 테스트.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC	Sigma	A8056-100G	HIS3 유전자 제품에 대한 경쟁력 있는 억제제
아데닌 설페이트(헤미설페이트), 이수화물	US Biologicals	A0865	적절한 효모 성장에 필요
한천 높은 젤 강도 - 세균학 등급	American International Chemical	AGHGUP	효모 성장을 위한 영양 매체
황산 암모늄	US Biologicals	A1450	합성 효모 매체의 질소
D+ 포도당 무수	US Biologicals	G3050	효모 성장에 필요
Drop-Out Mix 마이너스 His, Leu, Tryp 및 Uracil, 효모 질소 염기가 없는 아데닌 풍부	Biologicals	D9540-02	효모 성장 가장자리에 필요한 합성 완전
배지 다성분 pH 측정기	Hanna Instruments	HI2020-01	선택적 매체의 pH를 측정하려면
편평한 이쑤시개 750 ct	다이아몬드		페트리디쉬에 효모를 줄무늬
유리 구슬 Walter	Stern	100C	만들 때 효모를 빨아들이기 위해
글리세롤 ≥ 99%	Millipore Sigma	G9012-1L	냉동 효모 스톡을 만드는 데 필요
L-히스티딘	US Biologicals	H5100	선택적 배지에서 효모 성장 선택용
L-Leucine	US Biologicals	L2020-05	선택적 배지에서 효모 성장 선택용
L-트립토판	Sigma	T-0254	선택적 배지 N에서 효모 성장 선택용
, N-Dimethylformamide	Sigma	319937-1L	X-gal 용액을 만들기 위해
Omnipense Elite	Wheaton	W375030-A	Singer 플레이트에 정확한 양의 매체를 분배하기 위해
펩톤, 효	모 성장에 필요한	American International Chemical	PEBAUP
페트리 접시, 150 mm x15 mm	VWR	10753-950	성장 효모 미끼 스크리닝
PlusPlates	Singer Instruments	PLU-003	Singer Robot
Precision Low Temperature BOD 냉장 인큐베이터	ThermoFisher Scientific	PR205745R	일정한 온도에서 효모 플레이트를 배양하려면
RePads 1,536 짧은	Singer Instruments	REP-005	TF-먹이 어레이를 옮기고, 효모를 짝짓고, 효모를 이배체 선택 및 판독 플레이트로 옮기기 위해
RePads 384 짧은	Singer Instruments	REP-004	TF-먹이 배열을 384에서 1,536 콜로니 형식으로 옮기려면
RePads 96 긴	Singer Instruments	REP-001	TF-먹이 어레이를 글리세롤 스톡에서 한천 플레이트로 옮기려면
RePads 96 짧은	Singer Instruments	REP-002	TF-먹이 배열을 96에서 384 콜로니 형식으로 전송하기 위해
Singer HDA RoToR 로봇	Singer Instruments		고처리량 방식으로 효모를 전송하는 데 사용됩니다
수산화나트륨 (펠릿/인증된 ACS)	Fisher	s318-1	선택적 매체의 pH를 조정하기 위해
인산나트륨 이염기성 헵타하이드레이트	Santa Cruz Biotechnology	sc-203402C	X-gal에서 LacZ 리포터 활동에 필요합니다
Sodium Phosphate monobasic monohydrate	Santa Cruz Biotechnology	sc-202342B	X-gal의 LacZ 리포터 활동에 필요
Uracil	Sigma	U0750-100G	선택적 매체에서 효모 성장 선택용
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside)	Gold Biotechnology	X4281C100	β-galactosidase는 단백질-DNA 상호 작용을 감지하기 위해 무색 X-gal 파란색으로 변합니다
모 추출물	US Biologicals	Y2010	효모
의 성장 및 번식을 위한 영양 배지효모 질소 베이스 (분말) AA, 탄수화물 및 AS 없음	US Biologicals	Y2030	활발한 효모 성장에 필요

원 US 잔디밭을 세균학 단백질 소스. . 효