방법 논문

생성, 증폭 및 재조합 호흡 Syncytial 바이러스의 적정

DOI:

10.3791/59218

⸱

2019년 4월 4일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UMR 1173 Institut national de la santé et de la recherche médicale (INSERM), Université de Versailles St. Quentin, 2UR892 Institut national de la recherche agronomique (INRA), Unité de virologie et immunologie moléculaires, 3Assistance Publique–Hôpitaux de Paris (AP-HP), Hôpital Ambroise Paré, Laboratoire de Microbiologie

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리를 생성 하는 방법을 설명 하 고 RSVs에 대 한 호흡 syncytial 바이러스 (RSVs)와 최적화 된 패 분석 결과 수정 유전자 증폭. 우리는 두 재조합 바이러스는 각각 RSV 복제의 정량화를 허용 하 고 라이브 RSV 포함 몸과 포함 시체 관련 된과 립 역동성의 분석을 생성 하 여이 프로토콜을 설명 합니다.

초록

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재조합 형 바이러스를 사용 하 여 기본 또는 적용 바이러스학에 중요 한 되고있다. 역 유전학 둘 다 바이러스 성 복제 메커니즘을 해독 하 고 antivirals 연구 개발 플랫폼을 제공 하는 백신에 대 한 매우 강력한 기술 될 입증 되었습니다. 그러나 건설 및 부정적인 물가 RNA 바이러스 호흡 syncytial 바이러스 (RSV)에 대 한 역방향 유전자 시스템의 조작, 섬세 한 남아 있고 특별 한 노하우를 필요로 합니다. RSV 게놈은 약 15 kb는 모두 바이러스 성 RNA 복제 및 전송에 대 한 서식 파일의 단일 스트랜드, 부정 감지 RNA 이다. 우리의 역 유전학 시스템 인간의 RSV 긴 긴장 게놈 (HRSV)의 cDNA 사본을 사용합니다. 이 cDNA, 뿐만 아니라 cDNAs 바이러스 성 단백질의 중 합 효소 복잡 한 인코딩 (L, P, N 및 m 2-1) 개별 식 벡터 T7 중 합 효소 컨트롤 시퀀스 아래에 배치 됩니다. T7 중 합 효소는 안정적으로 표현, BSR-T7/5 셀에 이러한 요소의 transfection 세포질 복제와 재조합 RSV의 전사 유전자 변형된 virions를 야 기한 있습니다. BSRT7/5의 문화 상쾌한와 세포 표면에는, 새로운 RSV 감염 바이러스 성 확대를 위한 인간 형 간염-2 셀에 수집 됩니다. 증폭의 2 개 또는 3 라운드 1 x 106 1 x 107 플 라크 형성 단위 (PFU)를 포함 하는 바이러스 성 주식을 얻기 위해 필요 / mL. 최적의 수확, 냉동, 및 바이러스 성 주식의 적정 방법 자세히 여기 설명 합니다. 우리 무료 녹색 형광 단백질 (GFP) (RSV-GFP)를 표현 하는 각각 두 개의 재조합 형 바이러스를 만들어 여기에 제시 된 프로토콜을 설명 하거나 바이러스 M2-1 융합 GFP (RSV-M2-1-GFP). 우리 RSV-GFP를 사용 하 여 계량 RSV 복제와 RSV-M2-1-GFP 비디오 현미경 검사 법 기술을 사용 하 여 살아있는 세포에서 바이러스 성 단백질 역동성 뿐 아니라 바이러스 성 구조를 시각화 하는 방법을 보여 줍니다.

서론

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인간의 RSV 유아 전세계1급성 호흡기 감염에 대 한 입원의 주요 원인입니다. 또한, RSV 성인 입원 및 사망 부담 노인2의 대부분과 인플루엔자에 비해 상당한 질병 부담으로 연결 됩니다. 있습니다 없습니다 백신 또는 특정 antivirals RSV에 대 한 약속 하지만 아직 신약 개발3,4에 있습니다. 복잡성과 RSV 곱셈의 정량화 기법의 무 거 움 antivirals 또는 현재 상당한 노력에도 불구 하 고 백신에 대 한 검색을 방해. 생체 외에서 RSV 곱셈의 정량화 분석 실험, 양적 현미경 검사 법, immunostaining, 플 라크 감소 cytopathic 효과의 분석에서 주로 구성 되어 힘 드는 시간과 비싼 방법에 따라 일반적으로 역전사 (qRT)-연쇄 반응 (PCR), 및 효소 연결 된 immunosorbent 분석 테스트. 수정 된 유전자와 같은 기자 유전자 표현 바이러스는 GFP 코딩, 같은 검 진을 위해 더 적당 한. 자동된 판 독자를 사용 하 여 결합, 기자 재조합 바이러스 유전자를 운반 할 수 있습니다 이러한 분석 표준화 및 높은 처리량을 위해 더 적당 한.

RSV는 엔벌로프된, nonsegmented 부정적인 감 RNA 바이러스 Pneumoviridae 가족, 순서 Mononegavirales5 Orthopneumovirus 속에 속하는입니다. RSV 게놈의 약 15, 지도자 및 트레일러와 인코딩 11 단백질의 transcriptional 단위 10 개 3'와 5' 말단에 noncoding 지역 포함 된 단일 스트랜드, 부정 감지 RNA 이다. 유전자는 다음과 같이 정렬 됩니다: 3'-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, m 2 (m 2-1과 m 2-2 단백질에 대 한 인코딩) 및 L-5'. 게놈 RNA는 밀접 하 게 포장 하 여 nucleoprotein 서식 파일로 사용 하는 북 아 일 하 encapsidated 게놈 RNA, 바이러스 성 RNA 의존 RNA 중 합 효소 (RdRp) 전사 및 바이러스 성 RNA의 복제를 보장 합니다. 바이러스 성 RdRp 큰 단백질 L 당 뉴클레오티드 중 합 효소 활동을 운반의 구성, 그것의 필수 공동 인자 phosphoprotein P와 바이러스 성 녹음 방송으로 하는 M2-1 단백질 요소6. 감염 된 세포에서 RSV 세포질 포함 이라고 포함 시체 (IBs)의 형성을 유도 합니다. 형태학 상으로 비슷한 세포질 포함 여러 Mononegavirales7,8,,910관찰 되었습니다. RSV 바이러스 성 RNA 합성 따라서 바이러스 성 공장8,,911, 로 간주 될 수 있는 IBs에서 발생 하는 것을 보여주었다, 에볼라 바이러스, vesicular 구내 염 바이러스 (VSV), 광견병 바이러스에 대 한 최근 연구 12. 바이러스 공장 RNA 그리고 바이러스 성 RNA 합성에 필요한 바이러스 성 단백질을 집중 하 고 또한 포함 하는 세포질 단백질13,,1415,16, 17. IBs 전시 IB 관련 된과 립 (IBAGs), 집중 하 라는 기능 subcompartment는 새로 synthetized M2-1 단백질 함께 초기 바이러스 성 mRNA. 게놈 RNA와 L, P, 그리고 N IBAGs에서 검색 되지 않습니다. IBAGs는 액체 세포12의 속성을 전시 하는 IBs 안에 작은 동적 구형 구조. IBs 중앙 역할 바이러스 곱셈에 불구 하 고 아주 작은 자연, 내부 구조, 형성, 및이 바이러스 성 공장 운영에 대 한 알려져 있다.

한 cDNA에서 소아마비의 게놈의 식 198118첫 번째 전염 성 바이러스 성 복제의 생산을 사용할 수 있습니다. 단일 가닥 부정적인 RNA 바이러스, 그것 아니었다 1994 년까지 셀19 에 플라스 미드의 transfection를 다음 첫 번째 광견병 바이러스의 생산 장소를 했다. 첫 번째 플라스 미드 역 유전 위한 기반 시스템 RSV 199520에 출판 되었음. 역 유전학 바이러스학의 분야에서 큰 발전을이 끌고있다. 바이러스 성 게놈에 특정 수정 소개의 가능성 복제 및 RNA 바이러스의 병 인에 중요 한 통찰력을 제공 하고있다. 이 기술은 수정 대상된 시리즈를 통해 특정 감쇄 함으로써 백신의 개발을 촉진 또한 크게 있다. 크게 바이러스 곱셈의 급속 한 정량화를 허용 하는 게놈 수정 개선 항 바이러스 검사 및 행동의 그들의 모드의 연구.

앞서 설명한 유전자 변형된 RSVs 취득 남아 있다 섬세 한. 여기, 우리는 프로토콜 각각 RSV GFP 또는 RSV-M2-1-GFP를 표현 하는 재조합 HRSV 두 가지 유형의 만들을 선발. 이 프로토콜에서 우리는 새로운 재조합 형 바이러스로 바이러스 주식 높은 titer, 재현성 실험에 적합을 얻기 위해 그들의 증폭을 구출 하는 데 필요한 transfection 조건 설명 합니다. 반전 유전학 벡터의 건설 라기보다 여기 설명 되지 않은입니다. 우리 할 최적의 수확 및 바이러스 성 주식의 동결에 대 한 방법을 설명 합니다. 바이러스 성 전염 성 입자를 계량 하는 가장 정확한 방법은 패 분석 실험에 남아 있다. 셀 직렬 희석 분석 된 서 스 펜 션의 감염 되며는 상쾌한에 무료 바이러스 성 입자의 유포를 금지 하는 오버레이 함께 알을 품을. 이러한 조건에서 바이러스는 각 초기 전염 성 입자에 대 한 "패"를 형성 하는 인접 셀만 감염 됩니다. 기존 RSV 적정 분석 결과, 플 라크는 immunostaining에 의해 공개 하 고 현미경 관찰에서 계산. 이 메서드는 비싸고 시간이 많이 소요. 여기 우리는 육안으로 보이는 플 라크의 형성을 가능 하 게 미정 질 셀 루 로스 오버레이 사용 하 여 RSV 패 분석 결과 대 한 매우 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 우리가 측정 RSV 복제 하 고, 따라서, RSV GFP를 사용할 수 있습니다 어떻게 보여 antivirals의 영향을 계량화. 역 유전학 및 라이브 이미징 기술을 결합, RSV-M2-1-GFP 과학자 M2-라이브 셀에 1을 시각화 하 고 세포내 바이러스 구조, IBs 등의 역학 관계에 따라 있도록 하는 방법을 설명 합니다.

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프로토콜

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1. 재료 준비

  1. 세포 미디어 구매 (감소 된 혈 청 미디어, 최소 필수 미디어 [메모리] 메모리, 그리고 Dulbecco x 10의 수정이 글의 중간 [DMEM]) transfection 시 약 및 미정 질 셀 루 로스 ( 재료의 표참조).
  2. 반전 유전학에 대 한 다음 벡터를 얻기: 게놈 vector(s) 및 인코딩 N 단백질 및 중 합 효소 복잡 한 단백질 식 벡터. 게놈 벡터 포함 살 균 소 T7 RNA 중 합 효소 (pol T7) 발기인에서 전체 cDNA 게놈 RSV-M2-1GFP (p-RSV-M2-1GFP) 하류와 RSV-GFP (p-RSV-GFP)의. 식 벡터 (p로 지정-N, p-P, p-L, 및 p-M2-1) 포함 N, P, L, 또는 m 2-1의 코딩 순서를 다운스트림 T7 폴 (Rincheval 외.12 및 플라스 미드 구문에 관한 자세한 내용은 Rameix Welti 외.21 참조).
  3. 무 균 환경에서 세포 배양과 transfection 및 감염에 대 한 미디어를 준비 합니다. DMEM를 사용 하 여 2 m L-글루타민 보충 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS), 1000 단위/mL 페니실린과 1 mg/mL 스 (또는 항생제 없이) 및 메모리 2 m L-글루타민 보충과 0%, 2% 또는 10 %FCS, 1000 단위/mL 페니실린, 1 mg/mL 스, 다음 프로토콜에서 "완전 한 매체"로 지정
  4. BSRT7/522 셀을 10% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 1 ~ 2 x 106 셀/mL에서 보충 하는 완전 한 매체에서 주식을 확인 합니다. 액체 질소에 셀 주식을 절약 합니다. 형 간염-2 셀을 가져옵니다. 완전 한 DMEM 문화 BSRT7/5 셀 고 메 마른 환경에서 37 ° C, 5% CO2 전체 메모리 형 간염-2 셀.
  5. 10 x RSV 보존 솔루션 (HEPES 0.5 M 및 1 M MgSO4 [pH 7.5] 물에) 무 균 환경에서 준비 합니다.
  6. 거꾸로 형광 현미경을 GFP 형광 측정와 호환 및 감염을 모니터링 하는 경우 라이브 이미징 호환을 가져옵니다. GFP 형광 측정 RSV GFP 복제의 정량에 대 한 호환 microplate 리더를 얻을.

2. 구조 및 재조합 형 바이러스의 첫 대목

참고: 클래스 II 안전 캐비닛을 사용 하 여 무 균 환경에서 모든 다음 단계를 수행 합니다.

  1. Transfection, 전날 완전 한 매체에서 5 x 105 셀/mL에서 BSRT7/5 셀 라인의 중단을 확인 합니다. 6 잘 플레이트에 잘 당 세포 현 탁 액 2 mL를 배포 합니다. 부정적인 제어 구조 될 것 이다 바이러스 당 하나 잘와 하나의 추가 잘 준비. 37 ° C, 5% CO2접시를 품 어. 셀에 있는 80%-90% 합류 다음날 확인 합니다.
  2. 고정 취소 반전 유전학 (1.2 단계)에서 벡터 p-RSV-GFP와 p-RSV-M2-1-GFP, p 뿐만 아니라-N, p-P, p-L, 및 p-m 2-1. 각 바이러스 구조, 1 µ g p-N 및 p-P, p의 0.5 µ g를 위해 믹스,-L, p의 0.25 µ g-M2-1, 그리고 p-RSV (GFP 또는 M2-1 GFP) 튜브에서의 1.25 µ g.
    참고: N, P, L, m 2-1에 대 한 다른 식을 벡터를 사용할 수 있습니다; 그러나, 단백질 사이의 비율 유지 될 수 있다. P-RSV 벡터는 빈 벡터 대체 하 여 부정적인 제어를 수행 합니다.
  3. Transfection, transfection 시 약 제조업체의 프로토콜에 따라 진행 (재료의 표 참조).
    1. 혼합된 벡터에 감소 된 혈 청 매체의 250 µ L를 추가 합니다. 다른 튜브에 감소 된 혈 청 매체의 250 µ L에서 transfection 시 약의 10 µ L를 희석. 부드럽게 소용돌이 모두 튜브와 믹스 모두 튜브 내용과 실 온에서 20 분을 기다리는 5 분 기다립니다.
    2. 감소 된 혈 청 매체의 1 mL BSRT7/5 셀 린스를 잘 당 항생제 없이 10% fcs MEM의 1.5 mL를 배포 합니다. 필요한 경우, 단계 2.3.1에서에서 설명한 부 화 완료 될 때까지 37 ° C, 5% CO2 에서 품 어.
    3. 20 분 보육 시간 때 잘 2.3.1 단계에서 준비 transfection 믹스의 500 µ L를 추가 합니다. 3 일 동안 37 ° C, 5% CO2 배양 기에서 세포를 놓습니다. Transfection는 동안 세포의 문화 매체를 변경 하지 마십시오.
  4. GFP 형광 (488 nm에서 여기)와 515-535 nm에서 방출 20 x 배율 1에서 거꾸로 형광 현미경 관찰 x 구조 효율성을 모니터링 하는 하루, 필터는 GFP를 사용 하 여.
  5. Transfection는 후 두 번째 날 구출된 바이러스의 첫 대목에 대 한 셀 씨. 완전 한 매체에서 5 x 105 셀/mL에서 형 간염-2 세포의 현 탁 액을 준비 합니다. 6 잘 플레이트 (한 잘 구조 및 1 개의 부정적인 제어 바이러스 당)에 잘 당 세포 현 탁 액 2 mL를 배포 합니다.
  6. Transfection, transfected BSRT7/5 6 잘 플레이트의 각 음에 스크래치 셀의 셋째 날에 각 잘 다른 스 크레이 퍼를 사용 하 여. 각 잘 콘텐츠 (셀 및 상쾌한) 살 균 2 mL microcentrifuge 튜브로 전송. 각 소용돌이 관 적극적으로 적어도 30 s 세포 막에서 구출된 바이러스를 출시.
    참고: 이 구출된 바이러스 (그림 1)의 통로 0 (P0)에 해당합니다.
  7. 신선한 바이러스 P0 정지를 사용 하 여 구조 바이러스의 첫 번째 증폭을 수행.
    1. 형 간염-2 6-잘 접시에서 배양 시드 하루 전에 제거 (단계 2.5 참조) 신속 하 게 잘 당 (에서 단계 2.6) P0 현 탁 액의 500 µ L을 추가 하 고. 2 h에 대 한 부드러운 교 반에 대 한 참조 본 로커에 37 ° c 형 간염-2 접시를 놓습니다.
    2. 제거 및 inoculum의 500 µ L를 삭제 하 고 2% fcs MEM의 2 개 mL를 추가. 3 일 동안 37 ° C, 5% CO2 접시를 품 어. 이 구조는 (그림 1) 바이러스의 첫 대목 (P1)을 생산할 예정 이다.
  8. (2.6 단계)에서 나머지 P0 서 스 펜 션으로 10 배 RSV 보존 솔루션 (HEPES 0.5 M 및 1 M MgSO4 [pH 7.5])의 볼륨의 10 분의 1을 추가 합니다. 소용돌이 적극적으로 5 s와 약 수에 대 한 microtubes 저온 관에 내용을 알코올 내성 태그도 표시. 알코올-80 ° C에서 precooled에 적어도 1 시간에 대 한 튜브를 담가 그리고-80 ° c.에서 그들을 저장합니다
  9. P0 재고를 적정 (단계 2.6 참조)의 각 구조 바이러스 (미정 질 셀 루 로스 적정에 대 한 섹션 4 참조).
  10. GFP 형광 (488 nm에서 여기)와 515-535 nm에서 방출 형 간염-2 셀의 감염 감염을 모니터링 하는 일 당 1 x 20 배 확대에 거꾸로 형광 현미경 P0 정지 된 관찰 합니다. 명시 야 현미경 작은 syncytia의 모양을 관찰 하 고 셀 RSV cytopathogenic 효과 (CPE)를 반영 하는 분리 ( 그림 2참조).
  11. 참고 구조 형광도 CPE 표시 경우 2-3 일 후 실패 했습니다.
  12. 하루에 3 또는 4 단계 2.6에에서 설명 된 대로 첫 번째 통로 (P1)를 수집 합니다. 간단히, 긁어 셀, 셀과 상쾌한 함께, 소용돌이, 절약 솔루션 샘플 단계 2.8, aliquot에 설명 된 대로 추가 하 고 그것을 동결 수집 합니다.
  13. 적정 하십시오 (적정 분석 결과 대 한 섹션 4 참조) 하 고 증폭 하는 첫 대목 (증폭에 대 한 섹션 3 참조).

3입니다. 구조 바이러스의 증폭

참고: 다음 프로토콜 75 c m2 플라스 크에서 구출된 바이러스의 증폭을 설명합니다. 필요한 볼륨을 플라스 크 크기와 감염 (MOI)의 필요한 다양성을 적응. 표 1 은 다른 플라스 크에 대 한 볼륨을 나타냅니다. 클래스 II 안전 캐비닛에서 무 균 환경에서 모든 다음 단계를 수행 합니다.

  1. 완전 한 매체에서 5 x 105 셀/mL에서 형 간염-2 세포의 현 탁 액 증폭 전날 준비. 75 c m2 플라스 크 당 세포 현 탁 액의 15 mL 고 37 ° C, 5% CO2플라스 크를 품 어. 증폭 바이러스 당 하나의 플라스 크를 준비 합니다.
  2. 부 화, 시작 후 하루 셀 80%-100% 합칠 되는지 확인 합니다.
  3. FCS 50000 PFU/mL (0.01 PFU/셀의 나 해당)에서 3 mL 정지를 하지 않고 메모리에 2.12 단계에서 바이러스 성 현 탁 액을 희석.
  4. 매체를 제거 하 고 신속 하 게 3 mL 바이러스 정지를 추가 합니다. 2 시간에 대 한 부드러운 교 반에 대 한 참조 본 로커에 37 ° C에 플라스 크를 배치 합니다.
  5. 제거 하 고 삭제는 inoculum fcs가 2 %MEM 15 mL을 추가. 2-4 일 동안 37 ° C, 5% CO2 에서 품 어.
  6. 바이러스를 수확 하기 위해 적절 한 시기를 추정 하기 위해서는 셀 형태학과 GFP 형광 (488 nm에서 여기)와 515-535 nm에서 방출 20 배 확대에 거꾸로 형광 현미경을 확인 하십시오. 이 일반적으로 48 및 72 h 바람직합니다 (파이) 사이 발생 하는 RSV CPE 인해 형 간염-2 셀 계층의 50%-80%를 분리 하는 때 ( 그림 3참조).
  7. 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 모든 셀을 다쳤어요. 전지와 상쾌한 모두를 함께 수집 하 고 50ml 원심 분리기 튜브에 그들을 전송.
  8. RSV 절약 솔루션 (0.5 M HEPES 및 1 M MgSO4 [pH 7.5]) x 10의 볼륨의 10 분의 1을 추가 합니다. 와 동 5에 대 한 적극적으로 튜브 s 200 x g에 5 분 원심 분리 하 여 정지를 명확히.
  9. 50 mL 튜브에는 상쾌한을 전송. 짧게 소용돌이 약 수 저온 관에 서 스 펜 션 알코올 내성 태그도 표시. 적어도 1 시간에 대 한 precooled-80 ° C 알코올에 튜브를 담가 그리고-80 ° c.에서 그들을 저장합니다
  10. Aliquots 바이러스 성 현 탁 액 (참조 섹션 4) 적정 하 중을 고정 취소 합니다.

4. 패 적정 분석 결과

  1. 적정 적정 분석 결과 수행 하기 전에 하루 12-잘 접시 준비 (6 우물 하셔야 바이러스에의 한 튜브를 적정). 완전 한 매체에서 5 x 105 셀/mL에 형 간염-2 셀의 1 mL와 웰 스 씨
  2. 다음 날, 불 임 미정 질 셀 루 로스 정지 (2.4% [w/v] 물에) 준비 (재료의 표 참조).
    1. 2.4 g 분말 (일반적으로 4-12 h)의 완전 한 해체까지 표준 자력을 사용 하 여 증류수 100 mL에 미정 질 셀 루 로스 분말의 분산. 압력솥 20 분 동안 121 ° C에서 정지 하 고 사용 하기 전에 실내 온도에 저장.
      참고: 이러한 조건 하에서 정지 1 년에 대 한 안정적입니다.
    2. 메 마른 환경에서 솔루션을 연 다음 저장 4 ° C에서 6 개월. 항상 그것은 균질 되도록 (손을 떨고 또는 vortexing)에 의해 사용 하기 전에 서 스 펜 션 믹스.
  3. 2 준비 무 균 환경에서 MEM x. 상업적인 MEM 10 희석 살 균 물 x L-글루타민, 1000 단위/mL 페니실린과 1 mg/mL 스 추가. 희석을 적극적으로 악수와 4 ° c.에 그것을 저장합니다
    참고: 클래스 II 안전 캐비닛을 사용 하 여 무 균 환경에서 4.4-4.10 단계를 수행 합니다.
  4. 6 튜브 바이러스 적정 수를 당 FCS 없이 MEM의 900 µ L를 포함 (적정 관)을 준비 합니다. 바이러스 aliquots을 녹여 소용돌이 5 s, 그리고 첫 번째 적정 하 전송 100 µ L를 위해 적극적으로 관.
  5. 10 배 희석 6 수행 x, 다음과 같이. 첫 번째 튜브에 매체의 900 μ 바이러스의 100 μ는 튜브에 넣고 뚜껑 몇 초 동안 vortexing에 의해 그 내용을 믹스를 추가 합니다. 에 피 펫 팁을 변경, 두 번째 튜브에 매체의 900 µ L에 추가할 첫 번째 희석의 100 µ L, 튜브, 그리고 소용돌이에 모자를 쓰고. 6 관까지 절차를 반복 합니다.
    참고: 그것은 매우 각 희석에 대 한 팁을 변경 하는 것이 중요입니다.
  6. 형 간염-2 12-잘 접시에 바이러스 이름 및 배 희석 작성 합니다. 얼룩 (4.9 단계) 동안 분리 될 수 있기 때문에 접시와 그것의 덮개를 일치 하도록 표시를 추가 합니다. 격판덮개에서 매체를 제거 하 고 잘 당 한 희석의 400 µ L를 배포. 바이러스 흡착에 대 한 2 h 37 ° C에서 번호판을 품 어.
    참고: 각 inoculum 사이 피 펫 팁을 변경 하거나 같은 팁과 높은 농도에서 낮은 진행. 제한 된 일련의 셀 건조를 방지 하는 동시에 접시 (1 ~ 2) 예방
  7. 바이러스 흡착 (임기 응 변의 준비) 동안 미정 질 셀 루 로스 오버레이 준비 합니다. 오버레이 100 mL를 얻을, 2.4% 미정 질 셀 루 로스의 서 스 펜 션, MEM, x 2의 10 mL 및 fcs가 2 %MEM 80 mL의 10 mL를 혼합 한다.
    1. 2의 pH 조정 색상 표시기에 따라 약 7.2 7.5%, 탄산수 소 나트륨 살 균 솔루션을 MEM x. 미정 질 셀 루 로스 펜션과 메모리를 추가 하 고 적극적으로 혼합.
  8. 2 h 외피의 끝에는 inoculum을 제거 하지 않고 사용 12-잘 접시의 각 음에 오버레이의 2 ~ 3 mL을 추가 합니다. 높은 바이러스 titer inoculums와 인접 한 우물의 오염 방지에 주의 해야 합니다. 6 일 동안 37 ° C, 5% CO2 접시를 품 어. 접시를 이동 하지 마십시오 그리고 외피 동안 인큐베이터를 이동 하지 마십시오.
  9. 얼룩 크리스탈 바이올렛 솔루션 (8% 크리스탈 바이올렛 [v], 2% 포름알데히드 [v/v], 그리고 물에 20% 에탄올 [v])를 사용 하 여 셀으로 이동 합니다.
    1. (표면 강하게 색 크리스탈 바이올렛) 시트와 캐비닛 biosafety의 작업 표면을 보호 합니다.
    2. 부드럽게 흔들 미정 질 셀 루 로스 오버레이 벗고 접시. supernatants 제거 하 고 세척 셀 2 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1와 x. 셀 건조를 피하기 위해 번호판 하나 하나를 처리 합니다. 크리스탈 바이올렛 솔루션의 1-2 mL을 추가 하 고 10-15 분 제거 후속 판 얼룩에 대 한 다시 사용할 수 있는 솔루션을 기다립니다.
    3. 몇 초 동안 접시와 신선한 표 백제에 뚜껑을 담가 그리고, 다음, 철저 하 게 수돗물으로 그들을 씻어. 접시와 커버는 표 백제로 소독 하는 참고.
    4. 접시와 뚜껑 종이 타 올에 넣고 건조 그들을 보자. 물 세 정 후는 주위 온도에 번호판을 건조 하 고 상 온에서 저장. 긴 저장 기간 (개월) 계속 색상을 보호 하기 위해 빛에서 보호 하는 접시. 참고는 경우 세포는 그들의 착 색을 잃고, 그들은 얼룩이 질 수 있다 다시 크리스탈 바이올렛과.
  10. 바이러스 titers을 계산 합니다. 육안으로 볼 수 있습니다 건조 격판덮개의 우물에서 플 라크를 계산 합니다. 다른 희석의 패 수 일관 된 (팩터 10 각 희석 사이) 인지 확인 합니다. 우물에는 플 라크는 쉬운 계산을 선택 합니다. 플 라크 inoculum 볼륨 및 희석 수를 평가 합니다.
    참고: 그림 4에 제공 된 예제에서 21 패 10-5 희석에서 계산 됩니다. 이들은의 titer에 해당
    figure-protocol-1
    figure-protocol-2

5. 작은 간섭 RNA 또는 Antivirals로 치료 하는 세포에 바이러스 성 복제를 모니터링 하는 데 HRSV GFP 재조합 형 바이러스의 사용

참고: 클래스 II 안전 캐비닛을 사용 하 여 무 균 환경에서 5.1 및 5.2.5 제외 하 고 모든 단계를 수행 합니다.

  1. RSV 곱셈에 침묵 하는 세포질 유전자의 효과 모니터링
    참고: transfection 프로토콜 시 약에 따라 달라 집니다 ( 재료의 표참조).
    1. GFP 측정에 대 한 96 잘 접시를 준비 합니다. 분석 결과, 전에 2 일 작은 간섭 RNA (siRNA), 주어진 준비 100의 농도에 siRNA를 포함 된 감소 된 혈 청 미디어 솔루션 및 siRNA transfection 시 약 1/500 희석. 실 온에서 30 분에 대 한 솔루션을 품 어.
    2. 5.1.1 (3 중)에서 준비 하는 격판덮개의 우물에는 솔루션의 25 µ L를 추가 합니다. 4 x 105 셀/mL 3 x 105 셀/mL의 최종 셀 농도를 항생제 없이 완전 한 매체에서 A549 세포의 현 탁 액의 75 µ L로 웰 스 씨. 37 ° C, 5% CO2에서 48 h에 대 한 접시를 품 어.
      참고: 최종 siRNA의 농도 25 nM 및 최종 transfection 시 볼륨은 0.5 µ L/잘).
    3. 다음과 같이 세포를 감염. 우물에서 매체를 제거 합니다. 50000 PFU/mL에서 RSV GFP 서 스 펜 션의 100 µ L을 추가 하 고 37 ° C, 5% CO2에서 2 h에 품 어. 바이러스 성 현 탁 액을 제거 하 고 2 %FCS 페 놀 레드 없이 DMEM의 100 µ L를 추가. 37 ° C, 5% CO2접시를 품 어.
    4. 24 시간 및 48 h 탐정, 형광 측정, 488 고 520 nm의 여기 및 방출 파장을 각각 설정는 spectrofluorometer를 사용 하 여 (형광 상대 형광 단위로 표현 된다). Noninfected A549 세포를 사용 하 여 형광 및 배경 수준에 대 한 표준으로.
      참고: 셀 4 %paraformaldehyde (PFA)와 고정 플레이트 커버 없이 그들을 측정 하기 전에 해야 합니다.
  2. RSV GFP를 사용 하 여 마약 억제의 평가
    1. GFP 측정에 대 한 96 잘 접시를 준비 합니다. 분석 결과, 전날 5 x 105 셀/mL에 페 놀 레드 없이 완전 한 매체에서 형 간염-2 세포의 현 탁 액의 100 µ L로 웰 스 씨.
    2. 준비는 시험의 직렬 희석 마약 MEM 2 %FCS 항생제 (잘 당 50 µ L) 보완에 (이 예제에서 AZ4316). Stromal 혈관 인자 (SVF)과 페 놀 레드 (잘 당 50 µ L) 없이 메모리에 10000 PFU/mL에서 바이러스 성 정지를 준비 합니다.
    3. 96-잘 형 간염 2에서 매체를 제거 약물 중단의 50 µ L (3 중)에 바이러스 성 현 탁 액의 50 µ L을 추가 하 고 접시. 컨트롤 모의 감염을 병렬로 수행 합니다.
      참고: 약물 희석 및 바이러스 성 현 탁 액 셀에 그들을 추가 하기 전에 혼합 수 있습니다 또는 순차적으로 추가할 수 있습니다.
    4. 37 ° C, 5% CO2에서 48 h에 대 한 접시를 품 어.
    5. 5.1.4 단계에서 설명한 대로 spectrofluorometer를 사용 하 여 형광을 측정 합니다. 기준으로 모의 감염 형 간염-2 세포를 사용 하 여 형광 배경 수준에 대 한.

6. RSV-M2-1-GFP 재조합 바이러스 Vivo에서 M2-1 현지화의 특성

참고: 클래스 II 안전 캐비닛을 사용 하 여 무 균 환경에서 6.1 및 6.2 단계를 수행 합니다.

  1. 완전 한 매체에서 5 x 105 셀/mL에서 형 간염-2 세포의 현 탁 액을 준비 합니다. 씨앗의 35 mm 페 트리 접시 permeant CO2 와 맞게 세포 현 탁 액 1.5 mL 라이브 영상.
  2. 3.3-3.5 단계에서 설명한 대로 감염 나 1에서 RSV-M2-1-GFP 바이러스 뿌리기 후 하루 수행 (매체를 제거, inoculum의 1 mL에 500 µ L를 추가 2 h 동안 부드럽게 흔들어 동안 37 ° C에서 샘플을 품 어;는 inoculum 제거 고 추가 2 메모리의 1.5 mL %FCS)입니다. 원하는 시간 (IBs는 10 h 탐정에서 표시 하기 시작할 것 이다)에 대 한 37 ° C, 5% CO2 에서 셀을 품 어.
  3. 40 x 무대에서 감염 된 세포를 포함 하는 배양 접시를 배치 하기 전에 37 ° C에서 100 x 목표를 갖춘는 거꾸로 한 현미경의 보육 실 예 열. CO2 공급 열고 초점 안정화를 기다립니다.
  4. Phototoxicity를 최소화 하기 위해 이미징 (1 분 당 0.1 이미지)에서 낮은 자극 강렬과 이미지 주파수에서 GFP 호환 필터를 수행 합니다.

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결과

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이 작품에서 우리는 (그림 2) 형광 단백질을 표현 하는 재조합 RSV 바이러스를 생산 하는 상세한 프로토콜을 설명. PRSV-GFP, GFP 유전자가 이전에 게시 작업21벚꽃 유전자에 대 한 설명 된 대로 P와 M 유전자 사이 도입 되었다. pRSV-M2-1-GFP, M2 유전자가 온전히 남아 그리고 SH와 G 유전자12사이 삽입 했다 M2-1-GFP에 대 한 추가 유전자 코딩. BSRT7/5 셀, 바이러스의 구조에 해당 하는 첫 번째 단계는 그림 2A에 표시 됩니다. 녹색 형광 세포의 작은 클러스터 RSV GFP와 RSV-M2-1-GFP 구조에 해당 하는 우물에서 보이는 72 h posttransfection 했다. 형광 신호 세포질에 GFP RSV 감염 된 세포에서 핵 무료 ...

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토론

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여기 선물이 5 플라스 미드에서 재조합 RSVs의 구조 하는 방법 및 그들의 증폭. 바이러스의 게놈을 조작 하는 기능 돌연변이 테스트 하 고 추가 유전자 또는 태그 바이러스 성 단백질을 표현 하는 바이러스학 연구를 혁명을 했다. RSV 우리 설명 하 고이 문서에서는 예를 들어 바이러스 취재 원 유전자, RSV-GFP (미 발표)와 M2-1 단백질 GFP 태그12에 융합 하는 표현으로 사용. RSV 구조 도전 이며 실천을 요구 한다. Transfection 효율은 transfection 시 약의 현명한 선택과 transfection 프로토콜의 이전 최적화에 따라 중요 합니다. 바이러스 성 cDNA는 다운스트림 T7 pol 발기인에에서 배치 역 유전자 벡터의 대부분 때문에 살 균 소 T7 폴을 표현 하는 셀의 사용은 필수. 대신은 vaccinia 바이러스 도우미에서에서 T7 폴을 표현 하는 것입니다. 그러나, T7 유류를 안정적으로 표현 하는 셀의 사용 두 바이러스 분리의 필요성을 방지 하...

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공개 사항

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저자는 공개 없다.

감사의 글

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저자는 AZD4316 마약을 제공 하는 아 스 트 라 R & D, 석사, 미국 보스톤, 박사 진 유 감사 합니다. 저자는 Cymages 플랫폼 ScanR 올림푸스 현미경에 대 한 액세스에 대 한 감사는 의해 지원 되었다 지역 Ile-de-France (희미 한 상태)에서 부여 합니다. 저자는 INSERM과 베 르 사 이유 Saint-Quentin 대학에서 지원을 인정 한다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
35 mm µ 라이브 셀 이미징용 접시Ibidi81156
A549ATCCATCC CCL-185
Avicel RC-591FMC BioPolymerAvicel RC-591 Avicels에 대한 기술 및 기타 정보는 http://www.fmcbiopolymer.com 에서 확인할 수 있습니다. 실온에서 보관하십시오. 4단계의 프로토콜은 이 시약에 최적화되어 있습니다.
BSRT7/5상용화되지 않음참조 22를 참조하십시오. Buchholz et al. 1999
크리스탈 바이올렛 용액시그마HT90132
관측용 형광 현미경OlympusIX73 올림푸스 현미경
비디오 현미경ScanR올림푸스 현미경
HEp-2ATCCATCC CCL-23
HEPES ≥ 99.5%SigmaH3375
L-글루타민(200m)ThermoFisher Scientific25030024
리포펙타민 2000 시약ThermoFisher Scientific11668019프로토콜 2.3.이 이 시약에 최적화되어 있습니다.
MEM (10x), 글루타민 없음ThermoFisher Scientific11430030
MEM, GlutaMAX 보충제ThermoFisher Scientific41090-028
MgSO4 ReagentPlus, ≥ 99.5%SigmaM7506
Opti-MEM I 환원 혈청 매체ThermoFisher Scientific51985-026
파라포름알데히드 수용액, 32%, EM 등급전자 현미경 과학15714
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)ThermoFisher Scientific15140122
플라스미드는상업적으로 이용 가능하지 않습니다.참조 21를 참조하십시오. Rameix-Welti et al. 2014
See Saw RockerVWR444-0341
Si RNA GAPDHDharmaconON-TARGETplus siRNA
D-001810-10-05		SMARTpool 및 Dharmacon에서 설계한 4개의 개별 siRNA 중 3개.
Si RNA IMPDH2DharmaconON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human
L-004330-00-0005		Dharmacon.
개별 참고 문헌 및 서열
J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA;
J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC;
J-004330-08: 아그구카아우카카아아우우;
J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCGAUG;
Si RNA RSV NDharmaconON-TARGETplus custom siRNAUUCAGAAGAACUAGAGGCUAU 및 UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA
SiRNA NTDharmaconON-TARGETplus Non-targeting Pool
SiRNA 형질주입 시약DharmaconDharmaFECT 1 Ref: T-2001-03프로토콜 5.1단계 및 5.1.2단계는 이 시약에 최적화되어 있습니다.
중탄산나트륨 7.5% 용액ThermoFisher Scientific25080094
분광형광계Tecan Tecan무한 M200PRO
현미경

참고문헌

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