이 프로토콜은 생체 내 및 생체 내 생체 내 방법 모두, 마우스 눈의 혈관 회귀 모델인 히알로이드 혈관을 완전히 시각화하고 특성화하는 방법, 실시간 이미징 및 ex 생체 내 생체 내 생체 내 혈관 조영술을 위한 광학 일관성 단층 촬영 및 안저 플루오레세인 혈관 조영술을 사용하여 설명합니다. 정량 분석을 위한 히알로이드의 격리 및 후속 플랫 마운트.
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이 논문에서
요약
초록
눈에, 배아 히알로이드 혈관은 망막 혈관이 발전할 때 개발 렌즈및 망막및 회귀에 영양을 공급합니다. 히알라이드 혈관의 지속적 또는 실패한 회귀는 지속적인 과소 플라스틱 1 차 유리체 (PHPV)와 같은 질병에서 볼 수 있으며, 방해된 빛 경로 및 시각 기능 장애를 초래합니다. 히알로이드 혈관 회귀의 근본적인 메커니즘을 이해하면 혈관 회귀 과정에 대한 새로운 분자 통찰력과 지속적인 히알로이드 혈관으로 질병을 관리하는 새로운 방법을 얻을 수 있습니다. 여기에서 우리는 광학 일관성 단층 촬영 (OCT) 및 안저 플루오레세인 혈관 조영술 (FFA)를 가진 살아있는 마우스에 있는 화상 진찰 히알로이드를 위한 절차 및 정량 분석을 위한 격리 및 평면 장착 hyaloid ex vivo의 상세한 기술 프로토콜을 기술합니다. 저밀도 지단백 수용체 관련 단백질 5(LRP5) 녹아웃 마우스는 지속적인 히알로이드 혈관의 실험 모델로서, 기술을 설명하기 위해 사용하였다. 함께, 이러한 기술은 지속적인 히알로이드 혈관의 메커니즘에 대한 혈관 회귀 및 연구의 실험 모델로서 히알로이드 혈관의 철저한 평가를 용이하게 할 수 있다.
서론
눈의 혈액 공급은 망막과 주변 안구 조직의 정상적인 발달을 보장하고 적절한 시각 기능을 갖추는 데 필수적입니다. 눈에는 망막 혈관, 코로이드 및 히알로이드 혈관의 일시적인 배아 순환 네트워크의 세 가지 혈관 침대가 있습니다. 안구 혈관의 발달은 배아 발생 및 조직 성숙을 통해 공간적 및 시간적 조정을 필요로 합니다. 3개의 혈관 침대 중, 히알로이드 혈관 구조는 새로 형성된 배아 렌즈 및 발달 망막에 영양과 산소를 공급하는 첫번째 기능성 혈액 공급 시스템입니다. 히알로이드 혈관은 망막 혈관구조가 발달하고 성숙하는 동시에 회귀1. 히알라이드 혈관 구조의 회귀는 시각 기능의 발달을위한 명확한 시각적 경로를 허용하는 중추적 인; 따라서, 이 혈관 회귀 과정은 망막 혈관구조의 성장만큼 중요합니다. 히알로이드 회귀가 손상되어 안과 질환으로 이어질 수 있습니다. 더욱이, 히알로이드 혈관의 회귀는 다른 기관의 혈관신생 조절에 영향을 미칠 수 있는 혈관 회귀의 조절에 관여하는 세포 및 분자 메커니즘을 조사하는 모델 시스템을 제공한다.
히알로이드 동맥 (HA)에서 파생 된 히알로이드 혈관 구조는 바사 히알로 아이디어 프로피아 (VHP), 튜니카 혈관로사 렌티스 (TVL), 및 동공 막 (PM)으로 구성됩니다. 그것은....
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프로토콜
모든 동물은 국립보건원의 지침에 따라 안과 및 동물 실험에 대한 시력 연구에 대한 비전 및 안과학 연구 협회 (ARVO) 성명서에 따라 치료되었습니다. NIH) 보스턴 아동 병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 규정 된 실험 절차 및 규정에 대한 동물의 관리 및 사용에 관한. LRP5-/- 마우스 (재고 번호 005823; 잭슨 연구소) 및 그것의 야생 형 (WT) 제어 C57BL/6J 마우스 (재고 번호 000664; 잭슨 연구소)는 이 연구에 사용되었다.
1. 파트 I: 설치류 망막 이미징 시스템을 사용하여 히알로이드 혈관의 생체 내 이미징
- 마우스 마취 및 동공 팽창의 준비
- 마우스를 선택합니다.
- 망막 화상 진찰을 위해 P12 (그들의 눈을 연 후에) 보다는 더 오래된 마우스를 사용하십시오; 남녀 모두 적합합니다.
- 원하는 대로, 성인기에 걸쳐 지연 된 히알로이드 회귀 (및 그들의 WT 제어)를 가진 이미지 돌연변이 마우스. 3주 이상 된 WT 마우스는 검출 가능한 잔류 히알로이드 혈관을 많이 나타내지 않을 수 있으므로 P12-P21은 가시적인 WT 히알로이드잔류영상을 위한 이상적인....
- 마우스를 선택합니다.
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결과
살아있는 마우스에 있는 히알라로이드 혈관의 생체 내 화상 진찰
그림 3 A는 3개월 된 WT및 Lrp5마우스에서망막 및 히알로이드 조직에 대한 OCT 이미지의 단면 뷰를 보여 주며, 지속적인 히알로이드를 가진 동물 모델입니다. WT 눈은 히알로이드 조직의 부재를 나타내고, Lrp5-/-눈은 시신경 머리에서 파생된 두 개의 지속적인 히알로이드 혈관을 보여줍니다. 그림 3 B는 6주령 의 Lrp5-/- 마우스에서 형광장에서 지속적인 히알로이드 혈관(녹색)의 FFA 이미지를 표시합니다. WT 마우스는 히알로이드 혈관의 잔재를 나타내지 않으며, Lrp5-/-마우스는 유리체에 있는 히알로이드 혈.......
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토론
히알로이드 혈관을 평가하고 특성화하는 기술은 동물 모델에서 히알로이드 혈관 회귀를 관찰하는 직관적이고 필요한 절차이며, 개발 중 혈관 회귀의 기초가 되는 메커니즘에 대한 연구를 허용합니다. 생체 내 망막 이미징은 동일한 동물에서 히알로이드 회귀의 세로 관찰을 허용하는 반면, OCT 및 FFA를 위한 설치류 안저 이미징 시스템에 대한 접근은 제한 요인이 될 수 있다. 추가적인 추가, 살아있는 마우스에 있는 생체 내 화상 진찰은 그들의 눈을 열기 전에 가능하지 않습니다. 따라서이 방법론은 신생아 단계에서 눈 발달 중에 적용되지 않습니다. 한편, 고립된 눈의 단면을 이미징하는 것은 마우스의 모든 연령대에 사용될 수 있고 기술적 장벽이 낮지만, 눈에 보이는 히알로이드 용기가 몇 개밖에 없을 때 정량적이지 않으며, 이상적인 이미지를 얻을 확률은 주로 단면화 각도(그림 5). 이에 비해, 플랫 마운트 시각화를 위한 히알라드 용기의 분리는 전체 히알로이드 용기의 완전한 이미징과 정확한 정.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 J.C. Z.W.에 국립 보건원 (NIH) 보조금 (R01 EY024963 및 EY028100)에 의해 지원되었다 기사단 눈 재단 경력 스타터 그랜트에 의해 지원되었다. 이 연구에서 설명한 히알로이드 격리 절차는 리처드 랭 박사, 쿠리하라 도시히데, 로이스 스미스 박사가 아낌없이 공유한 프로토콜의 수정으로 조정되었으며, 저자들은 감사하게 생각합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| AK-Fluor (플루오레세인 주사, USP) | Akorn | 17478-253-10 | |
| Anti-CD31 항체 | Abcam | ab28364 | |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher | S2828 | |
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Artificial tear eyedrop | Systane | N/A | |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| C57BL/6J 마우스 | The Jackson Laboratory | 재고 번호: 000664 | |
| 염화칼슘(CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| 저온 유지 장치 | 라이카 | CM3050S | |
| 저온 유지 장치 | Leica | CM3050 S | |
| 사이클로펜톨레이트 염산염 및 페닐에프린 염산염 안약 | Cyclomydril | N/A | |
| 젤라틴 | Sigma-Aldrich | G9382 | |
| 염소 항-토끼 IgG (H+L) 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| 가열 보드 | Lab-Line Instruments Inc. | N/A | |
| Isolectin GS-IB4, 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | I21413 | |
| 케타민 염산염 주입 | KetaVed | NDC 50989-996-06 | |
| Lrp5-/- 마우스 | The Jackson Laboratory | 재고 번호 005823 | Deltagen Inc., San Mateo, CA |
| Micron IV 및 OCT | Phoenix Research Labs | Imaging 개발 | 소프트웨어 : InSight |
| 현미경 | Zeiss | discovery v8 | |
| 미세 수술 겸자 | Scanlan International | 4004-05 | |
| 미세 수술 가위 | Scanlan International | 6006-44 | |
| 최적 절단 온도 화합물 | Tissue-Tek | 4583 | |
| 최적 절단 온도 화합물 | Agar Scientific | ||
| 파라포름알데히드(16%) | 전자 현미경 Sciences | 15710 | |
| Peel-A-Way 일회용 임베딩 몰드 (조직 몰드) | Fisher Scientific | 12-20 | |
| 인산염 완충 식염수 (PBS) 버퍼 (10X) | Teknova | P0496 | |
| 슬라이드 커버 유리 | Premiere | 94-2222-10 | |
| Superfrost 현미경 슬라이드 | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 자일라진 멸균 용액 | Akorn: AnaSed | NDC: 59399-110-20 |
참고문헌
- Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
- Anand-Apte, B., Hollyfield, J. Developmental anatomy of the retinal and choroidal vasculature. The Retina and it....
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