제 브라에 자기장에 감도에 개성의 영향 평가

요약

우리는 어떻게 zebrafish의 인격에 영향을 미치는 물 전류 및 약한 자기장에 그들의 응답을 평가 하도록 행동 프로토콜을 설명 합니다. 동일한 인격과 물고기는 그들의 탐험 행동에 따라 구분 됩니다. 그런 다음, 수영 터널 낮은 흐름 속도 다른 자기 조건에 그들의 rheotactic 오리엔테이션 행동 관찰 됩니다.

초록

그들의 환경에서 스스로 방향, 동물 다양 한 성격 등의 여러 내부 요소와 상호 작용 하는 외부 신호를 통합 합니다. 여기, 우리가 여러 외부 환경 단서, 특히 물과 자기장 방향 반응에 zebrafish 개성의 영향의 연구를 위한 행동 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜 여부 사전 이해 하는 것을 목표로 또는 반응 zebrafish 다른 rheotactic 임계값을 표시 (즉, 있는 물고기 상류 수영 시작 흐름 속도) 주변 자기장의 방향을 변경 하는 때. 식별 하려면 zebrafish 같은 성격으로, 물고기 탱크의 절반 연결 밝은 반에 좁은 개방 된 어둠 속에서 소개 된다. 만 사전 물고기 탐구 소설, 밝은 환경. 반응 물고기 탱크의 어두운 절반을 종료 하지 마십시오. 낮은 흐름 율을 가진 수영 터널 rheotactic 임계값을 결정 하는 데 사용 됩니다. 우리 지구의 자기장 강렬의 범위에서 터널에 자기장을 제어 두 설정 설명: 흐름 방향 (1 차원)와 자기장의 3 축 제어를 허용 하는 자기장을 제어 하는 하나. 물고기는 다른 자기장 아래 터널에서 흐름 속도의 stepwise 증가 경험 하는 동안 촬영. 방향 동작에 대 한 데이터는 비디오 추적 절차를 통해 수집 하 고 rheotactic 임계값 결정 수 있도록 로지스틱 모델에 적용. 우리 보고 대표 결과 zebrafish shoaling에서 수집된 합니다. 특히, 이러한 사전 물고기 자기장 변화에 응답 하지 않는 동안 자기장의 방향에 변화 하는 때만 반응, 신중한 물고기 rheotactic 임계값의 변화를 보여 보여 줍니다. 이 방법론은 자기 감도의 연구 및 많은 수생 종, 독방을 표시 또는 수영 전략 shoaling의 rheotactic 행동에 적용할 수 있습니다.

서론

현재 연구에서 우리는 물고기 물고기 물 전류 및 자기장 등 외부 방향 신호를 shoaling의 방향 응답에 개성의 역할을 조사 하는 범위를가지고 실험실 기반의 행동 프로토콜을 설명 합니다.

동물의 orienting 결정 다양 한 감각 정보를 무게에서 유래한 다. 결정 과정 탐색 하는 동물의 능력에 의해 좌우 된다 (예를 들어, 선택 하 고 방향 유지 용량), 그것의 내부 상태 (예: 먹이 또는 생식 요구), 이동 (예를 들어, 운동 역학), 그리고 몇 가지 추가 하는 기능 외부 요인 (예, 하루, conspecifics와의 상호 작용의 시간)¹.

내부 상태 또는 방향 동작에서 동물 개성의 역할은 종종 제대로 이해 하거나²탐험 하지. 추가적인 사회 수생 종, 수시로 조정 수행 하 고 그룹 운동 동작³편광의 방향 연구에서 발생 한다.

물은 물고기의 오리엔테이션 과정에서 핵심 역할을 한다. 생선과 물이 전류는 unconditioned 응답 이라고 rheotaxis⁴, 될 수 있는 긍정적인 (즉, 상류 지향) 또는 네거티브 (즉 하류 지향)을 통해 방향을의 최소화를 구하고에서 배열 하는 다양 한 행사를 위해 사용 된다 에너지 비용^5,6. 또한, 문학의 성장 시체 보고 많은 물고기 종 방향 및 탐색^7,,89지자기의 필드를 사용 합니다.

물고기에서 rheotaxis 및 수영 성능 연구는 일반적으로 흐름 챔버 (flume), 어디 생선에 노출 되는 흐름 속도의 stepwise 증가에서 높은 속도, 낮은 소모 (라는 중요 한 속도)^{10까지 자주 수행 11}. 다른 한편으로, 이전 연구에서 아직도 물^12,13동물의 수영 동작의 관찰을 통해 방향 자기장의 역할 조사. 여기, 우리가 물 전류와 자기장을 조작 하는 동안 물고기의 동작을 연구 하는 연구자 수 있도록 실험실 기술을 설명 합니다. 이 방법은 주변 자기장의 조작 rheotactic 임계값 (즉, 최소한의 물 속도 결정 하는 결론으로 이어지는 우리의 이전 연구에서 shoaling zebrafish (Danio rerio)에 처음으로 이용 되었다 어떤 shoaling 물고기 동양 상류)¹⁴. 이 메서드는 느린 흐름 flume, 지구의 자기장 강렬의 범위 내에서 자기장을 제어 하도록 설계 되었습니다 설치와 결합 된 flume 챔버의 사용을 기반으로 합니다.

수영 터널 이용 zebrafish의 동작을 관찰 하는 그림 1에 설명 되어. (Nonreflecting 아크릴 실린더 7 cm 직경 및 길이 15 cm의 만든) 터널 흐름 속도¹⁴의 컨트롤에 대 한 설치 프로그램에 연결 됩니다. 이 설치 터널에서 흐름 율의 범위는 0과 9 cm/s 사이의 다릅니다.

수영 터널에서 자기 필드를 조작 하려면 사용 하는 두 방법 론 적 접근: 처음 1 차원 이며 두 번째는 3 차원. 모든 응용 프로그램에 대 한 이러한 방법은 정의 된 양의 물에 특정 자기 조건을 얻기 위해 지자기의 필드 조작-따라서,이 연구에서 보고 하는 자기장 강도의 모든 값 포함 지자기 분야.

1 차원에 관한 접근¹⁵, 자기장 (x 축으로 정의 되는) 물 흐름 방향을 따라 조작 수영 터널 감싸 솔레노이드를 사용 하 여. 이것은 전원 장치에 연결 하 고 그것은 균일 한 정적 자기장 (그림 2A)을 생성 합니다. 마찬가지로 3 차원 접근의 경우 수영 터널을 포함 하는 볼륨에 지자기의 필드 전기 철사의 코일을 사용 하 여 수정 됩니다. 그러나, 3 차원에서 자기장을 제어 하려면 코일 3 개 직교 헬름홀츠 쌍 (그림 2B)의 디자인이 있다. 각 헬름홀츠 쌍은 3 개의 직교 공간 방향 (x, y및 z)에 따라 동쪽으로 향하게 하는 2 개의 원형 코일의 구성 하 고 폐쇄 루프 조건에서 일 하는 3 축 자력을 갖춘. 자력 지구의 자연적인 분야와 유사한 분야 농도 함께 작동 그리고 그것은 (수영 터널이 위치한) 코일 집합의 기하학 센터에 가깝습니다.

우리는 물고기는 얕은 구성의 성격 특성 그들은 자기장¹⁶에 응답 하는 방법에 영향 가설 테스트를 위에서 설명한 기술을 구현 합니다. 우리는 사전 및 사후 성격^17,18 개인 응답 다르게 물 흐름과 자기장에 노출 되 면 가설을 테스트 합니다. 이 테스트 하려면 우리는 먼저 zebrafish 할당을 설립 방법과 사전 또는 사후^17,19,,2021그룹 개인을 사용 하 여 정렬 합니다. 다음, 우리는 떼 반응 개인만의 구성 또는 예제 데이터로 선물이 자기 수조 탱크에 적극적인 개인만의 구성에서 수영 zebrafish의 rheotactic 행동을 평가 합니다.

정렬 방법 탐구 소설 환경²¹개인 사전 및 사후의 다른 경향을 기반으로 합니다. 특히, 우리는 밝고 어두운 측면^17,19,,2021 (그림 3)으로 분할 하는 탱크를 사용 합니다. 동물 어두운 면에 acclimated 됩니다. 밝은 면에 대 한 액세스는 열려, 사전 개인 반응 물고기 어두운 탱크 두지 않는다 동안 새로운 환경을 탐구 하는 탱크의 어두운 절반을 신속 하 게 종료 하는 경향이.

프로토콜

다음 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 대학의 나폴리 페데리코 II, 나폴리, 이탈리아 (2015)의 위원회에 의해 승인 되었습니다.

1. 동물 유지 보수

1. 적어도 200 L 탱크를 사용 하 여 각 탱크에 남녀의 적어도 50 개인의 떼를.
   참고: 탱크에 있는 물고기의 밀도 한 동물 2 L 당 또는 더 낮은 있다. 이러한 조건에서 zebrafish 정상 shoaling 행동을 표시 됩니다.
2. 다음과 같이 유지 관리 조건 설정: 27-28 ° C에서 온도 전도도에 < 500 Μs; pH 6.5-7.5; ₃ 에서 < 0.25 mg/L; 그리고 빛: 다크 photoperiod 10 h:14 h.
   참고: 동일한 보유 조건은 혼합된 인구와 분리 된 사전 및 사후 인구에 사용 되어야 한다.

2. 성격 선택 제 브라에서

1. 준비 하 고 유지 보수 탱크에 사용 같은 물과 조용한 방 (그림 3)에서 성격 선택 탱크를 배치.
2. 위 또는 탱크의 측면에서 비디오 카메라를 배치 합니다. 지역에 있는 모니터를 컴퓨터에 카메라를 연결 탱크와 시각적 접촉입니다.
3. 선택 9 유지 보수 탱크에서 무작위로 물고기 고 knotless 그물을 사용 하 여 성격 선택 탱크의 어두운 면에 그들을 전송.
   참고: 탱크와 최소한 가능한 시간에 물고기와 상호 작용을 제한 하려고 합니다. 잡음과 빠른 움직임을 피하십시오. 필요한 경우 전송 지주 탱크에서 물으로 (약 2 리터) 탱크를 운반 작은 볼륨에서 동물. 동물의 공기 노출을 피하기 위해, 250ml 비 커를 사용 하 고 부드럽게 입력 비 커를 동물을 유도 합니다. 캡처 시간 최소화, 동물에 물리적 손상이 발생할 수 있습니다 하 고 이러한 요소 스트레스를 증가 수 있습니다 그물에 몇 초 동안 물고기를 보유 하지 않습니다 여러 물고기를 수집 하지 않도록 하려고 합니다. 물고기 실험 탱크를 전송 하기 전에 ad libitum 먹여야 합니다. 이 음식을 찾는 행동의 다른 성향에 영향을 개인의 동작 다음 실험²²동안 가능성을 제한 합니다. 하루 중 같은 시간에 복제 실험을 실시 합니다. 이 가능한 circadian 리듬²³기인 실험 그룹의 행동에 변화를 최소화 합니다.
4. 순응의 1 시간 후 슬라이딩 도어를 엽니다.
   참고: 구멍에서 종료 10 분 이내 탱크의 밝은 면을 탐험 하는 개인이 능동적²¹간주 됩니다.
5. 10 분 후 부드럽게 탱크에서 사전 개인을 제거 하 고 사전 유지 보수 탱크에 그들을 전송.
6. 15 분 후 반응²¹여겨지는 어둠 상자에 남아 있는 물고기를 수집 하 고 사후 유지 보수 탱크에 그들을 전송.
   참고: 10 분²¹후 탱크의 밝은 면을 이동 하는 물고기를 삭제 합니다. 섹션 5에서에서 설명 하는 테스트에 필요한 사전 및 사후에 해당 하는 물고기의 원하는 수 수집 될 때까지 한 번에 9 개의 물고기와 성격 테스트를 수행 합니다. 사전 및 사후 개성의 일관성 정기적으로 동일한 접근을 사용 하 여 확인할 수 있습니다.

3. One-dimensional 자기장 조작²⁷ 와 자기장의 설정

1. 전원 장치 (그림 2A)에 전환.
2. Rheotactic 프로토콜 있을 것입니다 위치에 코일된 터널을 배치 수행된 (5 절)만 수영 기구 (그림 2A)에서 분리. 터널 내부 가우스/Teslameter와 연결 된 자석 조사 놓고 터널의 주요 축을 따라 선택 된 자기장 값을 얻기 위해 필요한 어떤 전압을 확인 합니다.
   참고: 솔레노이드의 자기 특성, 필드 이므로 합리적으로 터널; 내 유니폼 이 가로 세로로 프로브를 천천히 이동 하 여 확인할 수 있습니다.
3. 프로브를 분리 하 고 수영 기구를 흐름 터널을 연결.
4. Rheotactic 프로토콜 (5 절)로 시작 합니다.

4. 3 차원 자기장 자기장의 설정 조작²⁷

1. CPU, DAC, 그리고 코일 드라이버 (그림 2B)에 전환.
2. 3 축 (x, y, 및 z)의 각 하나에 선택한 자기 분야를 설정 합니다.
3. 헬름홀츠 쌍 집합의 센터에서 터널을 놓습니다.
4. Rheotactic 프로토콜 (5 절)로 시작 합니다.

5. 테스트의 흐름 챔버에 제 브라 Rheotaxis

1. 1-5 물고기 흐름 터널 측면 및 하단 가려진 2 L 탱크를 사용 하 여 전송.
2. 펌프를 켜고 터널 1.7 c m/s 흐름 속도 설정.
   참고: 천천히 움직이는 물이 산소 터널에 물을 유지 됩니다 그리고 그것은 동물의 복구를 촉진 한다.
3. 1 시간 수영 터널에 적응 하는 동물을 보자.
4. 터널에서 물고기의 동작의 비디오 녹화를 시작 합니다.
   참고: 우리는 원격 제어 (예: Bluetooth) 카메라 (예: 이순신 4 K 작업)을 사용 하 고.mpg (30 프레임/s)로 비디오를 저장.
5. 선택한 실험 프로토콜 (1.3 c m/s;이 연구에 따르면 흐름 율의 stepwise 증가 시작 그림 4)입니다.
   참고: 이 프로토콜을 사용 하 여 zebrafish에 대 한 범위는 0에서 2.8 BL (몸 길이)는 낮은 흐름 속도 / s. 이러한 흐름 속도 zebrafish (3%-15%의 중요 한 수영 속도 [U_크리])²⁴연속 지향된 수영을 유도 하는 흐름 율의 낮은 범위에 있습니다. 낮은 흐름 율 (다음 브렛의 프로토콜²⁵)를 사용 하 여가이 종 물 존재의 독자적인 행동 특성에 연결 된다. Zebrafish 챔버, 물 flow, 존재도 자주, 선회의 주요 축을 따라 수영 하 고 업스트림과 다운스트림^24,26수영 하는 경향이 있다 경향이 있다. 이 동작이 비교적 높은 속도에서 사라지고 물 flow 속도 의해 영향을 (> 8 BL/s)²⁶, 동물 지속적으로 업스트림 (전체 긍정적인 rheotactic 응답)를 직면 하 고 수영 하는 때. 수직 및 횡단 변위 매우 드물다입니다.
6. 형태학 챔버에 물고기의 사진에 (섹스와 총 길이 [TL], 포크 길이 [FL], 또는 BL) 동물의 morphometry를 수행 합니다.
   1. 적절 한 그림을 선택 합니다.
   2. ImageJ에 그림을 엽니다.
   3. 동물의 섹스의 (남성 zebrafish 슬림 하 고 여성 더 반올림 파란색과 흰색 colorings 하는 경향이 동안 노란, 경향이).
   4. 분석 을 클릭 > 설정 규모 와 설정 센티미터, 참고로 터널의 전체 가로 길이 사용 하 여 이미지의 규모.
   5. 분석 을 클릭 > 측정 및 기록 동물의 선형 길이.
   6. 그것의 몸 무게 (BW)를 계산 합니다.
      참고: BW 섹스-플로리다-BW 관계 이전 실험실에서 내장 또는 메타 데이터에서 계산 됩니다. 모든 절차는 동물에 대 한 조작 스트레스를 방지합니다.

6입니다. 비디오 추적

1. 추적기 4.84 비디오 분석 및 모델링 도구와 비디오 파일을 엽니다.
   참고: 필요한 경우, 관점 및 방사형 왜곡 filters를 사용 하 여 비디오 왜곡을 수정 합니다.
2. 상단 메뉴에서 좌표계 에 클릭 하 고 초에 시간 단위를 센티미터 길이 단위를 설정.
3. 클릭 파일 > 가져오기 > 비디오 및 추적기 4.84에 동영상 오픈 중.
4. "좌표 축"에 클릭 하 고 터널 따라 x 축으로 시간이 지남에 따라 물고기의 위치를 추적 하기 위해 참조 시스템 설정. 다운스트림 결말 (에서 물 출구) 벽의 낮은 모서리에 원점을 설정 합니다.
5. 트랙 을 클릭 > 새로 만들기 > 질량의 포인트 와 한 번에 하나의 물고기를 추적 하는 시작. 물고기 각 유량에서 보낸 각 스텝의 마지막 5 분을 추적 합니다.
6. 5 프레임으로 비디오를 수동으로 사전 (0.5 s) 각 업스트림-다운스트림 차례 (UDt, 그림 5에 빨간 점)에 고 각 다운스트림 업스트림 차례 (DUt, 그림 5에서 파란색 점)에서 동물의 위치와 시간을 표시 하 고.
   참고: fish 눈 위치를 사용 하 여 fish의 위치에 대 한 참조로. 점 질량을 사용 하 여 동물의 위치를 추적 합니다. 추적에서 제외-지향 수영 (즉, 작전 시간)의 기간.
7. 각 추적 세션의 끝에 x 값을 선택 하 고 소프트웨어 윈도우의 오른쪽 하단 모서리에 테이블의 값을 시간. 데이터를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 데이터를 복사 를 클릭 하십시오 > 전체 정밀도.
8. 총 업스트림 시간 (Udt와 Dut 간의 모든 간격의 합)와 총 다운스트림 시간 (Dut와 UDt 사이 간격의 합계), 뿐만 아니라 값을 계산 하는 템플릿 스프레드시트 파일에 시간 값과 모든 전환 위치의 x 값을 저장 비율 (RI %)의 rheotactic 인덱스의 각 흐름에 대 한 단계 ( 그림 5참조).
   참고: Rheotactic 동작의 물고기 상류 직면 지출 총 지향된 시간 비율에 의해 계량 (수영 또는 거의 동결 [즉, 그들은 아직도 터널의 하단에 머물]²⁷). 이 비율 RI % (그림 5)로 정의 됩니다.
   

결과

예제 데이터로 선물이 결과 사전 및 사후 shoaling zebrafish¹⁶ 그림 2A (프로토콜의 섹션 3 참조)에 표시 된 설정을 사용 하 여 물 흐름 방향 따라 자기장을 제어. 이러한 결과 어떻게 설명된 프로토콜 응답 서로 다른 개성 가진 물고기에 자기장에 있는 차이 강조할 수를 보여 줍니다. 이러한 실험의 전반적인 개념 물 흐름에 상대적으로 자기장의 방향을 shoaling zebrafish¹⁴에 rheotactic 임계값에 영향을 찾는에 의존 합니다. 따라서, 자기장에 있는 변화는 rheotaxis를 변조, 자기장에 zebrafish의 응답²⁸그들의 사전 또는 사후 성격 따라 다른 경우 평가 하이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

토론

이 연구에서 설명 하는 프로토콜 수 과학자와 같은 2 개의 외부 신호 (물 현재 및 지자기 분야)와 동물의 하나의 내부 요소 간의 통합에서 발생 하는 수생 종의 복잡 한 방향 응답 척도를 성격입니다. 전반적인 개념 서로 다른 개성의 개인을 분리 하 고 별도로 제어 또는 동시에 외부 환경 신호 하는 동안 그들의 오리엔테이션 행동을 조사 하는 과학자를 허용 하는 실험적인 디자인을 만드는 것입니다.

Rheotactic 인덱스 (RI)의 수학적 정의 함께이 연구에서 설명 하는 프로토콜 수영 터널에서 zebrafish의 동작의 예비 관찰을 따라 설계 되었다. 터널에 배치,이 동물 행동 패턴, 모두 부재 또는 물 flow의 존재에 두 가지 유형의 표시: 수영 하 고 작전을 지향. 그들은 중심 시간의 대부분을 보내고 (일반적으로, 물고기 했다 비디오는 시간의 95% 이상 기록) 터널을 따라 수영 (즉, 각도 45 ° 보다 낮은로 긴 축을 따라 중심), 앞 뒤로, 선회 끝 벽과 자주 쉬 thig...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
9500 G 미터	FWBell	N/A	가우스미터, DC-10 kHz; 프로브 해상도:  0.01 μ 티
AD5755-1	Analog Devices	EVAL-AD5755SDZ	쿼드 채널, 16비트, 디지털-아날로그 컨버터
ALR3003D	ELC	3760244880031	DC 이중 조절 전원 공급 장치
BeagleBone Black	Beagleboard.org	N/A	단일 보드 컴퓨터
코일 드라이버	상용	N/A	증폭기(TI의 OPA544)
Helmholtz 쌍	표준		AWG-14 와이어
HMC588L	Honeywell	900405 Rev E	디지털 3 축 자력계
MO99-2506	FWBell	129966	단일 축 자기 프로브
수영 장치	M2M 엔지니어링 맞춤형 과학 장비	N / A	연동 펌프 및 SMC 유량 스위치 유량계로 구성된 수영 장치 디지털 피드백
TECO 278	TECO	N/A	열 크라이오 스태트