여기에서, 우리는 화학요법 유도한 점막염의 모형을 사용하여 소장 상해 및 보상 과증식의 중요한 종점 그리고 증식 마커를 설치하는 프로토콜을 제시합니다. 우리는 세포 주기 특정 마커를 사용하여 작은 장 무게, 토굴 깊이 및 융모 높이를 엔드포인트로 사용하여 증식 세포의 검출을 입증합니다.
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방법 논문
화학요법 유도점막염의 마우스 모형을 사용하여 작은 장 상해 그리고 적응을 평가하기 위하여 중요한 종점 및 증식 마커
이 논문에서
요약
초록
장 적응은 외상으로 인해 창자를 잃을 때 발생하는 자연적인 보상 메커니즘입니다. 토굴 세포 증식 및 증가된 영양소 흡수와 같은 적응 반응은 회복에 매우 중요하지만 제대로 이해되지 않습니다. 적응 반응 뒤에 분자 기계장치를 이해하는 것은 적응을 강화하기 위하여 양분 또는 약의 확인을 촉진하기 위하여 중요합니다. 문헌 전반에 걸쳐 다양한 접근법과 모델이 설명되었지만, 재현 가능한 데이터를 얻기 위해서는 절차를 본질적으로 수행하는 상세한 설명 방법이 필요합니다. 여기서, 우리는 마우스에서 화학요법 유도 점막염의 모형을 사용하여 소장 상해 및 보상 과증식의 중요한 종점 및 증식 마커를 추정하는 방법을 기술합니다. 우리는 세포 주기 특정 마커를 사용하여 증식 세포의 검출뿐만 아니라, 엔드 포인트로 소장 무게, 토굴 깊이 및 융모 높이를 사용하여 보여줍니다. 설명된 방법 내의 중요한 단계 중 일부는 소장의 제거 및 계량과 이 기술의 측정을 위해 제안된 다소 복잡한 소프트웨어 시스템입니다. 이러한 방법은 시간이 많이 걸리지 않으며 비용 효율적이고 수행하기 쉽고 측정하기 쉽다는 장점이 있습니다.
서론
장 적응은 질병 이나 수술로 인해 창 자를 잃었을 때 발생 하는자연 보상 메커니즘 1,2. 외상 후, 창자는 세포 증식 및 증가 된 영양소 흡수를 특징으로하는형태 및 기능적 적응 반응을 겪습니다 3. 이 단계는 복구에 중요 하지만 제대로 이해. 장 적응 반응의 실험 연구는 마우스, 쥐 및 돼지에서 작은 창자 절제 후 발생하는 변화에 초점을 맞추고 있지만, 다른 종류의 부상 (예 : 화학적)에서 적응 반응 뒤에 분자 메커니즘을 이해 또는 세균)은 적응을 향상시키기 위해 영양소 또는 약물의 식별을 용이하게하는 데 중요합니다. 실험적으로, 다른 접근은 조직 병리학 적인 점수를 포함하여 소장 병리학의 복잡한 분자 및 세포 색인을 기술하기 위하여 이용되었습니다 상해의 결과를 측정하. 그럼에도 불구하고, 문헌에서 없는 것은 재현 가능한 데이터를 얻는 데 필요한 절차를 수행하는 방법에 대한 자세한 설명입니다. 창자 호르몬과 같은 적응에 관여하는 요인을 식별할 때, 쉽고, 저렴한 비용, 그리고 재현 가능한 동물 모형은 보증되고 여기에서 우리는 화학요법 유도한 장 점막염 (CIM)의 모형을 사용하여 건의합니다.
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프로토콜
기재된 모든 방법은 동물 실험을 관장하는 덴마크 법률의 지침에 따라 수행되었다(1987). 연구는 덴마크 동물 실험 검사 (2013-15-2934-00833)와 지역 윤리위원회의 허가로 수행되었습니다.
참고 : 여성 C57BL / 6J 마우스 (~ 20−25g)를 획득하고 물과 표준 차우에 무료로 액세스 할 수있는 표준 12 시간 빛, 12 시간 다크 사이클에서 케이지 당 8 개 보관했습니다. 동물들은 실험이 시작되기 1주일 전에 적응하도록 방치하였다.
1. 5-플루오로라실을 이용한 점막염 유도
- 50 mg/mL 용액에 5-플루오로라실(5-FU)을 구하십시오.
- 마우스의 체중을 계량하고 기록합니다. 체중에서 주사를 위한 5-FU의 양을 계산합니다(예: 400 mg/kg).
- 27G x 30mm 바늘에 연결된 1 mL 주사기를 준비하고 주사기를 주입을 위해 계산된 양인 5-FU로 채웁니다.
- 스크러프 방법으로 마우스를 억제합니다. 이렇게 하려면 한 손으로 꼬리의 베이스를 잡고 와이어 바 뚜껑과 같은 발가락 그립 표면에 놓습니다. 한 손으로 꼬리를 포지셔닝하는 동안, 다른 손으로 목 덜미를 잡습니다.
- 가능한 한 집게....
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결과
첫 번째 실험에서, 우리는 0일째에 마우스에서 점막염을 유도하고 5일 연속으로 매일 마우스 그룹을 희생하였다. SI 중량을 측정할 때, 우리는 이 파라미터가 2일째부터 4일째까지 감소하여 장세포 질량의 손실을 시사한다는 것을 발견했습니다. 우리는 또한 5일째에, SI 체중이 0일째(미처리 마우스)와유의한 다르지 않다는 것을 발견하였다(도 1). BrdU의 혼입에 의해 측정된 증식은 1일째와 2일째에 거의 폐지되었지만, 4일째와 5일째에는 각각 약 4배및 5배의 증식이 있었습니다(그림 2). 이러한 과확산은 또한 토굴 깊이를 측정할 때 예시되었다(도 3). 토굴 깊이를 측정하여 설명되지 않는 것은 1일째와 2일째에 증식세포의 손실이며, 여기서 토굴 깊이는 약 13% 감소되었지만 건강한 마우스와 크게 다르지 않았다........
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토론
여기서, 우리는 마우스 모델에서 SI 부상 및 재생을 연구하기 위해 널리 접근 가능한 방법을 입증한다. 장 손상의 다양한 전임상 동물 모델이 존재하지만, 각 모델이 고유하고 끝점이 연구 질문에 대답하는 것이 적절해야 한다는 것을 이해하는 것이 중요합니다. 이 모델은 부상에 대한 적응 반응을 연구하는 것이 우수하지만 점막염의 전 임상 모델로 모델을 사용할 때 끝점을 수정해야합니다. 그러나 동물 모델에서 환자로의 번역은23에도전적입니다. SI 중량 및 증식의 우리의 제안된 종점은 적응 반응의 연구로만 제한되어야 합니다. 내인성 요인의 연구는 수시로 형질전환 마우스의 사용을 요구하고, 마우스 1에서 작은창자 절제술이 가능하더라도, 이 모형은 수술 후 사망을 피하기 위하여 대안일 수 있었습니다. 이 모델을 형질전환 마우스에 적용할 때, 쥐를 주의 깊게 관찰하고 매일 그들의 무게를 감시하는 것이 중요합니다. 이 연구 기간 동안, 마우스의 일부 최대 체중.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 기본 신진 대사 연구를위한 노보 노디스크 센터와 룬드벡 재단의 무제한 보조금에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 5-Fluorouracil | Hospira Nordic AB, 스웨덴 | 137853 | |
| Ketaminol® Vet | Merck, 미국 뉴저지 | 511485 | |
| Rompun® 수의사 Xylazine | Rompunvet, 바이엘, 레버쿠젠, 독일. | ||
| 10% 해상 포르말린 완충액 | Cell Path Ltd, Powys, 영국 | BAF-5000-08A | |
| HistoClear | National Diagnostics, 영국 | HS-200 | |
| Pertex | HistoLab®, 스웨덴 | 840 | |
| BrdU | Sigma-Aldrich, 독일. | B5002 | |
| Tris/EDTA pH 9 버퍼 | Thermofisher scientific, 덴마크 | TA-125-PM4X | |
| 과산화물 블록 | Ultravision Quanto 마우스 키트, Thermofisher Scientific, 덴마크 | TL-060-QHDM | |
| 설치류 블록 버퍼 | Ultravision Quanto Mouse on Mouse 키트, Thermofisher Scientific, 덴마크 | TL-060-QHDM | |
| 단클론 마우스 anti-BrdU 항체 | Thermofisher Scientific, 덴마크. | MA1-81890 | |
| 실험실 비전 항체 희석제 OP Quanto | Thermofisher Scientific, 덴마크. | TA-125-ADQ | |
| 양고추냉이 과산화효소 | Ultravision Quanto 마우스 온 마우스 키트, Thermofisher Scientific, 덴마크 | TL-060-QHDM | |
| DAB Quanto 기판 | DAB 기판 키트, Thermofisher Scientific, 덴마크 | TA-125-QHDX | |
| DAB Quanto Chromogen | DAB 기판 키트, Thermofisher Scientific, 덴마크 | TA-125-QHDX | |
| Zen Lite 소프트웨어(블루 에디션) | Carl Zeiss A/S | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html | |
| ImageJ Software | LOCI, 위스콘신 | https://imagej.nih.gov/ij/ |
참고문헌
- Weinstein, L. D., Shoemaker, C. P., Hersh, T., Wright, H. K. Enhanced intestinal absorption after small bowel resection in man. The Archives of Surgery. 99 (5), 560-562 (1969).
- Helmrath, M. A., VanderKolk, W. E., Can, G., Erwin, C. R., Warner, B. W.
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재인쇄 및 허가
