성인 해마 신경 전구세포의 회로 특정 조절 을 시술

성체 신경 발생은 새로운 뉴런이 성인에서 태어나 기존 신경망에통합되는 생물학적 과정입니다 1. 인간에서는, 이 프로세스는 해마의 치과 gyrus (DG)에서, 대략 1,400의새로운 세포가 매일 2 에서 태어난 곳에 생깁니다. 이 세포는 신경성 틈새 시장을 품고 있는 DG의 안쪽 부분에, 상체 지역 (SGZ)에게 불려 있습니다. 여기서, 해마 성인 신경 줄기 세포 (NSC)는 학습 및 기억, 기분 조절 및 스트레스 반응을 포함하여 특정 뇌 기능의 조절에 기여하는 완전한 기능의 뉴런이되기 위한 복잡한 발달 과정을 거칩니다^{3 ,4},^5,6. 행동에 영향을 미치기 위하여는, 성숙한 CSCs는 현지 및 원위 화학 단서의 배열에 반응하여 활동 의존적인 방식으로 각종 외부 자극에 의해 높게 통제됩니다. 이러한 화학 단서 신경 전달 물질 및 신경 변조기 를 포함 하 고 다양 한 뇌 영역에서 회로 특정 방식으로 행동. 중요한 것은, NSC에 이러한 화학 큐의 회로 넓은 수렴은 줄기 세포 활성화, 분화 및 운명 결정의 독특하고 정확한 조절을 허용합니다.

생체 내에서 성인 NSC의 회로 조절을 심문하는 가장 효과적인 방법 중 하나는 면역 형광 분석을 회로 폭 넓은 조작과 페어링하는 것입니다. 성인 신경전의 면역 형광 분석은 일반적으로 이용되는 기술입니다, 여기서 특정 분자 마커에 대하여 항체는 성인 신경침판의 발달 단계를 표시하기 위하여 이용됩니다. 이들 마커는 다음을 포함한다: 방사형 신경교세포 및 초기 신경 전구 마커로서 네스테인, 중간 전구 마커로서 Tbr2, 및 뉴라블라스트 및 미성숙 뉴런 마커로서 dcx^7. 부가적으로, BrdU, CidU, Idu 및 Edu와 같은 티미딘 유사체를 투여함으로써, S상을 겪고 있는세포 집단은 개별적으로 표지되고 가시화될 수 있다 8,^9,10. 이 두 접근을 결합하여, 각종 단서가 NSC 분화 및 신경 발생에 어떻게 영향을 미치는지에, 특정 발달 단계에서 증식이 어떻게 통제되는지에 이르기까지 광범위한 질문을 조사할 수 있습니다.

전기 자극, 광유전학 및 화학 유전학을 포함하여 신경 회로를 효과적으로 조작하기 위해 여러 가지 옵션이 존재하며, 각각 자신의 장점과 단점이 있습니다. 전기 자극은 전극이 나중에 표적으로 한 두뇌 지구를 조절하기 위하여 전기 신호를 전송하기 위하여 이용되는 특정 두뇌 지구에 이식되는 광대한 수술을 관련시킵니다. 그러나, 이 접근은 세포와 회로 특이성이 둘 다 결여합니다. 광유전학은 이식된 광섬유를 통해 방출되는 레이저에 의해 자극되는 광 활성화 수용체를 인코딩하는 바이러스 입자의 전달을 수반하지만, 광범위한 조작, 큰 비용 및 복잡한 수술이 필요하다^11. 화학 유전학은 디자이너 약물 또는 DREADDs에 의해 독점적으로 활성화 된 디자이너 수용체를 인코딩하는 바이러스 입자의 전달을 포함하며, 이는 클로자핀 N-산화물 (CNO)^12로 알려진 특정 및 생물학적 불활성 리간드에 의해 이후에 활성화됩니다. . DREADDs를 활용하여 성인 NSC를 조절하는 로컬 신경 회로를 조작하는 장점은 CNO 관리의 용이성과 다양한 경로에 있습니다. 이를 통해 동물 취급이 감소되어 시간이 덜 소요되는 접근 방식을 사용할 수 있으며, 이는 신경 회로를 조절하기 위한 장기 연구에 쉽게 적용 가능합니다.

이 프로토콜에 기술된 접근법은 면역형광 기술과 회로 조작을 모두 결합한 성인 해마 신경 발생의 회로 조절을 성공적으로 심문하는 데 필요한 다양한 프로토콜의 포괄적인 모음입니다. 화학 유전학을 사용하여. 다음 프로토콜에 기재된 방법은 성인 신경 발생에 대한 그들의 조절 기능을 결정하기 위해 생체 내에서 동시에 하나 또는 다중 회로를 자극하거나 억제하는 데 적합하다. 이 방법은 질문에 높은 수준의 시간적 해상도가 필요하지 않은 경우에 가장 적합합니다. 특정 주파수에서 자극 /억제의 정확한 시간적 제어를 필요로하는 질문은 광유전학^13,14를사용하여 더 잘 해결할 수 있습니다. 여기에 설명된 접근법은 스트레스가 주요 관심사인 특히 최소한의 동물 취급으로 장기적인 연구에 쉽게 적용됩니다.

동물 과목을 포함한 모든 절차는 노스 캐롤라이나 채플 힐 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. 바이러스 성 입자의 입체 적 주입

1. 문제의 신경 회로를 결정합니다. 이것은 다음 절차에 사용되는 바이러스 및 마우스 라인을 결정합니다.
   참고: 이 예에서는, 반대 이끼 세포 돌기는 성인 신경 발생에 대한 그것의 효력을 분석하기 위하여 자극됩니다. AAV5-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry를 인코딩하는 바이러스 입자는 5ht2A-Cre^{마우스(15)의}DG로 전달된다.
2. 멜록시캄 (5 mg/kg, 피하) 적어도 30 분 사전 수술8 주 된 남성 이종 2A-Cre 마우스에 선제 진통을 제공 하.
3. 호흡속도가 느려지고 마우스가 이소플루란 챔버를 사용하여 의식을 잃을 때까지 4% 이소플루란 산소 혼합물을 사용하여 마우스를 마취시다. 발가락이 반응하지 않도록 마우스를 꼬집습니다.
4. 마우스를 스테레오탁에 놓고 열 조절을 위해 작은 동물 난방 패드에 놓고 각 눈에 눈 윤활유를 바르습니다. 동물이 스테레오탁스 안에 들어가면 이소플루란을 1.5%로 줄입니다.
   참고: 이 단계에서 이어 바 배치가 중요합니다. 이어바를 배치한 후 머리가 수평이 되었는지 확인합니다. 더 자세한 지침은 가이거 외^16에서찾을 수 있습니다.
5. 제모 제품을 머리에 놓고 최대 1분 동안 앉게 하십시오. 에탄올 와이프로 머리를 닦아 머리카락을 제거합니다. 머리카락이 완전히 제거되지 않은 경우 머리 의 상단이 털이 없을 때까지이 과정을 반복하십시오.
6. 포비도 요오드 용액으로 털이 없는 부위를 적어도 3 회 소독하십시오.
7. 머리의 털이없는 피부에 국소 리도카인 용액을 놓고 1 분 동안 기다립니다. 머리에서 국소 리도카인을 제거하고 수술 메스를 사용하여 약 2mm의 귀 시작까지 눈의 시작에서 머리에 작은 절개를합니다.
   참고: 발가락은 절개를 하기 전에 완전히 진정되도록 마우스를 꼬집습니다.
8. 두피를 철회하고 bregma가 쉽게 식별 될 때까지 멸균 된 면봉을 사용하여 머리 상단의 결합 조직을 청소하십시오.
9. 브레그마를 찾아 머리를 조정하여 브레그마와 람다는 양쪽 좌표에 드릴을 배치하고 정렬되도록 하여 브레그마와 람다모두 같은 평면에 있도록 합니다. 또한 브레그마와 람다 사이의 영역의 왼쪽/오른쪽에 드릴을 배치하여 왼쪽 및 오른쪽 반구를 정렬합니다.
   참고: 이 단계는 매우 중요합니다. 부적절하게 정렬된 헤드 배치는 입체 좌표를 방해합니다.
10. 0.5mm 드릴 비트를 사용하여 bregma에서 다음 좌표에서 드릴: 전방 후방 축(AP) -2.00 mm, 내측 축(ML) +1.50 mm. 직경 드릴 구멍에서 0.5mm ~ 1mm를 만듭니다.
    참고: 해당 회로에 특정한 좌표를 사용하여 이 단계를 수정합니다. 이 예는 이끼 세포를 포함하는 일방적인 치과 gyrus를 표적으로 하고 반대측에 성숙한 신경 줄기 세포에 그들의 효력을 결정합니다.
11. 드릴을 5 μL 주사기 및 26−33 G 바늘로 전환합니다. bregma에서 0을 한 다음 전방 후방 축 -2.00 mm, 내측 측축 -1.50 mm, 등쪽 복부 축 -2.3 mm의 드릴 구멍에 바늘을 배치하여 다음 좌표에 주입합니다.
12. 주입 펌프를 사용하여 50-100 nL/min에서 바이러스 코어 또는 상업적 공급원으로부터 적절한 반구로 아데노 관련 바이러스(AAV)의 500 nL을 주입합니다(재료 표). 천천히 뇌에서 바늘을 제거하기 전에 적어도 5 분 포스트 주입을 기다립니다.
    참고: 이러한 좌표는 마우스의 수명과 크기에 따라 조정이 필요할 수 있습니다. 특정 바이러스 혈청형은 상이한 확산 패턴을 가지며, 완전한 실험 전에 바이러스 확산을 시험하기 위한 파일럿 실험을 수행하는 것이 가장 좋습니다.
13. 식염수를 사용하여 절개 주위의 두피와 피부를 깨끗하게 한 다음, 핀셋으로 피부를 잡고 조직 접착제 (재료표)를사용하여 절개를 밀봉합니다. 마우스가 활성화 될 때까지 가열 패드에서 회복 하는 동안 모니터링 등 모든 수술 후 절차를 수행, 상처에 진통을 적용, 그리고 2 일 동안 진통제를 관리.
    참고: 많은 실험은 적절한 바이러스 발현을 위해 바이러스 주입 후 2-4 주 대기 시간이 필요합니다.

2. 클로자핀 N-산화물 관리

1. 디메틸 설폭사이드(DMSO) 및 와류의 100 μL에 10 mg의 CNO를 용해시킴으로써 스톡 CNO 용액을 준비한다.
   참고: 용액이 완전히 용해되지 않으면 DMSO의 부피를 증가시키지만 DMSO가 너무 많으면 물이 쓰라질 수 있습니다. CNO 물 용액에서 0.1% DMSO를 초과하거나 200 mL 용액의 경우 200 μL 이상의 DMSO를 초과하지 마십시오. CNO 스톡 솔루션은 최대 2주 동안 -20°C에서 보관할 수 있습니다.
2. 1-5 mg/200 mL의 최종 농도를 위해 물 200 mL마다 10-50 μL 의 10-50 μL을 추가하십시오. 매일 신선한 CNO 물 혼합물을 준비합니다.
   참고: 일부 그룹은 생쥐가 마시는 것을 자제하는 경우 쓴 맛을 가리기 위해 물에 있는 사카린을 최대 1%까지 보충했습니다. 조사된 회로는 활성화 정도에 따라 상이한 반응을 보였다. 일반적으로, 1 mg CNO/200 mL은 대부분의 회로를 자극하기에 충분하다^17.
3. 4일의 기간 동안 1.13단계에서 스테레오택 주사로부터 회수한 후 2주 후에 마우스에 투여할 때, CNO 용액을 호일 커버 또는 가벼운 보호 용기에 놓는다.
   참고: CNO는 빛에 민감합니다. 전체 공정 중에 빛에 대한 노출을 줄입니다.
4. 신선한 CNO 솔루션을 준비할 때 매일 소비된 CNO 물 용액을 측정하고 기록합니다. 평균적으로, 성인 마우스는 CNO 물 혼합물의 약 4 mL를 소비합니다. 또한, 매일 마우스 무게를 기록하여 마시고 있는지 확인하십시오.
5. 각 실험에 적절한 컨트롤이 활용되었는지 확인합니다. CNO 및 DREADD 컨트롤을 모두 포함합니다. 실험 적 설정의 예는 다음과 같습니다 : (1) 차량 + 자율 수륙 양용 차량 (AAV) 바이러스 리포터 가 없는 드레드, (2) 바이러스 리포터가없는 CNO + AAV, 및 (3) CNO + AAV DREADD.
   참고: 모든 그룹에는 솔루션에 DMSO가 포함됩니다. 동물이 0.1% 미만의 DMSO를 수신하기 때문에 DMSO 대조군은 포함되지 않으며, 이는 마우스에서 성인 신경 줄기 세포에 악영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 음용수에서 DMSO 사용에 대한 우려가 있는 경우 DMSO 및 식염수 제어를 추가하지 않습니다.

3. 티미딘 아날로그 라벨링

1. 조직 수집 일에, CNO를 투여 한 후 4 일, 일련의 티미딘 아날로그, 5-에티닐-2'-데옥시수리딘(Edu) 복강 내 주사를 수행함으로써 세포를 증식시키는 라벨을 붙였다.
   참고: 이 프로토콜은 Edu를 활용합니다. 그러나 Brdu, Idu 및 Cidu^8을포함하여 증식하는 세포 집단에 효율적으로 라벨을 붙일 수 있는 몇 가지 티미딘 유사체가 있습니다.
   1. 에듀의 무게를 측정하고 4 mg/mL에서 염화나트륨 주입 용액을 15분 동안 로터에 놓고 수의학적 등급0.9%에 용해시다.
      참고: 티미딘 유사체는 독성이 있고 빛에 민감합니다. 알루미늄 호일을 사용하여 빛 노출에서 처리 및 커버 솔루션을 처리 할 때 재료 안전 데이터 시트 (MSDS)를 따르십시오.
   2. 에듀를 40 mg/kg 또는 0.1 mL/10 g의 체중4 mg/mL 에듀 용액의 4회마다 2시간씩 투여하십시오.
      참고: 위의 복용량 50 mg/kg 포화 수준 근처 도달 하 고 크게 표시 된 증식 세포의 양을 증가 하지 않습니다^18. 부적절한 라벨이 결과를 왜곡 할 수 있기 때문에 모든 마우스가 동일한 양의 Edu 주사를받는 것이 중요합니다.

4. 조직 준비 및 처리

1. 마지막 Edu 주입 후 2 시간, 호흡이 크게 감소 될 때까지 이소플루란 챔버를 사용하여 마우스를 마취하고 완전히 진정되도록 발가락 핀치.
2. 바늘을 사용하여 표면에 마우스를 고정하고 심장을 노출 작은 절개를합니다. 왼쪽 대동맥에 25G 바늘을 삽입하고 간 조직이 제거 될 때까지 1-4 mL / min의 유량으로 인산완충 식염수 (PBS) 용액으로 수페리어 관류를 위해 우심실을 잘라냅니다.
3. 관류 용액을 4% 파라포름알데히드(PFA)로 전환하고 뇌 조직을 고치기 위해 약 15-20 mL를 주입합니다.
   참고: 관류 과정에 대한 자세한 지침은 게이지 외^19에서찾을 수 있습니다. 동물의 떨림이 제대로 수행되면 관찰됩니다.
4. 큰 가위를 사용하여 머리를 제거 한 다음 두개골에서 뇌를 해방하기 위해 주의 절개 일련의 수행. 뇌 조직을 4°C에서 4% PFA에 저장하여 밤새 고정을 계속합니다.
5. 4% PFA 용액에서 뇌 조직을 제거하고 4 °C에서 24 시간 동안 냉동 보호 조직에 PBS에서 10 % 자당 용액에 놓습니다. 이어서 절편하기 전에 4°C에서 다른 24시간 동안 30% 자당 PBS 용액으로 조직을 이체한다.
   참고: 뇌 조직은 마이크로 토메 절편을 위한 준비가 되면 자당에서 가라앉을 것입니다. 뇌 조직은 30 % 자당에 장기적으로 저장할 수 있습니다.
6. 섹션 뇌 조직 40 μm 섹션에서 관상 마이크로 톤으로 사용. bregma에서 약 -1.20 mm의 치과 자이러스의 시작 부분에서 시작하여 첫 번째 섹션이 가장 앞쪽이고 마지막 섹션이 가장 후방인 것으로 끝난 후 끝나는 섹션을 수집합니다. 마우스 뇌 아틀라스를 참조하여 DG 및 시작 조직 수집 좌표를 정확하게 식별합니다.
7. 부동액으로 채워진 48개의 웰 플레이트에 각 섹션을 6행으로 직렬로 저장합니다(표 1).

표 1: 면역화학에 활용된 용액.

5. 면역 화학

1. 기본 부동 프로토콜
   참고: 네스트인을 염색하는 경우 섹션 5.1을 건너뛰고 섹션 5.2로 진행합니다. 기본 부동 프로토콜은 티미딘 아날로그 에듀 염색없이 Tbr2 또는 더블 코르틴 (DCX)에 대한 것입니다.
   1. 부동액 용액에서 트리스 버퍼링 식염수(TBS)로 단면을 48웰 플레이트의 직렬 순서로 전송합니다.
   2. TBS-트리톤(0.05% TBS-트리톤, 표1)에서 2회 세척하여 매번 용액을 흡입하여 5분 동안 흔들어 주거나 저속으로 로커를 세척합니다.
   3. 느린 속도로 흔들면서 20-30 분 동안 투과 버퍼 (0.5 % TBS 트리톤, 표1)를 사용하여 섹션을 투과합니다.
   4. TBS 트리톤의 10 mL에 당나귀 혈청 0.33 μL을 추가하여 차단 버퍼를 만듭니다. 신선하게 만들고 3 일 이내에 사용하십시오.
   5. 흡히전성 토메빌화 버퍼 및 실온(RT)에서 30분 내지 1시간 동안 차단 버퍼의 섹션인 배양한다.
   6. 블로킹 버퍼에서 1 차 항체 용액을 만들고 각 우물에 추가하십시오. 500 μL/well은 모든 조직 섹션이 완전히 침수되기에 충분합니다. 로커 나 셰이커에 RT에서 하룻밤 배양.
   7. 1차 항체의 흔적을 제거하기 위해 각각 10분 동안 TBS-트리톤 3x에서 흡인 용액 및 헹구기 단면도.
   8. 로커상에서 RT에서 2시간 동안 블로킹 완충액으로 제조된 1차 항체에 대해 불소공 에서 2차 항체를 인큐베이션한다.
   9. TBS-트리톤에서 각각 5분 동안 3x세척한 다음 4′,6-디아미디노-2-페니린들(DAPI) 용액(1:100에서 300 μM 용액)으로 15분 동안 PBS에서 희석하여 배양합니다.
   10. PBS에서 3x 섹션을 세척하고 양전하 슬라이드에서 전방에서 후방까지 직렬 순서를 유지하면서 섹션을 장착합니다. 수분이 눈에 띄게 사라질 때까지 RT에서 티슈를 건조시키세요(보통 약 2-5분) 마운팅 매체로 덮이기 전에 말립니다.
2. 항원 회수
   참고: 이 섹션은 네스트인에만 필요합니다. 네스테인을 염색하는 경우, 티미딘 유사 염색 전에 이 섹션을 수행한다(섹션 5.3). Edu로 Tbr2 또는 DCX 염색을 건너뜁니다.
   1. PBS에 조직 섹션을 놓고 전방에서 후방까지 직렬 주문을 유지하는 양전하 슬라이드에 5−8 섹션을 장착합니다. 티슈 섹션이 RT에서 건조되어 슬라이드에 완전히 부착되어 약 2-5 분 정도 걸립니다.
   2. 구연산염 버퍼(표 1)를 용기에 준비하고, 보통 1,000 μL 파이펫 팁 박스를 준비한다.
   3. 용액이 끓을 때까지 전자 레인지 (1,000W)에서 구연산염 완충액을 5 분 동안 가열하십시오. 용액이 가열되는 동안 20슬라이드 유리 슬라이드 홀더에 장착된 섹션을 배치합니다. 5분 후, 슬라이드 홀더를 피펫 박스에 조심스럽게 넣습니다.
   4. 전자레인지 전원을 50%로 설정하고 7분 동안 조리합니다. 이 7 분 동안 용액이 끓기 시작하면 전자 레인지를 멈추고 끓인 후 전자 레인지를 계속하십시오.
      참고: 이 단계의 목표는 수온을 끓는 온도 바로 아래 7분 동안 유지하는 것입니다. 자세한 지침은 후세이니 외^20에서찾을 수 있습니다.
   5. 시산염 완충제와 티슈 슬라이드로 따뜻한 상자를 꺼내 얼음 양동이에 놓아 식힙니다. 얼음이나 다른 물질이 용액에 들어가지 않도록 덮습니다. 약 30분 동안 기다리거나 용액이 원만질 때까지 기다립니다.
   6. 티미딘 아날로그를 사용하는 경우 5.3.2 단계로 진행한다.
3. 티미딘 아날로그 염색
   참고: 에듀와 Tbr2 또는 에듀와 DCX를 염색하는 경우 여기에서 시작합니다.
   1. PBS에 조직 섹션을 배치하고 전방에서 후방과 동일한 방향으로 직렬 순서를 유지 양전하 슬라이드에 5−8 섹션을 마운트합니다. 티슈 섹션이 건조되어 슬라이드에 완전히 부착한 다음 소수성 펜이나 PAP 펜을 사용하여 테두리를 그립니다.
   2. 20-30 분 동안 투과 버퍼 (0.5 % TBS-트리톤)로 섹션을 투과시하십시오. 그런 다음 TBS 트리톤을 사용하여 2x 를 각각 5 분 동안 씻으소서.
      참고: 투과율은 세포내 항체 침투를 돕습니다. 투과 시간은 조직 두께 및 항체 효율에 따라 조정할 수 있습니다. 양자 택일로, 하나는 투과 효능을 증가 세제 농도를 증가시킬 수있다. 그러나 조직 취약성이 장기간 투과 시간으로 증가하기 때문에 너무 오래 투과하지 않도록주의해야합니다.
   3. 표1에 따라 에듀 반응 용액을 준비한다. Alexa488-아지드의 최종 농도는 에듀 반응 용액의 1 mL에서 15 μM이다.
   4. 에듀 반응 용액에서 30 분 내지 1 시간 동안 인큐베이션한 다음 TBS 트리톤에서 각각 5 분 동안 3x를 세척합니다. 이 단계 후 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일에 슬라이드를 덮습니다. 이 단계에서 Edu 반응이 형광 현미경을 사용하여 작동하는지 확인합니다. Edu 표지된 세포는 epifluorescence 현미경의 밑에 형광할 것입니다.
4. 장착 된 조직 섹션 프로토콜
   1. 블록 조직 섹션은 이차 항체와 동일한 동물에서 제기된 차단 완충제를 사용하여 5.3.4 단계로부터 슬라이드상에 장착되고, 예를 들어, 당나귀 혈청은 30 분 내지 1 시간 동안, 그리고 TBS 트리톤에서 각각 5 분 동안 2x를 세척한다.
   2. 1:200에서 1차 항체를 차단 완충액에 혼합하여 차단 단계 동안 1차 항체(즉, 닭안티네신) 용액을 준비한다. 슬라이드 당 250 μL은 조직이 용액에 완전히 잠기도록하기에 충분합니다.
   3. 세정을 차단한 후 RT에서 하룻밤 동안 1차 항체 용액에서 조직 절편을 배양한다. 사용된 1차 항체에 따라 이 단계를 수정한다.
      참고: 항체가 높은 배경 또는 비특이적 결합을 가지고 있는 경우, RT 대신 4°C에서 배양하면 결과를 향상시킬 수 있다. 조직 침투가 불량한 항체는 필요한 경우 2일 동안 배양하도록 방치될 수 있다.
   4. TBS-트리톤에서 3x 의 조직 섹션을 5분 동안 배양하여 과잉 원발성 항체를 제거하였다. 이어서 불소 공액이 있는 이차 항체(즉, 1:200에서 알렉사 647 항닭)에서 조직 절편을 인큐베이션하여 RT에서 2시간 동안 완충액을 차단하여 제조하였다.
   5. TBS-트리톤에서 3x 의 조직 섹션을 5분 동안 배양하여 과잉 이차 항체를 제거하고 RT에서 15분 동안 PBS에서 1:100에서 300 μM DAPI 용액을 적용합니다.
   6. PBS에서 3x 배양하여 5분 동안 배양하여 과도한 DAPI를 제거하고 면봉 또는 섬세한 작업 와이프를 사용하여 조직 주위에서 pap 펜 원을 제거합니다. 섹션을 건조시키고 마운팅 매체와 커버 슬립을 적용합니다. 이미징 슬라이드 전에 마운팅 매체를 건조시키십시오.

6. 이미지 컬렉션

1. 1 μm 스텝 크기에서 40x 오일 배율 광학 렌즈 또는1 μm에서 20x 2x 줌으로 공초점 현미경 (재료 표)을 사용하여 슬라이드 라벨과 이미지를 DG의 동일한 면을 덮어 대조군으로부터 맹인 실험군.
   참고: 40x 오일 배율은 해상도를 높이지만 20x 2배 줌보다 오래 걸릴 수 있습니다.
2. 대물 렌즈를 40x로 설정한 다음 공초점 소프트웨어(재료표)의왼쪽 상단 모서리에 있는 위치 탭을 클릭하고 시야 중간에 원하는 DG 섹션을 설정합니다.
3. DG를 찾아 왼쪽 상단 모서리의 수집 탭으로 전환한 다음 Z스택, 타일 스캔및 위치의다음 확인란을 선택합니다.
4. 600-750 게인, 1%-15% 레이저 강도 및 1−10 오프셋 사이의 채널 설정을 설정합니다. 어떤 채널에 대해도 20%의 레이저 강도를 초과하지 마십시오. 게인과 강도를 설정할 때 픽셀의 과포화가 발생하지 않도록 합니다.
   참고: 이러한 범위는 활용된 장비의 효율및 염색 효율에 따라 달라질 수 있다.
5. 타일 스캔 창에서 타일을 가로 7세로 설정하고 현재 사용 중인 것과 동일한 설정을 사용하여 스캔 개요 이미지를 누릅니다. 예를 들어 가로 7x 3세로, 2x 확대/축소가 있는 20x 목표를 사용합니다.
6. 개요 스캔 후 DG가 예상이미지 내에 완전히 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 DG가 얻을 대표적인 이미지이므로 개요 이미지에 완전히 있을 때까지 DG의 뷰를 조정합니다.
7. 미세 초점 노브를 사용하여 다른 Z 스택을 스크롤하여 이미징 깊이를 설정합니다. 전체 DG가 시작 점과 끝점 내에 있는지 확인합니다. 단계 크기가 1 μm라고 가정하면 각 이미지는 약 40단계여야 합니다.
8. 양방향 스캐닝이 없고 수집 모드 창에서 평균이 없는 스캔 속도를 9로 설정합니다. 그런 다음 위치 창에 위치를 추가합니다.
   참고: 6.3-6.8 단계를 반복하여 여러 DG를 한 번에 이미지화합니다. 스캔 속도를 높이면 이미지 품질이 저하되지만 전체 이미징 시간이 줄어듭니다. 이미지 품질이 너무 낮으면 스캔 속도를 줄이거나 평균을 높입니다.
9. 준비가 되면 실험 시작 버튼을 클릭합니다. 마우스당 DG 의 5개 섹션을 후방 축으로 앞쪽으로 스캔합니다. 예를 들어 왼쪽 DG가 섹션 1에 대해 이미지된 경우 다음으로 가장 많은 후면이 섹션 2에 DG를 왼쪽으로 남겨둔 이미지입니다.
10. 공초점 소프트웨어의 공정 탭 아래의 스티치 기능을 사용하여 치과 자이러스의 전체 이미지를 형성하기 위해 별도의 이미지를 함께 스티치합니다. 또는 FIJI(ImageJ)를 사용하여 이미지를 함께 스티치하여 완전한 치과 자이러스를 형성합니다.
11. 정량화를 위해 스티치된 이미지를 저장합니다.

7. 이미지 분석

1. 최대 프로젝션과 채널이 서로 다른 색상으로 병합된 복합 이미지로 FIJI를 사용하여 각 덴테이트 자이러스 섹션의 각 이미지를 열어 쉽게 공동 지역화를 시각화할 수 있습니다.
2. 다각형 선택 도구(왼쪽에서 세 번째 상자)를 사용하여 최대 투영 이미지의 각 섹션에 대한 DG 면적을 측정하고 각 마우스의 각 섹션에 대해 기록합니다. 밀도를 계산하는 데 사용되는 DG 영역입니다.
3. 플러그인 아래에 있는 FIJI 플러그인 셀 카운터를 사용하여 1차 항체(즉, 네스테인) 및 티미딘 아날로그 에듀를 동국화시킨 복합 이미지로부터 DG의 세포 수를 기록 | 분석 | 셀 카운터 | 셀카운터. 또한 방사형 공정을 통해 Edu 양성 및 네스팅 양성 세포의 총 수를 기록합니다.
   참고: 네스트인의 경우 형태에주의를 기울이는 것이 매우 중요합니다. 신경 줄기 세포를 정량화하는 경우 방사형 프로세스가있는 세포만 정량화되었는지 확인하십시오. 덴테이트 자이러스 섹션을 정량화할 때, 특히 초점 평면 외부에서 세포를 시각화할 때 모든 사람에게 동일한 기준을 적용합니다. 세포가 초점 평면 내에 있지 않으면 셀을 계산하지 마십시오. 입체 정량화에 대한 자세한 지침은 West et al.^21을 참조하십시오.
4. 스프레드시트 소프트웨어에 셀 수를 입력하여 나중에 분석을 위해 모든 데이터를 컴파일합니다.
5. 각 동물의 각 섹션에 대한 총 부피로 동지역화된 셀의 총 수를 나누어 각 섹션에 대한 동지역화된 셀의 밀도를 계산합니다. 예를 들어, 한 동물의 네스트틴+/에듀+ 세포의 합을 한 동물의 DG 부피합으로 나누어 줄기 세포 밀도를 얻습니다. 각 단계가 1 μm라고 가정하여 면적에 총 Z 단계 증분을 곱하여 각 단면의 체적을 계산합니다.
   참고: 이 프로토콜에서, 총 단계는 40 μm에서 절편되기 때문에, 40에 가까워야 합니다.
6. 해결하려는 질문에 필요한 추가 계산을 수행합니다. 이 예에서는, 경래 이끼 세포를 자극한 후에 증식 세포, 총 줄기 세포 인구 및 증식줄기 세포의 백분율의 전체 수를 계산합니다.

위에서 설명한 실험 절차에 따라 (도1A,B),우리는 해마 내의 신경성 틈새에 대한 반대 이끼 세포 프로젝션을 자극하는 효과를 결정할 수 있었다. 5-HT2A Cre-line을 표기하는 이끼 세포와 결합된 Cre 의존적 Gq 결합 자극 DREADD 바이러스를 활용하여, 우리는 이끼 세포에서 경진 DG로 의 흥분성 투영을 선택적으로 활성화할 수 있었고 강한 이끼 세포를 결정했습니다. 자극 촉진 줄기 세포 정지 (그림1C). 우리는 조직의 분석 전에 정확한 바이러스 전달을 확인하였다 (도2A,B). 추가적으로, 우리는 c-fos 면역성 화학 실험을 통해 이끼 세포의 활성화를 확인했습니다 (데이터는 도시되지 않음). 부적절한 바이러스 성 주사의 경우 동물을 추가 분석에서 제외하십시오. 부적절한 주입은 원하는 좌표를 타겟팅하지 못하거나, 원하는 영역 밖에서 대부분의 발현을 가지거나, 바이러스 전달이 거의 또는 전혀 없는 것입니다. 이 실험을 위해, DG의 hilus에 있는 이끼 세포는 의도된 표적이고, 주사가 hilus의 외부에 있던 경우에, 그(것)들은 제외되었습니다. 5.2 및 5.3절에 설명된 네스트인 염색에 대한 티미딘 아날로그, 에듀 및 항원 회수를 사용하여 증식하는신경 줄기 세포를 성공적으로 표지할 수 있었습니다(그림 3A). 부가적으로, 항원 회수 단계, 섹션 5.2를 생략함으로써, 우리는 Tbr2 양성 신경 전구 및 신경 아세포, 및DCX 양성 신경 아세포 및 미성숙 뉴런에 라벨을 붙일 수 있었다(그림 3A). 우리는 밀도를 계산하고 슬라이드에 장착 된 조직의 예를 제공하는 데 사용되는 영역의 예를 보여 준다 (그림3B 및 그림 4A). 더욱이, 성공적 및 서브파 실험모두 실험접근법에대한 참고자료로서 제공된다(도 4B). 마지막으로, 성공적인 실험으로부터 얻을 수 있는 여러 가지 상이한정량화가 있다(도 5A-D)15. 정량화에는 증식하는 신경 줄기 세포 (네스티네테 +/Edu+/volume), 증식하는 신경 줄기 세포의 백분율(네스티네이트+/에듀+/총 네스테인), 총 증식 세포(Edu+/volume) 및 총 줄기 세포 풀(네스티인+/부피) 등이 포함됩니다. ). 이끼 세포의 반대 자극시, 신경 줄기 세포 증식의 감소가 관찰되었다. 유사한 정량화는 적절한 항체를 사용하여 신경 전구 및 미성숙 뉴런에 대해 수득될 수 있다.

도 1: 성인 신경 줄기 세포의 분석 회로 조절에 대한 실험적 접근법. (A) 프로토콜에 설명된 다양한 단계를 나타내는 회로도입니다. (B) 설치류에서 이끼 세포를 자극하는 데 사용되는 실험 적 접근법의 타임 라인. (C) 자극을 위한 주사 회로도 표적화 반대 이끼 세포. (D) 상이한 발달 단계에서 사용되는 상응하는 항체를 가진 상체 영역(SGZ), 과립 세포 층(GCL) 및 분자층(ML)에서 성인 신경 줄기 세포의 발달 혈통의 회로도. 상이한 발달 단계는 정지 또는 활성화된 방사형 신경 줄기 세포 (NSC), 신경 전구체 (NP), 신경 아폭세포 (NB), 미성숙 과립 세포 (GC), 및 성숙한 GC를 포함합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 효과적인 바이러스 전달의 데모. (A) 정확한 바이러스 전달의 면역 형광 이미지. 바이러스 성 입자는 hilus (백색 박스 영역)에서 이끼 세포를 대상으로 하는 mCherry 형광 라벨을 발현합니다. DAPI는 세포 핵을 라벨. 정확한 바이러스 전달의 이미지 측면은 반대 측 주사 측에서 명확한 이끼 섬유 투영을 보여줍니다. (B) 표적 바이러스 주사의 면역 형광 이미지. 이 경우 반대 쪽 이끼 섬유는 이미지 쪽에 없습니다. 배율 표시줄 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 증식하는 신경 줄기 세포 및 자손분석. (A) 티미딘 아날로그 에듀의 면역성 화학 이미지는 특정 세포 단계 마커 네스테인 (신경 줄기 세포 및 전구), Tbr2 (신경 줄기 세포, 신경 전구체) 및 DCX (신경 아세포, 미성숙 뉴런)로 표시된 국소화 흰색 화살촉. 스케일 바 = 10μm. (B) 밀도를 계산하는 데 사용되는 치과 자이러스 내의 면적의 대표적인 측정. 배율 표시줄 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 면역 형광 제제의 데모. (A) 전방에서 후방 축으로 장착된 조직 절단의 입체적 분리를 보여주는 회로도. 빨간색 상자는 이미지된 면을 나타냅니다. (B) 뉴런 계보 마커에 대한 성공적이고 서브파 면역형광 실험의 시연. 배율 표시줄 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 이끼 세포의 반대 활성화는 신경 줄기 세포 증식을 감소시다. (A) 덴테이트 자이러스내의 네스테틴+/에듀+ 세포의 면역조직화학 정량화는 반대쪽 이끼 세포의 자극 후 증식의 감소를 입증한다. (B) 활성화 된 반대 이끼 세포를 가진 그룹에서 증식 신경 줄기 세포의 백분율감소. (C) 어느 그룹에서든 신경줄기세포 밀도에 유의한 변화가 없었다. (D) 치과 자이러스에서 증식 세포의 전반적인 수준에 변화가 없었다. 값은 측정의 ± 표준 오차를 나타냅니다. p < 0.05 (n = 컨트롤의 경우 3, hM3D 그룹에 대한 n = 5). 이 그림은 예 외15에서적응되었습니다 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 공개 할 것이 없다.