방법 논문

인간으로 Epigenome 편집 도구의 효율적인 배달 lentiviral 벡터 플랫폼 유도 만능 줄기 세포 유래 질병 모델

DOI:

10.3791/59241

⸱

2019년 3월 29일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Duke University Medical Center, 2Center for Genomic and Computational Biology, Duke University Medical Center, 3Viral Vector Core, Duke University Medical Center, 4Division of Gynecologic Oncology, Department of Obstetrics and Gynecology, Duke University Medical Center

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

타겟 DNA epigenome 나타냅니다 편집 강력한 치료 접근. 이 프로토콜에 설명 합니다 생산, 정화, 그리고 모든-에-하나의 lentiviral 벡터 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)에서 epigenome 편집 응용 프로그램에 대 한 CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene 은닉의 농도-신경 파생.

초록

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HiPSC에서 파생 된 세포를 사용 하 여 인간의 신경 퇴행 성 질환을 연구 하는 귀중 한 접근 방식을 나타냅니다. 여기, 우리는 환자와 파 킨 슨 병 (PD)으로 알파 synuclein 유전자 (SNCA) 로커 스의 triplication에서에서 파생 된 hiPSCs의 분화에 대 한 최적화 된 프로토콜을 설명-관련 dopaminergic 신경 인구. 증거를 축적으로 나타났습니다 SNCA 의 상부는 충족 SNCA 표현의 규제 대상으로 하는 특히 그 PD를 위한 소설 치료 접근을 설치할 필요가 PD. Recognizing의 개발에 대 한 원인이 되는 우리 최근 epigenetically SNCA intron 1 규제 지역에서 메 틸 화 수준의 풍요로운 여 SNCA 전사를 조절 하는 CRISPR/dCas9-DNA 메 틸 화-기반 시스템 개발. 죽은의 구성 된 시스템을 제공 (비활성화) 버전 Cas9의 DNA methyltransferase 효소 3A의 촉매 도메인 (dCas9) 융합 (DNMT3A), lentiviral 벡터 사용 됩니다. 이 시스템 SNCA 로커 스의 triplication와 셀에 적용 되 고 SNCAmRNA와 단백질 수준 SNCA intron 1의 타겟된 DNA 메 틸 화를 통해 약 30% 감소 시킨다. SNCA 레벨의 미세 downregulation 질환 관련 세포 고기를 구출 하 고 현재 프로토콜에서 우리 hiPSCs 신경 조상 세포 (Npc)와 설립 SNCA 에서 메 틸 프로필의 평가 대 한 pyrosequencing 분석 실험의 유효성 검사로 차별화에 대 한 단계별 절차를 설명 하고자 intron 1. 좀 더 자세하게에서이 실험에서 사용 된 lentivirus-CRISPR/dCas9 시스템 개요,이 프로토콜에 설명 합니다 생산, 정화, lentiviral 벡터를 집중 하 고 epigenome 게놈 편집 응용 프로그램을 사용 하 여 그들의 적합성을 강조 하는 방법을 hiPSCs 및 Npc입니다. 프로토콜은 쉽게 적응 그리고 생체 외에서 그리고 vivo에서 응용 프로그램에 대 한 높은 titer lentiviruses를 생산 하는데 사용 될 수 있습니다.

서론

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여러 epigenome 편집 플랫폼 최근 유전자 식1,2를 제어 하는 지역에서 어떤 DNA 시퀀스를 대상으로 개발 되었습니다. 만든된 epigenome 편집 도구는 (i) 전사 조절, (ii) 변경 posttranslational 히스톤 수정, (iii) 수정 DNA 메 틸 화, (iv) 규제 요소 상호 작용을 조절 하는 설계 되었습니다. 비활성화 (죽은) Cas9에 전사/chromatin 한정자를 접근 (dCas9) 발생 이전에서 아연 등 개발된 epigenome 편집 플랫폼, 단백질 (ZFPs) 및 녹음 방송 활성 제 같은 이펙터 (이야기), 손가락 은닉 강력한 transcriptional 이펙터 도메인 (ED) 디자인 DNA 바인딩 도메인 (DBD)3융합. 활성화 또는 억제 등 원하는 표현 형의 결과 생 loci (그림 1)에 고정 효과 기 분자에 의해 정의 됩니다. 프로그래밍 가능한 transcriptional 활성 제를 만들려면 dCas9/gRNA 모듈은 VP164,,56 (그림 1A), 폴 II 및 일반 전사 기계 신병 바이러스 활성화 도메인에 연결 됩니다. 이 시스템의 수정 VP64, VP16 도메인의 tetramer 제공 하는 더욱 강력한 활성화 속도5,6을 포함 했다. 시스템은 발기인 및 규정 요소를 대상으로 코딩 noncoding 지역 활성화를 성공적으로 고용 되었다. 중요 한 것은, VP64 분자 대상 지역에 염색 질 구조를 직접 수정 하지 않습니다, 비록 그것은 chromatin 한정자 액티브 (euchromatin) 마크, H3/H4 acetylation와 H3-K4 디 등의 증 착에 결과 묶는 신병 / 트라이-메 틸 화5,6. VP64, 뿐만 아니라 인간의 NF κB 복잡 한 p65 소 단위 dCas9/gRNA 모듈7에 닿는 되었습니다. 흥미롭게도, 상류 녹음 방송 시작 위치 (TSSs)과 발기인 내의 지역에 이러한 이펙터의 tethering 강한 유전자 유도 결과. 그럼에도 불구 하 고, VP64 및 p65 이펙터 있으며 하류 TSSs의 원심 강화7,8시 지역에 연결 되는 동안 activatory 효과 발휘 또한 수 있습니다. 더 강력한 transcriptional 응답을 유도, 여러 dCas9 VP64 또는 dCas9-p65 융해 단일 대상 로커 스9,10에 채용 될 필요가 있다. 따라서, 다음-세대 활성 제, 노, 등 단일 dCas9 gRNA 복잡 한에 의해 여러 이펙터 도메인 모집의 최근 개발 귀착되는 강한 활성화 기능 비교 dCas9 VP64 융합 대응11 , 12. 향상 된 transcriptional 활성화 VP64, p65, 및 Rta (VPR), 감마-herpesviruses에서 dCas913 (그림 1A)의 C-말단의 transactivation 도메인의 융합을 통해 얻은 되었습니다. 유사한 CRISPR/dCas9 시스템 대상별 억압 (그림 1B)에 대 한 개발 되었습니다.

내 생 유전자 억압 메커니즘 (그림 1B)의 다양 한 설계 진압 융해와 함께 얻을 수 있습니다. CRISPR/dCas9 시스템, (effector 도메인/s), 없이 진압 DBD에 연결 된 유전자 발현 발기인 또는 업스트림/다운스트림-TSS 지역3,6 에 곁에 하는 동안 침묵 효율적으로 수 있습니다 입증 되었습니다. 14. 녹음 방송에 영향 전사 인자 바인딩 및 RNA 중 합 효소 처리의 입체 장애에 의해 발생 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 보다 포괄적인 접근 필요, 입체 방해 혼자 여 진 억압은 종종 강력한 입을 위한 충분 합니다. CRISPR/dCas9 시스템 transcriptional 진압 도메인 (TRDs), 히스톤 한정자를 기반으로 하는 달 았 죠의 다음 세대의 최근 개발 (H3-K9 디-/ 트라이-메 틸 화, H3 K27 디-/ 트라이-메 틸 화; H3-K36 디-/ 트라이-메 틸 화, H3/H4 deacetylation), 그리고 DNA (CpG) 메 틸 보다 강력한 효과4,5,,1516, 입을 수 있도록 하는 후 성적인 도구 건설에 17,18,,1920. 그것은 DNA에 이러한 epigenetic 한정자의 모집 일반적으로는 더 강력한 입을 결과21,22를 생성 하는 더 많은 폐쇄 하 고 압축 된 chromatin의 형성으로 이어질 수 있습니다 입증 되었습니다. DBDs와 함께 사용 하는 가장 일반적으로 입을 도메인 Krüppel 관련 상자 (리아)4,5입니다. 요인의 모집 chromatin 변경; 해당 입증 되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 개조의 메커니즘은 아직 해명된16,,1718수 있습니다. 최근에, 그것은 보였다 DNA에 리아의 지역화가 이러한 상호 작용 중재의 형성 가능성을 제안 하는 히스톤 methyltransferase SETDB1 및 히스톤 deacetylation (HDAC) NuRD 단지의 어셈블리를 홍보할 수 있습니다. chromatin 응축 그리고 transcriptional 입을3,13. 다른 접근 방법으로 이펙터 도메인 사용자 지정 후 입을 단백질을 만드는 DBDs에 융합 수 있습니다. 이 시스템은 직접 억압 적인 DNA 부호 또는 히스톤 수정 catalyzes.

최근, 곁에 DNMT3A 효소 합성 CRISPR/dCas9 시스템의 사용 transcriptional 비활성화 용도가 변경 했습니다. DNMT3A catalyzes DNA 메 틸 화 내 생 유전자 발기인 및 다른 규제 영역 (그림 1B)18,20에 섬으로의 형성을 통해 transcriptional 억제 한다. 맥도날드 외.18 Vojta 외20 했다 보고 epigenome 유전자 침묵 또는 억압, 플라스 미드 배달 dCas9-DNMT3A 퓨전 시스템 향상 potently 수 보여주는 DNA 메 틸 화를 사용할 수 있는 첫 번째 저자 TSS18,20주위 시 토 신 메 틸 화. 맥도날드와 동료 증명 고용 전략의 중요 한 감소 (약 40%)에서 발생할 수 있습니다. 종양 억제기 유전자에서 CDKN2A mRNA 레벨18. 마찬가지로, 바흐 또는 IL6ST 유전자의 unmethylated 발기인 지역 타겟팅 증가 CpG 메 틸을 유전자 식20두 감소와 상관 관계를 보여줍니다. 우리 연구소는 최근 약하게 SNCA overexpression (그림 2)23의 병 적인 결과 대 한 DNA 메 틸 화를 사용 하 여 다른 용도로. SNCA intron 1 지역 내에서 DNA 메 틸 화에 선택적 향상 전략 기반으로 그것은 이전 PD와 치 매 Lewy 몸 (DLB) 두뇌24,25, hypomethylated 이기 위하여 보고 되었다 26. 이 hypomethylation SNCA overexpression, 따라서 제공 하는 치료 적 개입24,,2728에 대 한 매력적인 대상에 연결 되었습니다. 우리가 최근에 보여주었다 DNA 메 틸 화의 저수준 SNCA intron 1에서에서 hiPSC 파생 dopaminergic NPCs에 지역 SNCA triplication23PD 환자에서 얻은. 이 실험적인 모델의 장점은 NPCs 튼튼하게 문화에서 전파 하 또는 더 성숙한 뉴런으로 분화 세포 고기, 산화 등을 중재 하는 유전 요인 식별 하는 효율적인 심사를 사용 수 있다 스트레스와 apoptosis29. 또한,이 모델 시스템 환자에서 증상 발병 전에 발생 하는 개발 이벤트를 정리 하는 과학자를 수 있습니다. 또한, hiPSC에서 파생 된 NPCs 유전자 발현과 관련 된 세포 및 분자 경로 테스트 하는 훌륭한 도구를 나타냅니다. 중요 한 것은, 최신의 CRISPR/Cas9-epigenome 기술과 결합 하는 hiPSC 파생 NPCs 많은 신경 퇴행 성 질환에 대 한 "다음-세대 약물" 개발 용이 하 게 크게 수 있습니다.

SNCA 식의 병 적인 수준을 줄이기 위해, 우리는 최근 dCas9 DNMT3A 융해 단백질과 특별히 대상 CpG 메 틸 화 SNCA intron 1 (그림 2A) 내에 gRNA lentivirus 기반 시스템을 개발23. 이 프로토콜은 lentiviral 벡터 (LV) 설계 및 생산 세부 사항에 설명 합니다. LVs 나타내는 여러 가지 이유로 CRISPR/dCas9 구성 요소를 제공 하는 효과적인 수단, 즉 (i) 자신의 능력을 부피가 큰 DNA를 수행 삽입, (ii)30 셀을 나누어 및 nondividing를 포함 하 여 셀의 광범위 한 범위를 시험의 고효율 , 그리고 (iii) 최소한의 세포 독성 및 면역성 응답을 유도 하는 능력. 최근, 우리 SNCA 로커 스의 triplication 가진 환자에서 hiPSC 파생 dopaminergic 신경에 LV 시스템을 적용 하 고 epigenome 편집의 배달에 대 한 정 맥 주사의 치료 잠재력을 시연 메 틸 화23 ( 도구 그림 2B). 실제로, LV-gRNA/dCas9-DNMT3A 시스템 SNCA intron 1 지역에서 DNA 메 틸 화에 상당한 증가 발생합니다. 이 증가 SNCA mRNA와 단백질23의 수준에 있는 감소와 일치합니다. 또한, SNCA downregulation PD 관련 고기 SNCA triplication/hiPSC-파생 dopaminergic 신경 (예, 미토 콘 드 리아 선생님 생산 및 세포 생존)23에 구출. 중요 한 것은, 우리 SNCA 식 LV-gRNA-dCas9-DMNT3A 시스템에서에서 감소는 고기는 누가 실시는 PD 환자에서 hiPSC 파생 dopaminergic 신경에 대 한 특성이 있다 반전의 능력을 증명 SNCA triplication, 미토 콘 드 리아 선생님 생산 및 세포 생존23등. 이 프로토콜의 목표 이며 1) 생산의 프로토콜와 높은 tittered 바이러스 준비를 생성 하기 위한 최적화 된 LV 플랫폼의 농도 2) 성숙한 dopaminergic 될 꽃무늬 NPCs에 hiPSCs의 차별화를 설명 하기 위해 신경31,32 그리고 SNCA intron 1에서 대상 영역의 메 틸 화 수준의 특성화.

Lentiviral 플랫폼 주요 이점을 가장 인기 있는 벡터 플랫폼, 즉 adeno 관련 벡터 (AAVs), 큰 유전자 삽입33,34에 맞게 전 능력은 있다. AAVs 상당히 높은 수익률에 생성 될 수 있습니다 하지만 낮은 포장 용량을 보유 (< 4.8 kb), 모든-에-하나의 CRISPR/Cas9 시스템을 제공 하기 위한 그들의 사용을 타협. 따라서, 그것은 정 맥 주사의 플랫폼 제공된 CRISPR/dCas9 도구를 응용 프로그램에서 선택 될 것 이라고 보인다. 따라서, 여기에 설명 된 프로토콜 효과적으로 세포와 장기에 epigenome 편집 구성 요소를 제공 하는 연구를 위한 유용한 도구가 됩니다. 프로토콜 추가 벡터 식 카세트30,35내 요소의 cis에 수정 통해 벡터의 생산 및 표현 기능을 증가 하기 위하여 전략을 설명 합니다. 전략을 기반으로 소설에 시스템 개발 및 연구소에서 공부 하 고 1010 바이러스 성 단위 (VU) /mL30,35의 범위에서 바이러스 성 입자를 생산 하는 능력을 강조.

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프로토콜

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1. 시스템 설계 및 바이러스 생산

  1. 플라스 미드 설계 및 건설
    참고: 모든-에-하나의 LV-gRNA-dCas9-DNMT3A 벡터의 건축 생산을 사용 하 여 수행 됩니다-및 Ortinski 외30여 출판 식 최적화 식 카세트. 벡터 카세트 녹음 방송 요인 s p 1와-의 상태--예술 삭제는 번역에서 인식 사이트의 반복 수행 (U3')는 터미널 3'-긴 반복 (LTR) (그림 2A)30,36의 지역. 벡터 백본 제공 하 고 CRISPR/Cas930,35표현에 효과적인 것으로 발견 되었습니다.
    1. SpCas9의 비활성화 (죽은) 버전 (dCas9) 사이트 감독 mutagenesis (데이터 표시 되지 않음)를 통해. PBK30129 AgeI BamHI 조각 (그림 3) 사이 교환에 활성 Cas9와 각각, 효소의 촉매 도메인 트 및 RuvC에서 D10A 및 H840A 돌연변이 은닉 하는 복제를 교체 합니다.
    2. PdCas9-DNMT3A-eGFP에서 파생 하는 DNMT3A 촉매 도메인 ( 재료의 표참조)는 DNMT3A 증폭 시켜 BamHI-429/R 5 '-GAGCGGATCCCCCTCCCG-3' BamHI-429/L 5'-CTCTCCACTGCCGGATCCGG-부분 3' (그림 3). DNMT3A를 포함 하는 영역을 증폭 하려면 다음 조건: 60 (1) 95 ° C s, 10 (2) 95 ° C s, 20 (3) 60 ° C s, 60 미 반복 조건 2 ~ 4 30 x (4) 68 ° C. 마지막 확장에 대 한 68 ° C를 사용 하 여 3 분 동안 누르고 4 ° c.
    3. 복제 dCas9를 들고 수정된 pBK301 벡터의 BamHI 사이트로 BamHI 제한 효소에 의해 소화 DNMT3A 조각. 직접 생어에 의해 복제 확인 연속. 참고 결과 플라스 미드 dCas9 DNMT3A p2a puromycin transgene 항구. 플라스 미드는 인간 U6 발기인 (그림 3)에서 gRNA 비 계를 표현합니다.
    4. 녹색 형광 단백질 (GFP)를 만드는 dCas9 DNMT3A p2a GFP에 puromycin 취재 원 유전자를 바꿉니다. FseI와 dCas9에 DNMT3A p2a 순수 하지 않아 플라스 미드를 소화. 젤 정화 방법을 사용 하 여 벡터 조각 정화. PBK201a 소화 하 여 삽입을 준비 (pLenti-GFP) FseI와 함께. FseI 조각 벡터에 클론. 결과 플라스 미드 pBK539 항만 dCas9 DNMT3A p2a GFP transgene (그림 3).
  2. HEK 293T 세포 배양과 transfection에 대 한 셀을 도금
    참고: 인간 미 발달 신장 293T (HEK 293T) 셀 교양 완전 한 높은 포도 당 Dulbecco의이 글의 중간으로 수정 (DMEM; 10% 소 송아지 혈 청, 1 x 항생제 antimycotic, 1 x 나트륨 pyruvate, 1 x 불필요 한 아미노산, 2 mM L-글루타민) 5 7 ° C에서 CO 2. 프로토콜의 재현성에 대 한 것이 좋습니다 다른 많은/일괄 전환 시 송아지 혈 청 테스트. 6 15 cm까지 접시 lentiviral 생산을 위해 필요 합니다.
    1. 낮은 통로 세포를 사용 하 여 새로운 문화 (통로 20 보다 낮은) 시작. 일단 셀 도달 90%-95% 합류, 미디어를 발음 하 고 부드럽게에 그것을 세척 살 균 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x.
    2. 트립 신-EDTA (0.05%)의 2 개 mL를 추가 그리고 3-5 분 동안 37 ° C에서 품 어. 분리 시 비활성화, 완전 한 높은 포도 당 DMEM 그리고 10 mL 혈 청 학적인 피 펫 피 펫 10 x-15 x 4 x 106 셀/mL의 단일 세포 현 탁 액을 만들의 8 mL를 추가 합니다.
    3. Transfections, 15 cm 접시 0.2% 젤라틴 코트. 높은 포도 당 매체의 22.5 mL을 추가 하 고 셀의 셀 서 스 펜 션 (총 ~ 1 x 107 셀/접시) 2.5 mL을 추가 하 여 씨앗. 70%-80%의 합류를 도달할 때까지 5% CO2 와 37 ° C에서 접시를 품 어.
  3. HEK 293T 세포의 transfection
    1. BES 버퍼 솔루션 게시판 x 2와 1 M CaCl2, Vijayraghavan 및 칸 토35에 따라 준비 합니다. 0.22 μ m 필터를 통해 전달 하 여 솔루션을 필터링 및 4 ° c.에서 그들을 저장합니다 Transfection 혼합 셀에 그것의 추가 하기 전에 명확 하 게 있다. 혼합 되 면 흐린 인큐베이션 기간 동안, 준비 신선한 2 x BBS (pH = 6.95).
    2. 나열 된 4 개의 플라스 미드 사용 플라스 미드 믹스를 준비 하려면 (다음 혼합은 충분 한 15cm 접시): CRISPR/dCas9-전송 벡터의 37.5 µ g (pBK492 [DNMT3A-순수 하지 않아-노-gRNA] 또는 pBK539 [DNMT3A-GFP-노-gRNA]); pBK240의 25 µ g (psPAX2); pMD2.G;의 12.5 µ g pRSV-레 브 (그림 4A)의 6.25 µ g. 농도에 따라 하는 플라스 미드의 볼륨을 계산 하 고 15 mL 원뿔 튜브로 필요한 수량을 추가. 1 M CaCl2 312.5 µ L을 추가 1.25 mL를 최종 볼륨을가지고, vortexing 믹스 2 x BBS 솔루션의 1.25 mL를 추가 살 균 dd-H2o. 부드럽게를 사용 하 여. 실 온에서 30 분 동안 품 어. 일단 그들은 70%-80% 합칠 셀 transfection 준비 되어 있다.
    3. 미디어를 발음 하 고 혈 청 하지 않고 갓된 높은 포도 당 DMEM의 22.5 mL와 함께 그것을 대체. 각 15 cm 접시에 dropwise transfection 혼합물의 2.5 mL를 추가 합니다. 접시를 소용돌이 5% CO2 2-3 h 37 ° C에서 품 어.
    4. 3 h 후 추가 2.5 mL (10%) 접시 당 혈 청의 5% CO2와 37 ° C에서 밤새 품 어 고.
    5. Transfection는 후 1 일에는 되도록 세포 관찰 없이 또는 최소한의 세포 죽음과 셀 confluent 문화 (100%)을 형성.
      1. 각 접시에 갓된 높은 포도 당 DMEM과 10% 혈 청의 25 mL를 추가 하 여 미디어를 변경 합니다.
    6. 48 h에 대 한 5% CO2 와 37 ° C에서 품 어.
  4. 바이러스의 수확
    1. 상쾌한 모든 transfected 세포에서 수집 하 고 50 mL 원뿔 튜브에 그들을 풀. 10 분에 대 한 400-450 x g 에서 원심 분리기 필터 0.45 μ m 진공 필터 장치 통해 상쾌한. 여과 후에 상쾌한 단기 저장용 (4 일) 4 ° C에서 보관할 수 있습니다. 장기 저장을 위한 aliquots를 준비 하 고-80 ° c.에서 그들을 저장합니다
      참고: Nonconcentrated 바이러스 준비 2 ~ 10 배 될 것으로 예상 된다7 3 x 107 부/mL (1.5 titer 결정에 대 한 섹션 참조). 이후 여러 freeze-thaw 주기 기능 titers에 10%-20% 손실 귀 착될 것 이다 단일 사용 aliquots, 준비 매우 것이 좋습니다.
  5. 바이러스 성 입자의 농도
    참고: 고 정화에 대 한 자당 그라데이션 단계와 자당 쿠션 단계는 관련 된 두 단계 더블 자당 메서드 (그림 4B) 수행.
    1. 자당 기온 변화도 만들려면 다음 순서로 원뿔 ultracentrifugation 튜브 준비: 1 x PBS, DMEM, DMEM에 30% 자당의 1 mL 및 1 x PBS에 20% 자당의 2 mL에 60% 자당의 0.5 mL에에서 70% 자당의 0.5 mL.
    2. 신중 하 게, 상쾌한, 섹션 1.4에 따라 수집 된 그라데이션 추가. 4 15 cm 접시에서 수집한 총 볼륨 100 mL 이므로, 6 ultracentrifugation 튜브를 사용 하 여 바이러스 상쾌한 처리.
    3. 동등 하 게 각 ultracentrifugation 튜브 중 바이러스 상쾌한을 배포 합니다. 원심 분리 동안 튜브 파손을 피하기 위해, 적어도 3-4 그들의 총 볼륨 용량을 ultracentrifugation 관을 채우십시오. 1 x PBS 가진 튜브를 균형. 원심에서 70000 x g 2 h 17 ° c.에 대 한 샘플
      참고: 가속 및 감속 단계 동안 자당 레이어를 유지 하려면 천천히가 속하고 감속 회전자 0에서 200 g x와 0xg200에서은 스핀의 처음과 마지막 3 분 동안 각각 ultracentrifuge을 허용 합니다.
    4. 부드럽게 깨끗 한 튜브 (그림 4B) 30%-60% 자당 분수를 수집 합니다. 총 볼륨의 100 ml PBS (감기) 최대 x 1을 추가 합니다. 여러 번 pipetting으로 혼합.
    5. (1 x PBS)에서 20% 자당의 4 mL 튜브에 추가 하 여 자당 쿠션에 바이러스 준비를 신중 하 게, 충. 계속 pipetting ~ 20-25 mL의 각 관 당 바이러스 솔루션. 채워 튜브 1 x PBS 그들의 내용의 볼륨은 튜브 당 3-4 보다 작은 경우. 신중 하 게 튜브를 균형. 2 h 17 ° c.에 대 한 70000 x g 에서 원심 분리기 상쾌한을 나머지 수 있도록 종이 타 올에 튜브를 반전 액체 드레인.
    6. 남은 액체를 신중 하 게 발음 하 여 모든 액체를 제거 합니다. 이 단계에서 유의 알 약은 바이러스를 포함 하는 작은 반투명 반점으로 겨우 볼 수 있습니다. Resuspend 펠 릿을 첫 번째 튜브에 1 x PBS의 70 µ L를 추가 합니다. 완전히 플라스틱 정지 하 고 모든 펠 릿 resuspended 때까지 다음 튜브에 그것을 전송.
    7. PBS와 전에 믹스 x 1의 추가 50 µ L 튜브 세척. 참고는,이 단계에서 마지막 정지의 볼륨 ~ 120 µ L 이며 약간 밀키 나타납니다. 분명 서 스 펜 션을 얻기 위해 10000 x g에서 60 s 원심 분리 진행. 새로운 튜브에는 상쾌한 전송 5 µ L aliquots, 고-80 ° c.에서 그들을 저장합니다
      참고: Lentiviral 벡터 준비 중지 및 재개의 반복된 사이클에 민감합니다. 또한, 그것은 나머지 단계 조직 문화 봉쇄에는 또는 지정 biosafety 표준 (그림 4B)의 적절 한 수준에서 되는 측면에서 한정 된 지역에 좋습니다.
  6. 바이러스 titers의 정량화
    참고: 바이러스 titers 추정 (p24개 그 일 라) p24 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 메서드를 사용 하 여 수행 됩니다 및 국립 보건원 (NIH) 에이즈 백신 프로그램에는 HIV 1 p24 항 원 캡처 분석 결과 대 한 프로토콜 약간의 수정입니다.
    1. 0.05% 트윈 20 감기 1 x PBS (PBS-T)의 200 µ L 96 잘 접시 3의 우물을 세척을 사용 하 여 x.
    2. 플레이트 코트, 1 x PBS에 1:1,500에서 희석 하는 단일 클로 널 안티-p24 항 체의 100 µ L를 사용 합니다. 4 ° c.에 하룻밤 접시를 품 어
    3. 차단 시 (1% 소 혈 청 알 부 민 [BSA] 1 x PBS에) 약을 준비 하 고 200 µ L을 각 영역을 피하기 위해 일반적인 바인딩 추가. PBS-T의 200 µ L를 사용 하 여 실 온에서 1 시간 이상에 대 한 잘 3 배를 씻어.
    4. 샘플 준비와 진행. 집중된 벡터 준비를 사용할 경우, 사용 하 여 샘플의 1 µ L dd-H20, 89 µ L의 트라이 톤 X-100 10 µ L (10%의 최종 농도)에서 1: 100에 벡터를 희석. Nonconcentrated 준비에 대 한 1시 10분에서 샘플을 희석.
    5. 에이즈-1 표준 이중 직렬 희석 (시작 농도 5 ng/mL)을 사용 하 여 얻을.
    6. 희석 RPMI 1640를 1:10, 000, 0.2% 트윈 20, 1 %BSA 보완에 집중된 샘플 (1.6.4 단계에서 준비) 1:50, 000, 그리고 1:250,000 희석. 마찬가지로, 희석 RPMI 1640 설정 1: 500, 1:2, 0.2% 트윈 20, 1 %BSA 보완에 nonconcentrated 샘플 (준비 단계 1.6.4) 500, 및 1:12,500 희석.
    7. 샘플 및 표준 triplicates에 접시에 추가 합니다. 4 ° c.에서 밤새 품 어
    8. 다음 날 씻어 웰 스 6 x.
    9. Polyclonal 토끼 안티 p24 항 체, RPMI 1640, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 0.25 %BSA, 및 2% 정상 마우스의 혈 청 (NMS), 1:1,000에서 희석의 100 µ L을 추가 하 고 37 ° C 4 h에서 품 어.
    10. 씻어 웰 스 6 x. 염소 안티 토끼 양 고추냉이 과산화 효소 5% 정상 염소 혈 청, 2 %NMS, 0.25 %BSA 및 0.01% 보충 RPMI 1640 년에 1:10,000에서 희석 하는 IgG 추가 트윈 20. 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.
    11. 씻어 웰 스 6 x. TMB 과산화 효소 기질을 추가 하 고 15 분 동안 실 온에서 품 어.
    12. 반응을 중지, 1 N HCl의 100 µ L를 추가 합니다. Microplate 리더에서 450에서 흡 광도 측정 nm.
  7. 기자는 형광 강도 측정
    1. 1 x PBS에 (10-510-1 )에서 10 직렬 희석을 바이러스 성 현 탁 액을 사용 합니다.
    2. 6 잘 플레이트의 각 우물에서 5 x 105 HEK 293T 세포 격판덮개. 각 바이러스 희석의 10 µ L 셀에 적용 하 고 5% CO2 48 h에 대 한 37 ° C에서 품 어.
    3. (FACS) 분석을 다음과 같이 정렬 형광 활성화 된 세포를: 0.05% 트립 신-EDTA 용액의 200 µ L을 추가 하 여 세포를 분리. 5 분 동안 37 ° C에 세포를 품 어 고 (혈 청)과 DMEM 매체의 2 mL에 그들을 resuspend. 15 mL 원뿔 튜브와 4 ° c.에 400 x g 에서 원심 분리기 샘플 수집 감기 1 x PBS의 500 µ L에 펠 릿을 resuspend.
    4. 4 %paraformaldehyde (PFA)의 500 µ L을 추가 하 여 셀을 수정 하 고 실 온에서 10 분 동안 품 어.
    5. 4 ° C에 400 x g 에서 centrifuge 고 1 x PBS의 1 mL에 펠 릿을 resuspend. GFP 식 Ortinski 외.30에 설명 된 대로 FACS 악기를 사용 하 여 분석 합니다. 바이러스 기능 titer를 결정 하려면 다음 수식을 사용 합니다.
      figure-protocol-1
      여기,
      Tg = GFP-긍정적인 세포;
      Tn = 셀;의 총 수
      N = 총 수 불리고 세포;
      V = (microliters)에서 변환에 사용 되는 볼륨.
  8. GFP-긍정적인 세포 계산
    참고: 변환에 대 한 고용 하는 감염 (MOI)의 복합성을 결정 합니다. MOIs의 넓은 범위를 테스트 (나 나 1 = = 10).
    1. 시드 3 x 10 6 잘 플레이트의 각 웰 당 4 x 105 HEK 293T 세포에5 .
    2. 셀에 도달할 때 > 80% 합류 관심의 나에서 벡터와 transduce.
    3. 5% CO2, 37 ° C에서 품 어 고 1-7 일에 대 한 셀에 GFP 신호를 모니터링 합니다.
    4. GFP-긍정적인 세포의 수를 계산 합니다. 형광 현미경을 사용 (계획 4 x 목표, 0.1 없음, 40 배 확대) GFP 필터를 사용 하 여 (여기 파장 = 470 nm, 방출 파장 = 525 nm). Untransduced 셀을 사용 하 여 GFP 음수가 셀의 제어 인구를 설정.
    5. 바이러스의 기능적 titer를 확인 하려면 다음 수식을 사용 합니다.
      figure-protocol-2
      여기,
      N = GFP-긍정적인 세포;
      D = 희석 비율;
      M = 확대 비율;
      V = 변환에 사용 되는 바이러스의 볼륨.
      참고:이 예에서는 다음 결과 계산: 10 GFP-긍정적인 세포 (N) 10-4 (1:10, 000) 20 x 배율 (M) 10 µ L 샘플 (V)에 한 희석 (D)에서 계산, 밀리 리터 당 TU (10 x 104) 될 것입니다 (20) x (10) x (100) x = 2 x 108 vu/mL.

2입니다. dopaminergic 신경 조상 세포의 분화

  1. HiPSCs 배양
    참고: hiPSCs SNCA 로커 스, ND34391, triplication와 함께 환자에서 신경 성 질환의 국가 학회 및 치기 (NINDS) 카탈로그 (재료의 표 참조)에서 입수 했다.
    1. 급지대 무료 ESC-iPSC 문화 매체에 피더 독립 조건 hiPSCs 문화 ( 재료의 표참조) 기본 매트릭스 hESC 자격 막 (BMM)에-코팅 판 ( 재료의 표참조). DMEM/F12의 1 mL와 confluent 식민지를 세척, 분리 시 약의 1 mL을 추가 ( 재료의 표참조), 그리고 실내 온도에 3 분 동안 품 어.
    2. 분리 시 발음을 피더 무료 ESC-iPSC 문화 매체의 1 mL를 추가 합니다.
    3. 셀 리프 터를 사용 하 여 접시를 긁 고 pipetting 4 x-5 붕 규 산 펫을 사용 하 여 x 여 급지대 무료 ESC-iPSC 문화 매체의 11 mL에 식민지를 resuspend.
    4. BMM 코팅 접시에 식민지의 서 스 펜 션의 2 mL 접시 하 고 5% CO2와 37 ° C에서 접시를 놓습니다. 매일 중간 변화를 수행 하 고 5-7 일 마다 셀 분할.
  2. Dopaminergic 신경 조상 세포로 분화
    참고: Dopaminergic 신경 조상 세포 (MD NPCs)로 hiPSCs의 차별화는 약간의 수정31,32 (제조 업체의 지시 당 상용 신경 유도 중간 프로토콜을 사용 하 여 수행 재료의 표참조). 차별화의 첫 날은 0으로 간주 됩니다. 높은 품질 hiPSCs는 효율적인 신경 분화에 필요 합니다. MD NPCs의 유도 performedusing embryoid 몸 (EB)-프로토콜을 기반으로.
    1. HiPSCs의 분화를 시작 하기 전에 microwell 문화 접시 준비 ( 재료의 표참조)는 제조업체의 지침에 따라.
    2. Microwell 문화 접시를 준비 후 추가 10 µ M와 보충 신경 유도 매체 (님; 참조 테이블의 재료)의 1 mL Y-27632.
    3. 사용할 준비가 될 때까지 접시를 따로 설정 합니다.
    4. DMEM/f 12와 hiPSCs 세척, 세포 분리 솔루션의 1 mL을 추가 ( 재료의 표참조), 5% CO2와 37 ° C에서 5 분 동안 품 어 고.
    5. DMEM/F12에 단일 셀을 resuspend 하 고 5 분 동안 300 x g 에서 원심.
    6. 신중 하 게는 상쾌한 발음 하 고 resuspend 님 + 10 µ M에서 셀 3 x 106 셀/mL의 최종 농도를 Y-27632.
    7. Microwell 문화 접시의 한 우물을 단일 셀 서 스 펜 션의 1 mL을 추가 하 고 3 분 100 x g 에서 격판덮개 원심.
    8. 격판덮개는 microwell 중 셀의 동등한 배급을 보장 하기 위해 현미경을 검토 하 고 5% CO2와 37 ° C에서 세포를 품 어.
    9. 일 1-4에 일일 부분 중간 변경을 수행 합니다.
    10. 1 mL를 사용 하 여 micropipette, 매체의 1.5 mL을 제거 하 고 삭제. 천천히, Y-27632 없이 신선한 님의 1.5 mL를 추가 합니다.
    11. 하루 4까지 2.2.10 단계를 반복 합니다.
    12. 하루 5, 6 잘 플레이트 BMM. 와 한 잘 코트
    13. 37 µ m 가역 거르는 장소 ( 테이블의 자료를 참조) 50 mL 원뿔 튜브 (폐기물) 위에. 가역 여과기 위쪽의 화살표를 가리킵니다.
    14. 형성된 된 EBs를 방해 하지 않고 microwell 문화 판에서 매체를 제거 합니다.
    15. DMEM/F12의 1 mL를 추가 하 고 신속 하 게 붕 피펫으로와 EBs를 수집 하 고는 스 트레이너를 통해 필터링.
    16. 2.2.15 단계를 반복 하 여 모든 EBs microwell 문화 판에서 제거 됩니다.
    17. 새로운 50 mL 원뿔 튜브에는 여과기를 반전 하 고 모든 EBs를 수집 하는 님의 2 개 mL를 추가 합니다.
    18. BMM 코팅 판 붕 피 펫을 사용 하 여 단일 음에 EB 서 스 펜 션의 2 개 mL를 플레이트. EBs 5% CO2와 37 ° C에서 품 어.
    19. 하루 6, 님 + 200 ng/mL 쉬의 2 개 mL를 준비 ( 재료의 표참조) 매일 중간 변화를 수행 하 고.
    20. 주 8, 신경 유도의 비율을 확인 합니다.
    21. 연결 된 모든 EBs를 계산 하 고, 특히, 각 개별 EB 신경 근 엽으로 가득 수를 결정. 다음 수식을 사용 하 여 신경 근 엽 유도 계량.
      figure-protocol-3
      참고: 신경 유도 경우 < 75%, 신경 근 엽 선택 효율적일 수 있습니다 없습니다.
    22. 하루 12, N2B27 매체의 250 mL neurobasal 매체, DMEM/F12 매체, GlutaMAX, NEAA, n 2 보충, 비타민 A 없이 B27의 5 mL 2.5 mL 2.5 mL 2.5 mL의 119 mL, Gentamicin (50 mg/mL)의 250 μ의 119 mL와 함께 준비 19. BSA (7 mg/mL)의 66 μ.
    23. 완전 한 N2B27 매체의 50 mL를 준비 하려면 추가 3 μ M CHIR99021, 2 μ M SB431542, 20 ng/mL bFGF, 20 ng/mL EGF, 및 200 ng/mL 쉬.
      참고: 준비 완료 하는 것이 중요 하다 사용 하기 바로 전에 중간.
    24. 신경 근 엽을 포함 하는 우물에서 매체를 발음 하 고 DMEM/F12의 1 mL로 씻어.
    25. 광고의 신경 근 엽 선택 시 약 1 mL ( 재료의 표참조) 및 5% CO2 1 h 37 ° C에서 품 어.
    26. 선택 시 약을 제거 하 고, 장미 클러스터를 직접 목표로 1 mL pipettor를 사용 하 여.
    27. 15 mL 원뿔 튜브에 정지를 추가 하 고 반복 단계 2.2.25 2.2.26 신경 장미 클러스터의 대부분까지 모았다.
      참고: Nonneuronal 셀 종류와 오염을 방지 하려면 overselect 하지 않습니다.
    28. 원심 350 x g 5 분 Aspirate에서 장미 정지는 상쾌한 고 resuspend N2B27 + 200 ng/mL 쉬 신경 근 엽. BMM 코팅 잘에 신경 근 엽 정지를 추가 하 고 5% CO2와 37 ° C에서 접시를 품 어.
    29. 13-17 일, 매일 매체 변경 완료 된 N2B27 매체를 사용 하 여 수행 합니다. 문화는 80%-90% 합칠 때 셀을 통과.
    30. 셀을 분할 하려면 BMM 코팅 접시를 준비 합니다.
    31. DMEM/F12의 1 mL로 세포 세척, 매체, 발음 및 분리 시 약의 1 mL을 추가 ( 재료의 표참조).
    32. 37 ° C에서 5 분 동안 incubate DMEM/F12의 1 mL을 추가 하 고 아래로 pipetting에 의해 연결 된 셀을 꺼내. 15 mL 원뿔 튜브에 NPC 정지를 수집 합니다. 5 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리기.
    33. 상쾌한 발음 하 고 완전 한 N2B27의 1 mL에 셀 + 200 ng/mL 쉬 resuspend.
    34. 셀을 계산 하 고 105 셀/cm2, x 1.25의 조밀도에 접시 5% CO2와 37 ° C에서 세포를 품 어.
    35. 변경 매체 매일, 완전 한 N2B27 + 200 ng/mL 쉬를 사용 하 여.
      참고: 이 대목에서 Npc 통과 (P)로 간주 됩니다 0. 쉬 p 2에서 N2B27 매체에서 철회 될 수 있다.
    36. 일단 80%-90% 합류 도달 하면 세포를 통과.
    37. 이 단계에서 세포 immunocytochemistry 및 정량 사용 하 여 Nestin 및 FoxA2 마커 익스프레스 확인 합니다. 이 프로토콜 Nestin 및 FoxA2 표식에 대 한 85% 두 배 긍정적인 세포의 생성을 지도 한다.
    38. 셀을 뿌리고에 대 한 2.2.31–2.2.36 단계를 반복 합니다.
    39. P2 통로에서 시작 셀을 고정 합니다. 세포의 동결에 대 한 2.2.31–2.2.36 단계를 반복 하 고 4 x 106 셀/ml 매체 얼어 차가운 신경 뿌리를 사용 하 여 2 x 106 셀 펠 릿 resuspend ( 재료의 표참조).
    40. 각 cryovial에 세포 현 탁 액 1 mL를 전송 하 고 표준 느린 속도 제어 하는 냉각 시스템을 사용 하 여 셀을 동결. 장기 저장을 위한 액체 질소에 셀을 계속.
  3. MD NPCs 녹고
    1. BMM 코팅 접시를 준비 하 고 완벽 한 N2B27 따뜻한. 15 mL 원뿔 튜브에 따뜻한 DMEM/F12의 10 mL를 추가 합니다. 2 분 동안 37 ° C 열 블록에는 cryovial를 배치 합니다.
      1. DMEM/F12 포함 된 튜브에는 cryovial에서 셀을 전송. 5 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리기.
      2. 상쾌한 발음, resuspend N2B27의 2 개 mL에 셀 고 BMM 코팅 접시의 한 우물을 세포 현 탁 액을 추가 합니다. 5% CO2와 37 ° C에서 세포를 품 어.

3. 변환 MD NPCs 및 메 틸 화 변화 분석

  1. MD NPCs의 변환
    1. LV-gRNA/dCas9-DNMT3A 벡터 나에와 70% 합류에 MD NPCs transduce = 2. N2B27 중간 16 h posttransduction을 교체 합니다.
    2. 5 µ g/mL puromycin, 변환 후 48 h와 N2B27를 추가 합니다. N2B27 플러스 puromycin 안정적인 MD NPC 라인을 얻기에 3 주 동안 셀 문화. 셀 (DNA, RNA, 단백질 분석, phenotypic 특성23, 동결 및 뿌리고) 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 준비가 되었습니다.
  2. SNCA intron 1의 메 틸 프로필의 특성
    1. 안정적으로 transduced 각 세포에서 DNA를 추출 DNA 추출을 사용 하 여 라인 키트 ( 재료의 표참조).
    2. 상업적으로 사용할 수를 사용 하 여 황산 변환을 수행 하려면 DNA의 사용 800 ng 키트 ( 재료의 표참조). 변환 후에 황산, 황산 변환 DNA 20 ng / µ L을 elute.
  3. Pyrosequencing 분석을 위한 PCR
    1. Nuclease 무료 튜브에 PCR 마스터 믹스를 준비 합니다. 각 반응에 대 한 역방향 뇌관 (10 µ M), 앞으로 뇌관 (10 µ M), MgCl2 (25 m m), CoralLoad 집중, 2 x PCR 마스터 믹스의 10 µ L, 5의 4 µ L x 10의 2 µ L의 1.6 µ L의 0.4 µ L의 0.4 µ L를 사용 하 여 Q-솔루션, DNA의 1 µ L x 그리고 0.6 µ L nuclease 무료 물.
    2. 반응 플레이트는 thermocycler 전송 하 고 다음 조건을 사용 하 여 PCR을 수행: 30 94 ° C의 50 주기 15 분 동안 95 ° C s, 56 ° C 30에 대 한 s, 그리고 30 대 72 ° C s, 72 ° c.에 마지막 10 분 확장 단계 뇌관 SNCA intron 1의 pyrosequencing에 사용 되는 표 1, 그림 7A및 보충 그림 1에 나열 됩니다.
    3. 증폭 후 amplicons ethidium 평범한 사람 얼룩이, 다음 agarose 젤 전기 이동 법으로 PCR 제품의 2 µ L를 사용 하 여 시각화.
    4. Pyrosequencing 분석 실험 unmethylated (U)의 혼합물을 사용 하 여 유효성을 검사 하 고 갠 다음 비율, 즉 100U:0M, 75U:25M, 50U:50M, 25U:75M, 및 0U:100M ( 재료의 표참조)에 황산 변환 DNAs (M).
    5. Pyrosequencing pyrosequencing 시 약 ( 재료의 표참조)를 사용 하 여 수행 하 고 pyrosequencing 소프트웨어를 사용 하 여 각 CpG 사이트에 대 한 메 틸 화 값을 계산 합니다. 자세한 pyrosequencing 프로토콜에 대 한 Bassil 외37참조.

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결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

순진한 GFP 대응에 비해 LV-dCas9-DNMT3A-GFP/순수 하지 않아 벡터의 생산 titers의 유효성 검사

우리 p24개 그 ELISA 순진한 GFP/순수 하지 않아 대조 물과 LV-dCas9-DNMT3A-GFP/순수 하지 않아의 물리적 titers 사이 비교를 수행 합니다. 그림 5A에 대표 결과 여기 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 생성 된 벡터의 실제 수익률 비교는 보여줍니다. 이 최적화 된 생산 프로토콜 함께 최적화 된 벡터 등뼈의 유틸리티 CRISPR/dCas9 벡터의 높은 수율 titer에서 결과 나왔다. 바이러스 성 입자로 dCas9 DNMT3A transgene의 포장의 효율성을 평가 하기 위해 우리는 HEK 293T 세포 (

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LVs 유전 질병의 맥락에서 특히 epigenome 편집을 위한 선택의 차량으로 등장 하기 시작 했습니다, (i) 수용 하기 위해 그들의 능력 때문에 주로 큰 DNA 페이로드 및 (ii) 효율적으로 transduce 다양 한 분할 및 nondividing 셀. 정 맥 주사의 큰 포장 효능은 특히 대형은 CRISPR/dCas9 시스템의 포장을 포함 하는 응용 프로그램에 대 한 유용 합니다. 이 관점에서 정 맥 주사 모두 한 CRISPR/Cas9 시스템의 배달에 대 한 선택의 플랫폼을 나타냅니다. 실제로, 일반적으로 전 임상 및 임상 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 고용, AAV 플랫폼, 완전히 dCas9 이펙터 시스템의 큰 포장 크기에 맞게 수는 없습니다. 사실, AAV 벡터의 엄격한 포장 요구 사항 CRISPR/dCas9 부품의 납품에 대 한 그들의 사용을 금지 됩니다. AAV 포장 기능을 개선 하기 위해, 여러 가지 새로운 AAV 기반 플랫폼 개발 되었습니다. 예를 들어 두 AAV 카세트로 시스템 최근 되었습니다 Cas9를...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

듀크 대학이이 연구에 관련 된 임시 특허 출원을 제기 했다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 칸 Neurotechnology 개발 상 (O.C.)을 국립 연구소의 건강/국립 연구소의 신경 장애 및 뇌졸중 (NIH/NINDS) 일부 자금 O.C. (R01 NS085011).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Equipment
Optima XPN-80 초원심분리기Beckman CoulterA99839
0.22 μ M 필터 장치, 1LCorning430513
0.45-μ m 필터 장치, 500 mLCorning430773
100 mm TC 처리 배양 접시Corning430167
15 mL 코니컬 원심분리 튜브Corning430791
150 mm TC 처리 세포 배양 접시, 20 mm 그리드Corning353025
50 mL 코니컬 원심분리기 튜브Corning430291
6웰 플레이트Corning3516
Aggrewell 800StemCell Technologies34811
Allegra 25R 탁상용 원심분리기Beckman Coulter369434
BD FACSBecton Dickinson338960
원뿔형 바닥 초원심분리 튜브Seton Scientific5067
원뿔형 튜브 어댑터Seton ScientificPN 4230
Eppendorf Cell Imaging SlidesEppendorf30742060
High-binding 96-well platesCorning3366
도립 형광 현미경LeicaDM IRB2
QIAprep Spin Miniprep Kit (50)Qiagen27104
가역 여과기StemCell Technologies27215
SW32Ti 로터Beckman Coulter369650
VWR® 일회용 혈청학 피펫, 유리, 비발열성VWR93000-694
VWR® 진공 여과 시스템VWR89220-694
xMark™ 마이크로플레이트 흡광도 플레이트 리더Bio-Rad1681150
NameCompany카탈로그 번호Comments
Cell culture reagents
Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cellsATCCCRL-3216
AccutaseStemCell Technologies7920
접착 방지 헹굼 용액StemCell Technologies7010
Anti-FOXA2 항체AbcamAb60721
Anti-Nestin 항체AbcamAb18102
항생제-항진균제 용액, 100xSigma AldrichA5955-100ML
B-27 보충제(50개), 비타민 A 뺀Thermo Fisher Scientific12587010
BESSigma AldrichB9879 - BES
소 알부민 분획 V(7.5% 용액)Thermo Fisher Scientific15260037
CHIR99021StemCell Technologies72052
Corning Matrigel hESC 인증 매트릭스Corning08-774-552
우주 송아지 혈청하이클론SH30087.04
DMEM-F12Lonza12-719
DMEM, 고혈당 매체Gibco11965
DNeasy Blood & 조직 키트Qiagen69504
EpiTect PCR Control DNA SetQiagen596945
EZ DNA 메틸화 키트Zymo ResearchD5001
젤라틴시그마 AldrichG1800-100G
겐타마이신Thermo Fisher Scientific15750078
Gentle Cell Dissociation ReagentStemCell Technologies7174
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061
인간 재조합 bFGF줄기세포 기술78003
인간 재조합  EGFStemCell Technologies78006
Human Recombinant Shh (C24II)StemCell Technologies78065
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)Thermo Fisher Scientific11140050
mTeSR1StemCell Technologies85850
N-2 Supplement (100x)Thermo Fisher Scientific17502001
Neurobasal MediumThermo Fisher Scientific21103049
Non-Essential Amino Acid (NEAA)HycloneSH30087.04
PyroMark PCR KitQiagen978703
RPMI 1640 mediaThermo Fisher Scientific11875-085
SB431542StemCell Technologies72232
피루브산나트륨시그마 알드리치S8636-100ML
STEMdiff  신경 유도 매체StemCell Technologies5835
STEMdiff 신경 전구체 동결 매체StemCell Technologies5838
TaqMan Assay FOXA2Thermo Fisher ScientificHs00232764
TaqMan Assay GAPDHThermo Fisher ScientificHs99999905
TaqMan Assay NestinThermo Fisher ScientificHs04187831
TaqMan 어세이 OCT4Thermo Fisher ScientificHs04260367
TaqMan 어세이 PPIAThermo Fisher ScientificHs99999904
Trypsin-EDTA 0.05%Gibco25300054
Y27632StemCell Technologies72302
NameCompany카탈로그 번호Comments
p24 ELISA 시약
Monoclonal anti-p24 항체NIH AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램3537
염소 항 토끼 양 고추 냉이 과산화 효소 IgG SigmaAldrich12-348작업집중 1:1500
염소 혈청, 멸균, 10mLSigmaG9023작업 농도 1:1000
HIV-1 표준NIH AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램SP968F
일반 마우스 혈청, 멸균, 500mLEquitech-BioSM30-0500
폴리클론 토끼 항24 항체NIH AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램SP451T
TMB 퍼 옥시 다제 기판KPL5120-0076작동 농도 1 : 10,000
Name Company카탈로그 번호 < / strong>Comments< / strong>
Plasmids< / u>< / em>
pMD2.GAddgene12253
pRSV-RevAddgene52961
psPAX2Addgene12259
NameCompany카탈로그 번호Comments
>Restriction enzymes
BsmBI뉴잉글랜드 바이오랩스R0580S
BsrGI뉴잉글랜드 바이오랩스R0575S
EcoRV뉴잉글랜드 바이오랩스R0195S
KpnI뉴잉글랜드 바이오랩스R0142S
PacI뉴잉글랜드 바이오랩스R0547S
SphI뉴잉글랜드 바이오랩스R0182S
, , 값

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
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