인간으로 Epigenome 편집 도구의 효율적인 배달 lentiviral 벡터 플랫폼 유도 만능 줄기 세포 유래 질병 모델

Lidia Tagliafierro; Ekaterina Ilich; Malik Moncalvo; Jeffrey Gu; Ahila Sriskanda; Carole Grenier; Susan  K. Murphy; Ornit Chiba-Falek; Boris Kantor

doi:10.3791/59241

이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

인간으로 Epigenome 편집 도구의 효율적인 배달 lentiviral 벡터 플랫폼 유도 만능 줄기 세포 유래 질병 모델

9.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/59241

⸱

2019년 3월 29일

Lidia Tagliafierro¹^,² , Ekaterina Ilich³ , Malik Moncalvo³ , Jeffrey Gu¹ , Ahila Sriskanda¹^,² , Carole Grenier⁴ , Susan K. Murphy⁴ , Ornit Chiba-Falek¹^,² , Boris Kantor³

¹Department of Neurology, Duke University Medical Center, ²Center for Genomic and Computational Biology, Duke University Medical Center, ³Viral Vector Core, Duke University Medical Center, ⁴Division of Gynecologic Oncology, Department of Obstetrics and Gynecology, Duke University Medical Center

이 논문에서

요약

타겟 DNA epigenome 나타냅니다 편집 강력한 치료 접근. 이 프로토콜에 설명 합니다 생산, 정화, 그리고 모든-에-하나의 lentiviral 벡터 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)에서 epigenome 편집 응용 프로그램에 대 한 CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene 은닉의 농도-신경 파생.

초록

HiPSC에서 파생 된 세포를 사용 하 여 인간의 신경 퇴행 성 질환을 연구 하는 귀중 한 접근 방식을 나타냅니다. 여기, 우리는 환자와 파 킨 슨 병 (PD)으로 알파 synuclein 유전자 (SNCA) 로커 스의 triplication에서에서 파생 된 hiPSCs의 분화에 대 한 최적화 된 프로토콜을 설명-관련 dopaminergic 신경 인구. 증거를 축적으로 나타났습니다 SNCA 의 상부는 충족 SNCA 표현의 규제 대상으로 하는 특히 그 PD를 위한 소설 치료 접근을 설치할 필요가 PD. Recognizing의 개발에 대 한 원인이 되는 우리 최근 epigenetically SNCA intron 1 규제 지역에서 메 틸 화 수준의 풍요로운 여 SNCA 전사를 조절 하는 CRISPR/dCas9-DNA 메 틸 화-기반 시스템 개발. 죽은의 구성 된 시스템을 제공 (비활성화) 버전 Cas9의 DNA methyltransferase 효소 3A의 촉매 도메인 (dCas9) 융합 (DNMT3A), lentiviral 벡터 사용 됩니다. 이 시스템 SNCA 로커 스의 triplication와 셀에 적용 되 고 SNCAmRNA와 단백질 수준 SNCA intron 1의 타겟된 DNA 메 틸 화를 통해 약 30% 감소 시킨다. SNCA 레벨의 미세 downregulation 질환 관련 세포 고기를 구출 하 고 현재 프로토콜에서 우리 hiPSCs 신경 조상 세포 (Npc)와 설립 SNCA 에서 메 틸 프로필의 평가 대 한 pyrosequencing 분석 실험의 유효성 검사로 차별화에 대 한 단계별 절차를 설명 하고자 intron 1. 좀 더 자세하게에서이 실험에서 사용 된 lentivirus-CRISPR/dCas9 시스템 개요,이 프로토콜에 설명 합니다 생산, 정화, lentiviral 벡터를 집중 하 고 epigenome 게놈 편집 응용 프로그램을 사용 하 여 그들의 적합성을 강조 하는 방법을 hiPSCs 및 Npc입니다. 프로토콜은 쉽게 적응 그리고 생체 외에서 그리고 vivo에서 응용 프로그램에 대 한 높은 titer lentiviruses를 생산 하는데 사용 될 수 있습니다.

서론

여러 epigenome 편집 플랫폼 최근 유전자 식¹^,²를 제어 하는 지역에서 어떤 DNA 시퀀스를 대상으로 개발 되었습니다. 만든된 epigenome 편집 도구는 (i) 전사 조절, (ii) 변경 posttranslational 히스톤 수정, (iii) 수정 DNA 메 틸 화, (iv) 규제 요소 상호 작용을 조절 하는 설계 되었습니다. 비활성화 (죽은) Cas9에 전사/chromatin 한정자를 접근 (dCas9) 발생 이전에서 아연 등 개발된 epigenome 편집 플랫폼, 단백질 (ZFPs) 및 녹음 방송 활성 제 같은 이펙터 (이야기), 손가락 은닉 강력한 transcriptional 이펙터 도메인 (ED) 디자인 DNA 바인딩 도메인 (DBD)³융합. 활성화 또는 억제 등 원하는 표현 형의 결과 생 loci (그림 1)에 고정 효과 기 분자에 의해 정의 됩니다. 프로그래밍 가능한 transcriptional 활성 제를 만들려면 dCas9/gRNA 모듈은 VP16⁴^,^,^5<....