방법 논문

생체 내 신경 아키텍처 연구를 위한 엔지니어링된 신경 전구체의 내 측 통 이식

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DOI:

10.3791/59242

⸱

2019년 5월 11일

 ,  , 
1Laboratory of Cerebral Cortex Development, SISSA

이 논문에서

요약

신경 전구체의 생체 외 렌티 바이러스 공학에 기초하여, 야생 형 뇌로의 공동 이식및 "테스트"와 "제어"유도체의 쌍 형태 평가, 이 방법은 신피질의 생체 내 유전자 제어의 정확한 모델링을 할 수 있습니다 간단하고 저렴한 방법으로 뉴런 형태.

초록

신경 세포 아키텍처의 유전자 제어는 현재 집중적 인 조사의 대상이됩니다. 여기서 설명된 간단한 방법은 신피질 프로젝션 뉴런 형태학의 생체 내 유전자 조절을 연구하기 위해 개발된 간단한 방법이다. 이 방법은 (1) 신경 전구체의 시험관 내 렌티바이러스 공학을 "시험" 및 "대조군" 세포로, (2) 야생형 뇌로의 공동 이식, 및 (3) 그들의 신경 유도체의 쌍형 형태측정 평가에 기초한다. 특히, E12.5 panneuronal에서 창 구체, 유전적으로 표지 된 기증자, 이 목적을 위해 사용 됩니다. 그들은 선택된 프로모터와 tetON /OFF 기술을 활용하도록 설계되었으며 신생아 측삭 실로 자유롭게 이식됩니다. 나중에, 수신자 두뇌의 면역 형광 프로파일링시, 이식된 뉴런의 실루엣은 NeurphologyJ 오픈 소스 소프트웨어로 공급되고, 그들의 형태 측정 파라미터는 추출되고, 평균 길이 및 분기 지수는 계산됩니다. 다른 방법에 비해, 이것은 세 가지 주요 장점을 제공합니다 : 그것은 저렴한 비용으로 이식 유전자 발현의 미세 한 제어를 달성 할 수 있습니다, 그것은 단지 기본적인 수술 기술을 필요로하고, 제한된의 분석에 통계적으로 신뢰할 수있는 결과를 제공합니다 동물의 수. 그것의 디자인 때문에, 그러나, 신경 건축의 비 세포 자율적인 통제를 다루기 위하여 적시이지 않습니다. 더욱이, 신경이동이 완료된 후 신경외형태 조절을 조사하는 것이 바람직하게는 사용되어야 한다. 본 제형에서, 이 방법은 글루타마테르기성 신피질 뉴런 아키텍처의 유전자 제어를 조사하기 위해 정교하게 조정된다. 다른 특정 신경 세포 유형에서 EGFP를 발현하는 형질전환 라인을 활용하면, 그들의 아키텍처의 유전자 제어를 해결하기 위해 재사용될 수 있다.

서론

여기에서 우리는 우리가 신경 세포 건축의 생체 내 유전자 통제를 해부하기 위하여 개발한 간단한 방법을 기술합니다. 신경 전구체의 시험관 내 공학에 기초하여, 신생아 뇌로의 이식 및 "테스트"와 "제어"세포의 쌍 형태 평가, 그것은 에서 신경 형태학의 미세 한 제어에 테스트 유전자의 기능적 의미를 공개 할 수 있습니다 빠르고 저렴한 방법. 뉴런 아키텍처의 생체 내 유전자 제어를 조사하려면 세 가지 주요 기술적 문제를 해결해야 합니다: (1) 적절한 패턴의 유전자(GOI) 발현및 정확한 정량적 제어를 달성하는 것; (2) 뚜렷한 뉴런 실루엣의 적절히 분할된 시각화를 얻는 것; (3) 제한된 수의 동물을 고용하면서 결과의 통계적 유의성을 유도한다.

가능하면, 테트라사이클린(tet)-제어형 트랜스게네전지유전자를 항하는 마우스 돌연변이선은제1호를 해결하는 가장 좋은 도구일 수 있다. 대안적으로, 체세포 성 족제는 채택될 수 있다. 이러한 경우, 이식유전자는 전기천공2 또는 바이러스성 전달3을 통해 전달된다. 다음으로, EPIsome (예를 들어, 표준 전기 포더레이션4시) 또는 게놈에 통합됩니다 (무작위로, 레트로바이러스 인테그라제 5를 통해; 또는 정의된 위치에서, CRISPR 촉진 상동성 재조합 (SLENDR)6 ).

둘째, 뉴런 실루엣 시각화는 (a) 희소 균일 한 라벨링 또는 (b) 조밀한 차동 라벨링을 통해 달성될 수 있다. 희소라벨링에 관해서는, 고급 골지유사 방법론은 7,선택된 뉴런 미니세트는 바이오시틴8에의해 채워질 수 있고, 염-후추 라벨링은 희소하게 발현된 트랜스유전자 덕분에 얻어질 수 있다. 이러한 이식유전자는 변종 전사(Thy-EGFP) 9를 표시하거나 단층 재결합(MORF)(MORF)에의해 활성화될 수 있다. (b)에 관해서는, 최첨단 전략은 다중 플록스형 형광단백질 이식유전자 어레이(Brainbow)11,뿐만 아니라 피기박-트랜스포사아제 구동 형단백질 유전자의 게놈 통합, 이전에 내의 Cre-중재된 확률재조합을 포함한다. 체세포 전염 (CLoNE)을 통해 전달12.

세 번째 문제에 관해서는, 형태 측정 결과는 종종 동물 간 차이 및 세포 주입 사태에서 기인하는 큰 무작위 가변성에 의해 영향을 받습니다. 이 때문에, 많은 수의 동물들이 일반적으로 GOI 형태 측정 활성을 평가하는 데 필요한 통계적 힘을 달성하기 위해 사용된다.

앞서 설명한 접근법은 종종 고급 기술 기술에 의존하고 과학계 내에서 확산을 제한할 수 있는 눈에 띄는 재정 적 자원이 필요합니다. 이러한 문제를 피하기 위해, 우리는 빠르고 저렴한 방법으로 생체 내에서 신경 아키텍처의 유전자 제어를 해부하는 쉽고 간단한 파이프 라인을 구상했다. 이는 항모세포 이식 유전자 활성(13)의 빠른 생체 내 평가를 위해이전에 개발된 유사한 공동 이식 설계에서 영감을 받았다.

구체적으로, 시험관 내 설계 "녹색" 신경 전구체("테스트" 및 "대조군" 세포)를 "검정" 수용자 신생아 뇌로 동시 이식하면 위에 열거된 세 가지 주요 문제를 동시에 해결할 수 있다고 생각됩니다. 사실, 전구체의 생체 외 렌티 바이러스 공학, 잘 제어 된 조건에서, 최소의 신경 이식 유전자 발현의 가변성의 유지 보수를 허용, 훨씬 아래 그 일반적으로 생체 내 체세포 조작과 관련된 (이전에 수행 14세 , 15 및 게시되지 않은 결과). 그 결과 유전자 발현의 정확한 제어는 테트 제어 형질전환 모델에 의해 달성된 것과 비교할 수 있다. 그러나, 이 절차의 비용은 형질전환 마우스 라인의 유지 보수에서 유래하는 그보다 훨씬 낮습니다. 다음으로, 자유 로운 손 세포 주입은 쉽고 최소한의 훈련이 필요합니다. 더욱이, 각 뇌에 주입된 표지된 전구체의 양은 이식된 동물의 총 수를 최소한으로 유지하면서, 희소하게 분포된 전구체의 충분한 누적 수를 달성하기 위해 용이하게 조정될 수 있다. 마지막으로, 상이한 불소 표지, "테스트" 및 "제어" 전구체의 공동 주사제 및 결과에 대한 후속 쌍별 통계 분석은 동물 간 실험 가변성의 효과를 중화하여 결과의 통계적 유의성, 심지어 개인의 제한된 수의 분석에 따라13.

빠르고 저렴하지만이 방법은 두 가지 주요 제한 사항이 있음을 강조해야합니다. 첫째, 뉴런 아키텍처의 세포 자율 유전자 제어를 조사하도록 설계되었으며 환경 제어를 해결하는 것은 적절하지 않습니다. 둘째, 이식된 뉴런 전구체가 이종성 스케줄에 의해 최종 위치에 도달함에 따라, 이 방법은 과거 마이그레이션 완료가 발생하는 신경설계학적 제어를 모델링하는 것이 바람직하다.

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프로토콜

여기에 설명된 모든 방법 및 절차는 SISSA Organismo preposto al Benessere Animale(SISSA IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. 엔지니어링 "녹색"선조 풀의 생성

  1. "녹색"풀의 준비
    1. MtaptEGFP/+ 설립자16과야생 형 CD1 암컷을 짝짓기 . 임신한 댐을 자궁경부 전위 후 12.5일(0일째)에서 안락사시키고 배아12.5(E12.5) 배아를 수확한다. 차가운 PBS 용액에서 24 개의 멀티 웰 플레이트의 개별 우물에 놓습니다.
    2. 청색 등등 아래에서 육안 검사를 통해 배아를 빠르게 유전자형화하여 뇌의 녹색 형광 방출을 확인합니다.
    3. "녹색" 배아를 0.6% 포도당으로 차가운 1x PBS로 채워진 10cm 직경의 페트리 접시에 넣고 입체 현미경으로 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 채운다.
    4. 표준 가위를 사용하여 배아 머리를 자르고 #3 및 #5 집게를 사용하여 말살론을 추출합니다.
    5. 두 말뇌파 소포를 분리하고 집게를 사용하여 신피질 을 해부; 해마와 기저 중추 (17)를 제거해야합니다.
    6. P1000 파이펫으로 얼음에 보관된 1.5mL 튜브로 옮겨 신코르티제를 수집합니다.
    7. 해부 된 신코르테스가 튜브 의 바닥에 정착시키십시오.
    8. 가능한 한 상급을 흡인합니다.
    9. 신선한 증식 배지의 400 μL로 신피질을 다시 일시 중단[DMEM-F12, 글루타맥스 1개, 1X N2, 1 mg/mL 소 혈청 알부민(BSA), 0.6% 포도당, 2 μg/mL 헤파린, 20 ng/mL 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 20 ng/mL 표피 성장 인자(EGF), 1X 펜 스트렙, 및 10 pg/mL 아포테리신 B].
    10. P1000, P200 및 P20 팁으로 순차적으로 네오코르틱스를 부드럽게 파이펫하여 팁당 4배씩 흐린 셀 서스펜션을 얻을 수 있습니다.
      참고 : E12.5 신피질 조직은 매우 부드럽습니다. 단일 세포에 해리하는 것은 효소 소화를 전혀 필요로하지 않습니다; 반복 파이펫팅으로 충분합니다.
    11. 수막과 잔여 신피질 덩어리가 2 분 동안 정착하게하십시오.
    12. 세포 현탁액의 상단에서 150 μL (주로 단일 세포를 함유)에서 새로운 1.5 mL 멸균 튜브로 옮니다.
    13. 신선한 증식 배지 150 μL을 추가하고 더 이상 조직 덩어리가 분명해질 때까지 1.1.10-1.1.12 단계를 반복하십시오. 이렇게 하는 동안 P1000 파이펫팅 단계(1.1.10 단계)를 생략합니다.
      참고: 1.1.10-1.1.12 단계의 세 번의 반복은 일반적으로 완전한 조직 해리를 달성하기에 충분합니다.
    14. 뷔르커 챔버(17)에서 트라이판 블루 배제 방법을 사용하여 셀("녹색" 풀)을 카운트하고 신선한 증식 배지를 추가하여 농도를 103 세포/μL로 조정한다.
      참고: 단계 1.1.7-1.1.1.14는 70% 에탄올로 소독된 멸균 층류 후드 하에서 수행되어야 하며 적어도 20분 동안 환기상태로 유지되어야 합니다.
  2. "녹색" 하위 풀 엔지니어링
    1. 렌티 바이러스 감염에 대한 두 개의 별개의 1.5 mL 튜브에 두 개의 하위 풀로 "녹색"풀을 세분화.
    2. 두 개의 전용 렌티 바이러스 믹스와 독립적으로 하위 풀을 감염. 각 믹스에는 "적색 라벨" 바이러스(Pgk1_mCherry) 또는 "블랙" 바이러스(pCAG_lacZ)가 대조군으로서, 테토프 구동 이식유전자(Pgk1p_tTA 및 TRE_transgene) 또는 대조군(Pgk1p_tTA 및 TRE_PLAP) 발현을 위한 바이러스를 포함한다.
      주의: 해당 규칙 및 법률에서 규정한 모든 보호 측정값으로 BLS-2 환경에서 렌티바이러스를 조작하십시오.
      참고: 각 렌티바이러스는 (앞서 도시된14)이러한 실험 조건에서 대부분의 신경 세포를 변환하기에 충분한 8의 감염(MOI)의 복합성으로 투여되어야 한다(그림 1). 테트 트랜스액테이버를 수용하는 렌티바이러스는 tTA/rtTA 발현을 구동하는 다른 뉴런 프로모터를 사용하여 구축할 수 있습니다(예를 들어, pTα1, pSyn, pCaMKII, pGAD1 등) (그림2). MOI는 (a) 그들의 표적 세포의 수에 전달되는 감염성 바이러스 입자의 수의 비율이다. 여기서, 전자(a)는 다른 곳에서 기재된통상의 절차에 따라 계산되고, 후자(b)는 단순히 뷔르커 챔버를 사용하여 평가된다.
    3. 플레이트 600,000 각 감염된 서브 풀의 웰 당 12 멀티웰 플레이트, 증식 배지의 600 μL에서 2 μg/mL의 독시사이클린.
      참고 : 여기, 우물은 그들의 바닥에 신경 세포 부착을 방지 폴리 리신으로 전처리되지 않습니다.
    4. 37°C에서 5% CO2로 인큐베이터로 세포를 전달한다.
    5. 2 일 후, 감염의 효율과 엔지니어링 된 풀의 차동 마킹을 평가하기 위해, 기존의 형광 현미경하에서 세포를 검사한다. 2개의 서브풀은 적색 형광 단백질("대조군" 샘플) 또는 하지 않는 ("시험" 샘플)을 균질하게 발현하는 작은 신경구의 현탁액으로 나타나야 한다. 이러한 신경구 내에서, MtaptEGFP 이식유전자는 소수의 세포(포스트 유사분열 뉴런)에 한정되어 있으며, 이들 대다수(증식 전구체)에서 침묵한다(그림 3).

2. 수술 기구 및 수술 부위의 설정

  1. 보로실리케이트 바늘 준비
    1. 각각 1.5mm 및 1.12mm에 해당하는 외부 및 내부 직경의 보로실리케이트 유리 모세혈관을 사용합니다.
    2. P 1000 풀러로 모세관을 당깁니다.
    3. 당기기 프로그램을 설정합니다. 일반적인 프로그램 매개 변수는 다음과 같습니다: 열 = 614; 벨 = 60; 시간 = 1; 압력 = 600. 풀러 모델과 사용되는 가열 저항에 따라 조정해야 합니다.
    4. 모세관을 풀러 홀더에 넣고 조입니다.
    5. 프로그램을 시작하고 두 개의 당겨진 미세 모세 혈관을 가져 가라.
    6. 모세관 팁을 메스로 손으로 자르고 스테레오 현미경으로 약 200-250 μm의 외부 직경의 팁을 얻습니다.
    7. 모세혈관을 모델링 점토(예: 플라스틱) 지지체에 닫은 페트리 접시에 놓고 후드 밑으로 옮긴다.
  2. 후드 설정 및 셀 트레이서 솔루션 준비
    1. 수평 흐름 후드를 조심스럽게 청소하고 70 % 에탄올을 사용하여 소독하십시오.
    2. 70% 에탄올을 사용하여 광섬유를 소독하고 후드 아래에 놓습니다.
    3. 10 μL의 125 mM EGTA 용액과 10 μL의 패스트 그린을 혼합하여 "셀 트레이서 용액"을 준비하고 후드 아래에 놓습니다.
    4. 세포 현탁액 스포팅을 위해 실험실 밀봉 필름의 작은 조각 (4cm x 2cm 크기)을 잘라냅니다.
    5. 1 mg/mL 멸균 독시사이클린용액을 준비하고 0.3 mL 주사기로 흡인합니다.
    6. 후드를 켜고 수술 전에 20 분 동안 층류 흐름을 유지하십시오.
  3. 사출튜브 조립
    1. 교정된 미세 모세관 파이펫용 흡개한 튜브 조립 키트에서 단단한 플라스틱 마우스피스, 두 개의 라텍스 튜브(각각 약 30cm 길이)와 모세관 홀더를 가져가십시오.
    2. 단단한 플라스틱 마우스피스를 라텍스 튜브의 한쪽 끝에 고정합니다.
    3. 모세관 홀더를 다른 라텍스 튜브의 한쪽 끝에 고정합니다.
    4. 두 라텍스 튜브의 자유 단부를 0.45 μm 멸균 필터로 연결하여 작업자 세균에 대한 장벽으로 합니다.
    5. 생성된 흡기 튜브 어셈블리를 모델링 점토 홀더에 놓아 후드 아래에 보관합니다.

3. 세포 혼합 및 혈관 내 이식

  1. 녹색 셀 하위 풀 "테스트" 및 "제어" 혼합
    1. 별도의 1.5 mL 튜브에서 "테스트" 및 "제어" 신경구(단계 1.2.5 참조)를 수집합니다.
    2. 원심분리기 신경구 현탁액을 200 g에서 5 분 동안.
    3. 세포 펠릿의 방해를 피하고 상급체를 수집하고 폐기하십시오.
    4. 1x PBS의 500 μL로 신경구를 부드럽게 재중단시..
    5. 원심분리기는 200g에서 1분 간 입니다.
    6. 상급체를 제거합니다.
    7. 3.1.4-3.1.6 단계를 두 번 더 반복합니다.
    8. 2x 트립신 용액(2x 트립신, 1x PBS)의 200 μL과 피펫 세포 펠릿을 4x-5x 위아래로 부드럽게 재중단시스터.
      참고 : 기포를 만들지 않도록주의하십시오.
    9. 세포를 37°C에서 5분 동안 인큐베이터에 두어 단일 세포 현탁액을 달성한다.
    10. 트립신 억제제 용액 200 μL (DMEM-F12, 10 μg/mL DNAse I, 0.28 mg/mL 트립신 억제제)을 가진 블록 트립신은 4x-5x 를 위아래로 피펫팅하여.
    11. 200 x g에서 5 분 동안 원심 분리 세포를 5 분 동안 재중단하고 신선한 증식 배지 (DMEM-F12, 글루타맥스 1, 1x N2, 1 mg/mL BSA, 0.6% 포도당, 2 μg/mL 헤파린, 20 ng/mL bFGF, 20 ng/mL EGF, 1x 펜 스트렙, 10 pg/mL 암포테리신 B).
    12. 뷔르커 챔버에서 트라이판 블루 배제 방법을 사용하여 두 풀의 셀을 카운트합니다.
    13. 증식 배지에서 100,000 세포/μL로 농도를 조정합니다.
    14. 1:1 "테스트" 셀을 "제어" 셀과 혼합합니다.
    15. 형광 현미경(객관적배율: 10x)하에서 생성된 혼합물을 확인하여 두 풀의 단일 세포 현탁액이 있는지확인한다(도 3C).
    16. 후드 아래에 얼음에 믹스를 놓습니다.
  2. 혈관 내 이식
    1. 수술 연산 지역에서 멀리 떨어진 테이블에 어머니와 P0 새끼와 케이지를 준비합니다.
    2. 복구 케이지를 후드 가까이에 있는 수레에 놓습니다.
    3. 어머니의 새장에서 가져온 톱밥을 회복 케이지 바닥에 넣고 램프 아래에 놓습니다.
    4. 옆으로, P0 새끼의 마취를위한 알루미늄 호일로 덮인 얼음 상자를 설정합니다.
    5. 이식 직전에 1/10 부피의 세포 추적용 액(2.2.3단계)을 1부(단계 3.1.16단계)에 추가하고 실험실 밀봉 필름에 생성된 "주입 혼합물"의 3 μL을 발견합니다.
    6. 새끼를 시원한 알루미늄 호일에 1 분 동안 놓고 완전히 마취되어 있는지 확인하십시오.
      참고 : 마취를 확인하려면, 부드럽게 발을 짜내고 여전히 호흡하는 동안, 움직임의 부족에 대한 강아지를 모니터링할 수 있습니다.
    7. 한편, 3 μL의 주사 혼합물(단계 3.2.5로부터)을 유리 모세관내로 흡인한다.
    8. 70% 에탄올로 마취된 강아지의 머리를 부드럽게 닦아냅니다.
    9. 피질 반구를 명확하게 식별하기 위해 광섬유의 끝에 강아지의 턱을 놓습니다.
      참고: P0-P1에서는 머리 피부가 매우 얇아 안구 위와 후각 전구 바로 위에 있는 반구를 간단하게 시각적으로 식별할 수 있습니다.
    10. 모세관(3.2.7단계에서 설명한 대로 로드됨)을 후각 전구 위에 있는 두 개의 중간 마비 평면(왼쪽 또는 오른쪽) 중 하나에 보관하고 안구 중심을 포함하는 정면 면과 교차하는 이마 피부를 뚫습니다. 혈관을 손상시키지 않도록주의하십시오. 모세관을 전두엽 피질에 넣고 심실 구멍에접근합니다 (그림 4A).
    11. 신경절 의 우수성의 우발적 인 손상을 방지하기 위해, 그 팁 카달 내측 구를 가리키는30도 에 의해 측면으로 바늘을 회전 (그림 4B).
    12. 세포를 심실 구멍에 부드럽게 주입하고 빠른 녹색 (그림4C)을통해 확산을 모니터링하십시오.
    13. 5-10s 기다립니다.
    14. 셀 현탁액을 흡인하지 않도록 주의하여 유리 바늘을 제거하고 적절한 폐기 통에 버리십시오.
    15. 마취로부터의 강아지 회복 전에 150 μL의 독시사이클린 용액을 복강 내 주사하여 이식 후 이식 유전자 발현을 여전히 유지합니다.
    16. 주입 후, 회복을 위해 즉시 램프 아래에 강아지를 놓습니다.
    17. 5-10 분 동안 램프 아래에 새끼를 두고, 한 번 완전히 깨어, 어머니와 함께 케이지에 배치.
    18. 어머니가 그들을 받아 들일 수 있도록 2-3 시간 동안 운영 된 새끼를 관찰하십시오.
    19. 이식 유전자 발현을 유지하기 위해 0.5 mg/mL 독시사이클린과 50 g/L 자당을 함유한 식수를 케이지에 공급하십시오.
    20. 이식 후 4일 후에 독시비클린 함유 물을 독시프리물로 대체하여 유사분열 후 뉴런에서 이식유전자를 활성화시킵니다. 6 일 동안 독시없는 정권에 마우스를 유지하고 이산화탄소 흡입에 의해 P10에서 안락사한 다음 참수.

4. 이식된 뇌분석

  1. 기관학 및 면역 형광
    1. 이식된 새끼를 이산화탄소 흡입에 의해 세포 이식 후 10일 간 안락사시키고 참수한다. 안락사된 새끼의 뇌를 4°C에서 4%의 파라포름알데히드(PFA)로 밤새 고정시다.
      주의: PFA는 매우 독성; 화학 연기 후드에서 제조업체의 처방전을 엄격히 준수하여 주의하십시오. 라벨이 부착된 폐기물 용기에 PFA 용액 잔류물 폐기
    2. PFA 용액을 제거하고 30 % 자당 용액으로 교체하십시오.
    3. 뇌를 4°C에서 또는 바이알 바닥으로 가라앉을 때까지 둡니다.
    4. 두뇌를 일회용 임베딩 몰드로 옮기고 저온 포함 매체로 약 반쯤 채워넣습니다.
    5. 포함된 뇌를 -80°C에서 동결시.
    6. 저온 극저온을 사용하여 60 μm 두께의 관상 동맥 부분을 잘라냅니다.
      참고: 단일 뉴런의 전체 아키텍처에 관한 정보의 허용할 수 없는 손실이 발생할 수 있기 때문에 더 얇은 부분을 사용하지 마십시오.
    7. 면역형광에 대한 공정 섹션18,19,항 GFP [1:400] 및 항-RFP(mCherry) [1:500] 항체를 사용한다. 1 mg/mL DAPI 용액으로 핵을 카운터스테인[1:200].
  2. 모퍼홈트리
    1. 다음과 같이 공초점 현미경의 작동 파라미터를 설정: z-스택 높이 = 40 μm; 단계 = 2 μm.
    2. RFP 신호 분포의 맹목적인 GFP 양성 뉴런이 풍부한 사진 필드를 선택하는 면역 분석 조각의 사진을 수집합니다.
    3. 이미지를 .nd2 파일로 내보냅니다.
    4. .tiff 파일(그림 5A)으로 최대Z 투영을 생성합니다.
    5. 세포 유전자형에 대한 하순순성 뉴런 골격화 블라인드를 허용하려면 적색 신호를 숨깁니다. 이렇게 하려면 적합한 소프트웨어로 각 .tiff 파일을 열고 조정 레이어를 추가합니다. "레벨", "빨간색"을 선택한 다음 "출력"을 0으로 설정합니다. 파일을 저장합니다.
      참고: 스켈레톤은 원래일반 빨간색 파일에 이전에 액세스할 수 없었던 새 연산자가 이후에 수행됩니다.
    6. 각 숨겨진 빨간색 파일에 대해 기본 이미지에 드로잉 레이어를 추가하고 연필 도구(흰색)를 선택합니다. GFP 신호에 기초하여 소종을 추적 한 다음 신경염수를 추적하십시오.
      참고: 연필 도구는 소마의 경우 40픽셀, 신경과염의 경우 3픽셀로 설정할 수 있습니다.
    7. 뉴런 실루엣을 포함한 다층파일을 저장합니다(그림 5B).
      참고: 뉴런 골격의 후속 분석은 어느 연산자에 의해 수행될 수 있습니다.
    8. 뉴런당 하나씩 검은색 배경이 있는 새 1024 x 1024 16비트 그레이스케일 파일을 만듭니다.
    9. 기본 이미지에서 새 그레이스케일 파일로 단일 뉴런 실루엣을 복사하여 붙여넣습니다. 다층 파일로 돌아가 조정 계층을 끄면 신경 유전자형이 드러나있습니다. 해당 뉴런 유전자형에 추가된 16비트 그레이스케일 파일을 저장합니다.
    10. ImageJ에서 그레이스케일 이미지를 하나씩 가져오고 ImageJ 소프트웨어20의 NeurphologyJ 플러그인으로 골격을 분석합니다(그림5C).
    11. NeurphologyJ 기본 데이터 복사(neurite_length, attachment_points 및 끝점;각각에 대해 "총 면적" 값을 가져 와서 스프레드시트에 붙여 넣고 보조 형태 매개 변수를 계산하는 데 사용합니다. 평균 neurite길이, 분기인덱스) (그림5D).

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결과

절차의 주요 양상에 대한 유용한 정보를 제공하는 5개의 기본 데이터 세트가 있는데, 첫 번째 는 (1) 렌티바이러스 벡터에 의한 신경 전구체 의 환전 및 공동 환전의 효율이다. (2) "시험 유전자"를 구동하기 위해 채용된 프로모터의 주요 특징의 예. (3) 이식 준비가 된 엔지니어링 세포의 예. (4) 신생아 뇌에 세포 미세 주사의 주요 절차 세부 사항을 포함하는 만화. (5) 전체 형태 학적 파이프 라인의 개요.

(1) 다른 MOIs(2,4,8)에서 전달된 프로토타입 렌티바이러스 벡터의 기능을 효과적으로 신피질 전구체를 트랜스듀서하는 것으로 평가하였다. 첫 번째 분석에서, 초기 야생형 신코르티크에서 유래된 신경 전구체는 렌티바이러스 리포터에 의해 감염되었고, mCherry 코딩 서열(cds)을 신경노제-계보 특이적 pTα1 프로모터의 제어하에, MOI=2, 4...

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토론

이 절차의 특정 측면/단계는 매우 중요하며 특별한 주의가 필요합니다. 첫째, (a) 운영자는 BSL-2 를 준수하는 실험실 환경에서 렌티바이러스를 안전하게 조작할 수 있도록 적절하게 사전 교육을 받아야 합니다. 둘째, (b) 신경 제제를 혼합하기 전에, 설명된 바와 같이 두 개의 상응하는 신경구 현탁액을 조심스럽게 세척하여, 원치 않는 렌티바이러스로 인한 두 제제의 지연된 교차 감염을 방지하기 위해 필수적이다. 이월할 수 있습니다. 셋째, (c) 세포를 이식하는 동안, 심실 구멍을 대상으로 하는 동안 주의를 기울여야 한다; 이러한 점에서, 셀 서스펜션에 포함된 패스트 그린 트레이서가 상당한 도움이 된다. 또한 식인 풍습을 예방하기 위해 이식 된 새끼는 마취에서 완전히 회복 된 후에만 어머니에게 다시 옮겨야합니다 (일반적으로 10 분은 충분합니다). (e) 이식된 조직의 극저온 절편은 60 μm에서 수행되어야 한다; 사실, 이 두께는 동시에 조직에 쉽게 항체 침투를 허용하고 관절 신경 단편화에서 발생하는 정보의 손실을 제한합니다....

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

우리는이 절차의 초기 설정에 그의 기여에 대한 미안 덕 도 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.3 mL 주사기BD320840RT
0.45 &mu에 저장합니다. m 멸균 필터Millex-HVSLHU033RSRT
12 멀티 웰 플레이트Falcon353043RT
1X PBSGibco14190-094매장 RT
24 멀티 웰 플레이트Falcon351147RT
항 EGFP 항체, 닭 폴리 클론, RRID : AB_371416TebubioGTX13970-20 &# 176 매장; C
anti-RFP 항체, 랫드 단클론성, RRID:AB_10795839항체 온라인ABIN334653-20 °에 보관; C
anti-Tubb3 항체, 마우스 단클론, RRID:AB_2313773CovanceMMS-435P-20 ° 저장;
C 흡인기 튜브 어셈블리 키트, 교정된 미세모세관 피펫용 키트,RTSigmaA5177-5EA
RT의 NightseaBLS2매장
Kwik-FilTW150-4RT
BSA 매장,SigmaA9647-20 ° 매장; C
Bü RKER 챔버시그마BR7195200.0025 mm2, 0.100 mm
극저온 포함 매체 (Killik)Bio-Optica05-9801RT
DAPI시그마D9542-20 ° 저장; C
일회용 임베딩 몰드Bio-Optica07MP7070RT
DMEM/F-12Gibco31331-028+4 ° 매장; C
Dnase IRoche10104159001-20 °에 매장; C
DoxyciclineSigmaD1822-20 ° 저장; C
Dumont 집게 #3cFine Science Tools11231-20RT
Dumont 집게 #5Fine Science Tools11251-20RT
EGFGibcoPHG0311-20 ° 매장; C
EGTASigmaE3889매장 RT
FGFGibco PHG0261매장 -20 ° C
Fine scissors - SharpFine Science Tools14060-09매장
RT Fungizone (Amphotericin B)Gibco15290018-20 ° 매장; C
GlucoseSigmaG8270매장 RT
GlutaMAX SupplementGibco35050061매장
RT Goat 안티 치킨 Alexa 488InvitrogenA11039매장 -20 ° C
염소 안티-랫 Alexa 594InvitrogenA11007-20 °에 저장; C
헤파린 용액줄기 세포 기술07980-20 °에 저장; C
N2 보충제Gibco17502048-20 °에 보관; C
광섬유LeicaCLS150X
P1000 풀러Sutter InstrumentsP-1000 모델
ParafilmBemisPM-996RT
Pen StrepSigmaP0781-20 ° 저장; C
페트리 접시팔콘353003매장 RT
PFA시그마158127매장 RT
플라스미드 #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP]내장 in housestore at -20 ° C
플라스미드 # 386 [LV_pTa1_mCherry]in house< / em>store를 지었습니다. C
플라스미드 # 401 [LV_pTa1_rtTA (M2)]에서 house< / em>store에 내장 ; C
플라스미드 # 408 [LV_Ppgk1p_rtTA (M2)]in house< / em>store를 지었습니다. C
플라스미드 # 484 [LV_lacZ]Addgene12108-20 &# 176에 저장; C
플라스미드 # 529 [LV_Pgk1p_mCherry]in house< / em>store를 지었습니다. C
플라스미드 # 730 [LV_pSyn_rtTA (M2)]in house< / em>store를 내장; C
메스브라운BB515매장 RT
스테로현미경라이카MZ6매장 RT
Trypan 블루Gibco15250-061매장 RT
TrypsinGibco15400-054매장 -20 ° C
트립신 억제제SigmaT6522-20 °에 저장합니다. 씨
은 블루 라이트 램프의 , , 의 의 -20 &# 176에서 -20 &# 176 -20 &# 176에서 -20 &# 176에서 -20 &# 176에서 는

참고문헌

  1. Kistner, A., et al. Doxycycline-mediated quantitative and tissue-specific control of gene expression in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (1996).
  2. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2011).
  3. Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
  4. Puram, S. V., et al. A CaMKIIβ 2 signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nature Neuroscience. , (2011).
  5. Zuccotti, A., Le Magueresse, C., Chen, M., Neitz, A., Monyer, H. The transcription factor Fezf2 directs the differentiation of neural stem cells in the subventricular zone toward a cortical phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2014).
  6. Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by in Vivo Genome Editing. Cell. , (2016).
  7. Spiga, S., Acquas, E., Puddu, M. C., Mulas, G., Lintas, A., Diana, M. Simultaneous Golgi-Cox and immunofluorescence using confocal microscopy. Brain Structure and Function. , (2011).
  8. Chen, B., et al. The Fezf2-Ctip2 genetic pathway regulates the fate choice of subcortical projection neurons in the developing cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2008).
  9. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. , (2000).
  10. Lu, X. H., Yang, X. W. Genetically-directed Sparse Neuronal Labeling in BAC Transgenic Mice through Mononucleotide Repeat Frameshift. Scientific Reports. , (2017).
  11. Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nature Methods. , (2013).
  12. Garcia-Moreno, F., Vasistha, N. A., Begbie, J., Molnar, Z. CLoNe is a new method to target single progenitors and study their progeny in mouse and chick. Development. , (2014).
  13. Falcone, C., Daga, A., Leanza, G., Mallamaci, A. Emx2 as a novel tool to suppress glioblastoma. Oncotarget. , (2016).
  14. Brancaccio, M., Pivetta, C., Granzotto, M., Filippis, C., Mallamaci, A. Emx2 and Foxg1 inhibit gliogenesis and promote neuronogenesis. Stem Cells. , (2010).
  15. Fimiani, C., Goina, E., Su, Q., Gao, G., Mallamaci, A. RNA activation of haploinsufficient Foxg1 gene in murine neocortex. Scientific Reports. , (2016).
  16. Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nature Neuroscience. , (2001).
  17. Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. Culture of mouse neural stem cell precursors. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
  18. Park, J. J., Cunningham, M. G. Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
  19. Puzzolo, E., Mallamaci, A. Cortico-cerebral histogenesis in the opossum Monodelphis domestica: Generation of a hexalaminar neocortex in the absence of a basal proliferative compartment. Neural Development. , (2010).
  20. NeurphologyJ Manual. , http://life.nctu.edu.tw/~ehwang/Manual.pdf (2012).
  21. Chiola, S., Do, M. D., Centrone, L., Mallamaci, A. Foxg1 Overexpression in Neocortical Pyramids Stimulates Dendrite Elongation Via Hes1 and pCreb1 Upregulation. Cerebral Cortex. , (2018).

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