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방법 논문

꼬마 선 충 에서 도파민 신호 평가에 수영 유도 마비

7.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/59243

⸱

2019년 4월 3일

 ,  , 
1Harriet Wilkes Honors College, Florida Atlantic University, John D MacArthur Campus, 2Integrative Biology and Neuroscience program, College of Science, Florida Atlantic University, 3Brain Institute, Florida Atlantic University, 4Department of Biomedical Science, Charles E. Schmidt College of Medicine, Florida Atlantic University

이 논문에서

요약

수영 유도 마비 (SWIP)가 잘 설립 행동 분석 결과 꼬마 선 충 (C. 선 충)에서 신호 하는 도파민의 기본 메커니즘을 연구 하는 데 사용. 그러나, 분석 결과 수행 하는 자세한 방법을 부족 이다. 여기, 우리가 SWIP에 대 한 단계별 프로토콜을 설명합니다.

초록

이 프로토콜에서 설명 하는 수영 분석 결과 dopaminergic 조절 단백질을 식별 하는 유효한 도구 synapses 이다. 포유류와 마찬가지로, 도파민 (DA) C. 선 충 등 학습과 모터 활동에에서 여러 기능을 제어 합니다. 다 릴리스 (예를 들어, 암페타민 (AMPH) 치료)를 자극 하는 또는 그 다 허가 조건 (예: 동물 다 전송 부족 (dat-1) 는 뉴런을 다를 reaccumulating 할 수 있다) 세포 외 다의 과잉 생성 궁극적으로 저해 운동의 결과. 이 동작은 동물 물에서 수영 하는 때 특히 분명 하다. 사실, 야생-타입 동물 오랜된 시간 동안 수영을 계속, 하는 동안 dat 1 null 돌연변이 야생-타입 AMPH 처리 또는 억제제 다 전송의 우물의 바닥에 침 몰 하 고 이동 하지 않습니다. 이 문제는 "수영 유도 마비" (SWIP) 이라고 불린다. SWIP 분석 결과 잘 설립, 방법의 자세한 내용은 부족 한. 여기, 우리가 SWIP 수행 하는 단계별 가이드를 설명 합니다. 분석 결과 수행 하기 위해 늦은 애벌레 단계 4 동물 또는 AMPH 없이 제어 자당 솔루션을 포함 하는 유리 자리 접시에 배치 됩니다. 동물은 stereoscope에 장착 하거나 수동으로 시각화는 stereoscope 아래 자동으로 카메라와 함께 녹음 하 여 그들의 수영 동작에 대 한 득점 된다. 동영상 다음 탈 곡 주파수와 마비 열 지도 형태로 시각적 표현 생성 하는 추적 소프트웨어를 사용 하 여 분석 된다. 수동 및 자동 시스템 동물 들의 수영 능력의 쉽게 정량 판독을 보장 하 고 따라서 동물 dopaminergic 시스템 내에서 돌연변이 베어링에 대 한 또는 보조 유전자에 대 한 심사를 용이 하 게. 또한, SWIP 명료 AMPH 악용의 약물의 행동의 메커니즘을 사용할 수 있습니다.

서론

동물 다양 한 복잡 한 신호 처리에 의해 조정 하는 다른 신경 전달 물질에 의해 중재는 타고 난 하 고 복잡 한 동작을 수행 합니다. 신경 전달 물질 도파민 (DA) 종, 학습, 운동 기능 및 보상 처리를 포함 하 여에 걸쳐 높은 보존된 행동 중재.

토양 선 충 류 C. 선 충만 302 뉴런으로 구성 된 비교적 간단 하 고 잘 매핑된 신 경계 표시 등 짝짓기, 학습, 구하고, 운동 달걀 누워 다에 의해 규제는 많은 포함 하 여 현저 하 게 복잡 한 동작 1. 다른 기능, 짧은 라이프 사이클, 취급의 용이성 및 신호 분자의 보존, 중 보존된 행동의 신경 기초 공부에 대 한 모델로 C. 선 충 의 장점을 강조.

C. 선 충 자웅 동체 포함 8 dopaminergic 신경; 이들 이외에, 남자 짝짓기 목적 6 여분의 쌍을 포함 합니다. 포유류에서 이러한 신경 다 합성 하 고 다 전송 (DAT-1)는 다 다시 dopaminergic 신경 세포에 시 냅 스 갈라진 틈에 발표 전송 dopaminergic 신경에서 독점적으로 찾아낸 막 단백질을 표현 한다. 또한, 합성, 포장 및 다의 출시의 각 단계에 관련 된 단백질의 대부분은 매우 벌레와 인간 사이 보존 하 고, 같은 포유류, 다 변조 먹이 행동과 C. 선 충2운동.

C. 선 충 고체 표면에 크롤 링 하 고 물에 특성 때리는 행동으로 수영. 흥미롭게도, DAT-1 (dat-1)의 표현 부족 돌연변이 고체 표면에 일반적으로 크롤 링 하지만 물 때 수영을 유지 하기 위해 실패 합니다. 이 문제는 수영 유도 마비 또는 SWIP 되 나. 이전 실험 SWIP, 부분적으로, 발생 했다고 궁극적으로 d 2 같은 postsynaptic 수용 체 (DOP-3) overstimulates 시 냅 스 갈라진 틈에 다의 과잉에 의해 설명 했다. 원래 dat 1 녹아웃 동물3확인, SWIP 야생-타입 동물 블록 활동 DAT (예: imipramine4)의 약물 치료에 관찰 및 유도 다 릴리스 (예: 암페타민5). 다른 한편으로, 합성 및 다의 릴리스를 averting와 DOP-3 수용 체 기능을 차단 약리학 또는 유전자 조작 방지 SWIP6. 함께 찍은, 이러한 이미 게시 된 데이터는 설립 SWIP dopaminergic 시 냅 스3,,47 돌연변이 단백질에 의해 발생 하는 행동 효과 공부 하 고 하에 대 한 신뢰할 수 있는 도구로 다7,,89,10,,1112신호에 관련 된 소설 규제 통로의 식별에 대 한 앞으로 유전 스크린. 또한, 생체에 약물 유발 동작의 쉽게 정량 판독 함으로써 SWIP 수 암페타민 (AMPH) 같은 약물의 행동의 메커니즘의 해명 및 azaperone는 dopaminergic에서 synapses5, 6 , 13 , 14 , 15.

SWIP 분석 실험을 수행 하기 위한 프로토콜16전에 설명 했습니다. 방법론 및 설치 SWIP를 효과적으로 수행 하기 위해 선 충 C. 커뮤니티에 대 한 시각적 가이드를 제공 하는 목적으로 시험을 수행 하는 여기, 우리가 자세히 설명.

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프로토콜

1입니다. 솔루션 및 미디어 준비

  1. KH2포4 3.0 g (22.05 m m), 나2HPO4 6.0 g (42.2 m m), 용 해 하 여 M9 버퍼를 준비 하 고 압력가 이온 물 1 L에 NaCl 5.0 g (85.5 m m). 압력가 마로 소독 후 1m MgSO4 (12 g 100 mL 압력가 이온된 수의 최종 볼륨에서)의 1.0 mL를 추가 합니다. 결과 10 x의 믹스 100 mL 압력가 마로 소독의 900 mL와 M9 저온 1 x 솔루션.
  2. 계란 버퍼 수 있도록, HEPES 압력가 이온 물 1 L에의 6.896 g의 NaCl (118 m m), KCl (48 m m), CaCl2-2 H2O (2 mM), MgCl2-6 H2O (2 mM)의 0.406 g의 0.294 g의 3.578 g과 5.958 g (25 mM)를 분해. PH를 7.3 NaOH를 사용 하 여 조정 합니다.
  3. 이온된 수의 3.8 mL에 5-6% 염소 (표 백제)의 1 mL 및 10 N NaOH의 180 µ L을 추가 하 여 신선한 염소/NaOH 솔루션을 준비 합니다.
  4. 그리고 60 g 자당 무게 60% 자당 해결책을 100 mL의 최종 볼륨을 압력가 이온된 물에 용 해.
  5. 0.684 g 200 m m 자당을 압력가 이온된 수 10 mL에 자당의 분해. 확인 하 고는 osmolarity osmometer를 사용 하 여 동일한 조정. Microcentrifuge 튜브 1.5 mL에 1 mL aliquots을 확인 하 고-20 ° c.에 동결
  6. 100 m m 재고 솔루션을 만들고 이온된 물 10 mL에 용 해 및 0.184 g AMPH (분자량 184.75 g/mol)의 무게. 0.5 m m 작업 솔루션을 물 400 µ L에서 재고 솔루션의 믹스 2 µ L.
  7. 영양 성장 미디어 (NGM) 접시를 준비
    1. 믹스 NaCl의 3 세대 (52.65 m m), 펩, 25 g bacto agar의 및 2 L 삼각 플라스 크에 이온된 수의 975 mL의 20 g. 액체 주기를 사용 하 여 1 시간 동안 자기 저 어 바와 오토 클레이 브 (121 ° C, 15 PSI)를 포함 합니다.
    2. 냉각 하 고 감동 하는 동안 히터에 플라스 크를 배치 하 여 약 50 ° C에서 온도 유지 합니다. 추가 (5 mg/mL에 에탄올), 콜레스테롤의 0.5 mL 1 M MgSO4, 1 mL의 1 M CaCl2 와 25 mL의 1 M 칼륨 인산 염 버퍼, pH 7.4 (KH2포4108.3 g, K2HPO4 의 35.6 g의 1 mL 저온 1 l).
    3. 100 m m x 15 mm 페 트리 접시에 25 mL를 플라스틱 하 고 강화 하기 위해 미디어를 허용 합니다. 최대 4 주에 대 한 상자에 4 ° C에서 거꾸로 접시를 저장.
  8. Lysogeny (파운드) 국물 국물의 준비
    1. 5 g 파운드 가루 믹스 200 mL를 삼각 플라스 크에 이온을 제거 된 물에서 용 해. 액체 살 균을 이용 하 여 30 분 동안 고압 주기. 진정 국물을 허용 합니다. 1-2 주 동안 실내 온도에 상점.
  9. NA22 세균성 접시의 준비
    1. 살 균 피 펫 팁 또는 살 균 세균 루프를 사용 하 여 글리세롤 재고에서 NA22 대장균 박테리아의 작은 볼륨으로 파운드 플레이트를 행진 하 고 품 어 접시 거꾸로 37 ° C 배양 기에서 밤새 고립 된 식민지를 성장 하는 것을. 선택 및 준비 단계 1.8에서에서 파운드 국물의 200 mL에 단일 식민지를 소개 하 고 떨고 플랫폼에서 37 ° C에서 하룻밤 성장 하자.
    2. 씨앗 판, 200 µ L 세균성 문화 단계 1.7에서에서 준비 하 고 메 마른 유리 하 키 막대기로 확산 NGM 접시에의 분배. 플레이트 후드 아래에서 하룻밤 이상 말리 고 4 ° c.에 밀폐 상자에 거꾸로 저장 하자
  10. 벌레를 데리 러 속눈썹/백 금 도구를 접착제 파스퇴르 슈퍼 접착제를 사용 하 여 플라스틱 유리에 두꺼운 속눈썹 또는 백 금 필 라 멘 트. 면도날을 사용 하 여 각도에 속눈썹의 끝을 잘라. 또는 백 금 필 라 멘 트 주위 유리 피 펫의 끝을 녹기 분 젠 버너를 사용할 수 있습니다.

2. 선 충 C. 축산

참고: 야생-타입 N2C. 선 충 문화 대장균 NA22 격판덮개에 긴장. 세부 문화 방법 아래 설명 되어 있습니다.

  1. 벌레 문화의 준비
    1. 벌레의 스타터 문화, 잘 먹이 동물을 포함 하는 접시에서 agar의 작은 조각을 잘라와 1.9 메 마른 주걱을 사용 하 여 단계에서 준비 NA22 대장균 박테리아 접시에 그것을 전송. 3-4 일 동안 20 ° C에서 접시를 품 어. 스테레오 현미경 시각 벗 성인의 존재를 확인 합니다.
  2. 벌레의 동기화 된 인구의 준비
    1. 물 총 병을 사용 하 여 접시 주위 압력가 이온된 수를 분배 하 여 최소 2 접시에서 벗 성인을 수집 합니다. 부드럽게 소용돌이 벌레를 꺼내 려 하 고 일회용 플라스틱 피 펫을 사용 하 여 15 mL 폴리스 티 렌 원뿔 튜브에 벌레를 수집 판을 친다.
    2. 작은 벌레, 다음 진공 펌프를 사용 하 여 표면에 뜨는 발음 2 분 140 x g 에서 원심 분리기에 튜브 아래로 회전 시키십시오 또는 실험실 진공 내장.
    3. Resuspend 및 세척 압력가 이온된 수와 믹스 2 분에 대 한 140 x g 에서 원심 분리기와 튜브를 작성 하 여 벌레는 상쾌한 발음 하 고이 마지막 반복 단계 2 번 더 또는 벌레는 박테리아 (물 혼합 때 분명 나타납니다에서 분명 때까지 벌레).
    4. 웜 펠 릿을 갓 만든된 염소/NaOH 솔루션 (1.3 단계)의 5 mL을 추가 하 고 빠르게 소용돌이 사용 하 여 혼합. 약 4-8 분 동안 로커에 튜브를 품 어. 염소/NaOH 솔루션 외피의 시간 4-8 분 재고 염소 솔루션 (표 백제)의 품질에 따라 번갈아 사용 합니다.
    5. 유리 현미경 슬라이드에 벌레를 포함 하는 솔루션의 드롭 (2-50 µ L)을 넣고 모든 2 분 웜 세포에 대 한 현미경 검사. 벌레의 약 70%는 lysed 계란 출시 때 채우기 계란 버퍼 튜브 단계 1.2에서에서 준비 하 고 즉시 배아 작은 벌레 시체를 140 x g 에서 1 분 동안 원심.
    6. 상쾌한 발음 하 고 때마다 계란 버퍼와 튜브를 작성 하 여 펠 릿 3 번 더 씻어. 140 x g 1 분 동안에 아래로 회전 하 고 제거는 상쾌한 때마다. 펠 릿 세척의 끝에 흰색으로 변합니다.
    7. 최종 세척 후 30% 자당 해결책에서 죽은 시체에서 배아를 구분 합니다. 펠 릿에 압력가 이온된 수의 5 mL을 추가 하 고 resuspend 단계 1.4에서에서 준비 하는 60% 자당의 5 mL을 추가. 철저 하 게 혼합 하 고 6 분 160 x g 에서 원심.
    8. 유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 신선한 15 mL 원뿔 튜브로 위 초승달 모양에 부동 하는 배아를 전송. 3-4 mL 이상 복용 하지 마십시오. 제거 하려면 모든 나머지 자당, 배아를 씻어 3 번 centrifuging 140 x g 3 분에 의해 압력가 물 제거는 상쾌한 고 펠 릿 resuspending (와 튜브를 작성) 각 시간.
    9. 1 x M9 버퍼와 세척을 반복 합니다. 최종 세척 후 M9 10 mL에 펠 릿을 resuspend. L1 애벌레로 부 화 계란을 위해 밤새 통 (더 이상 14 h)에 튜브를 둡니다. 벌레는 음식의 부족으로 인해 L1 애벌레 단계에서 유지 됩니다.
    10. 3 시간 2 분에 대 한 140 x g 에서 centrifuging 애벌레에 의해 발표 어떤 페로몬을 제거 하려면 압력가 물으로 워시는 L1 애벌레 물의 1 mL에서 애벌레를 Resuspend. 1:10 희석 물에 벌레의 플라스틱 유리 슬라이드에 10 µ L 드롭는 coverslip에 넣고는 stereoscope 아래 벌레의 수를 계산. 이것을 두 번 반복 하 고 결과 평균.
    11. 피 펫 작은 배치 하 여 약 1000 벌레는 NA22 플레이트 (실내 온도에 주어진 이전)에 해당 하는 벌레의 볼륨 접시에 떨어진다. 드롭 마르면 때까지 반 오픈 접시를 둡니다. 그런 다음 접시를 커버 하 고 거꾸로 약 44-48 h 또는 벌레는 stereomicroscope에서 시각적으로 확인으로 늦은 L4 단계에 도달 될 때까지 20 ° C 배양 기에서 품 어. 이제 벌레 SWIP에 대 한 테스트할 준비가 되어 있다.

3입니다. SWIP

참고: 야생-타입 웜 AMPH 치료에서 SWIP 평가의 수동 방법을 설명 합니다. 우리는 또한 짧게 벌레의 추적 및 자동된 웜 추적기와 Hardaway 외.10이전에 설명한 추적 소프트웨어를 사용 하 여 웜 활동의 추가 분석을 논의.

  1. 수동 메서드 SWIP에 대 한 테스트를
    1. Aliquot 40 µ L 200 mOsm/L 자당 솔루션 또는 자리 유리판에 0.5 m m AMPH 없이. Stereoscope, 아래 속눈썹 또는 백 금 8-10 늦은 L4 단계 웜 선택 선택 하 고 잠수함 웜 선택 밖으로 이동 하 고 솔루션으로 수영 때까지 솔루션을 포함 하는 접시에서 선택. 잘으로 선택 하는 벌레의 수, 타이머 시작, 관찰 하 고 각 분 마크에서 SWIP를 전시 하는 벌레의 수를 기록.
    2. 원시 데이터를 스프레드시트에 복사 고 웜 웜 분석 결과 통해 테스트의 총 수에 의해 각 순간에 마비 하는 벌레의 수를 나누어 마비의 비율을 계산 하 고 100을 곱하십시오. 어떤 그래프에 백분율 값을 복사 하 고 통계 소프트웨어 및 플롯 Y 축 백분율 값 및 X 축 XY 그래프를 사용 하 여 시간 데이터 형식.
    3. 다음에 post hoc 분석 (예를 들어, Bonferroni 테스트 후) 제어, AMPH 그룹 및 치료 시간 중 통계적 의미를 테스트 하는 양방향 ANOVA를 수행 합니다.
  2. SWIP의 자동된 분석
    1. 한 번에 단일 벌레에 자동화 된 분석을 수행 합니다. 프로토콜 설정 카메라, 벌레 추적 소프트웨어 및 추적 소프트웨어를 실행 하는 스크립트를 분석 Hardaway 외.16에 자세하게 설명 되어 있습니다.
    2. 간단히, 절 3.1.2에에서 수동 방법에 설명 된 대로 속눈썹 선택, 활용 하 여 유리 자리 접시에는 단일 늦은 L4 단계 자웅 동체를 놓습니다. 당시 한 벌레의 수영 동영상을 기록 하 고 벌레 추적 소프트웨어를 사용 하 여 신체 굴곡의 빈도 계산.
    3. 벌레 탈 곡 데이터에서 열 지도 생성 하 고 웜 탈 곡 주파수를 추적 소프트웨어와 함께 제공 하는 스크립트에 따라.

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결과

선물이 SWIP 분석 결과 AMPH 치료에 의해 유도 된의 예. 그림 1 에서는 위에서 설명한 대로 분석 결과 설정의 도식 대표. 수동 분석 결과, 약 8-10 나이 동기화 된 늦은 L4 단계 벌레는 속눈썹 또는 백 금 수집 선택 하 고 유리 자리 접시 200 mOsm/L 자당 (제어 솔루션) 또는 0.5 m m AMPH 자당의 40 µ L를 채워지고, SWIP에 대 한 테스트에 배치.

동물 수영을 중지 하는 경우 (즉, SWIP 전시), 그들은 신속 하 게 우물의 바닥에 침 몰 하 고 이동 하지 않습니다. 따라서, 여전히 우물의 바닥에 꾸준한 사람 대 물의 표면에 수영 동물 사이 차별은 매우 간단 합니다. 벌레의 대부분 AMPH 치료에서 SWIP 점차적으로 전시 하는 동물의 수는 증가 하는 반면에 적어도 10...

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토론

여기, 우리는 행동 분석 결과, SWIP, C. 선 충에서 수행 하는 단계별 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜 없이 주요 기술적인 장애물이 분석 결과 매우 사용자 친화적인 만들기로 간단 하 고 직관적입니다. 그럼에도 불구 하 고, 분석 결과 효과적으로 수행 하기 위해 고려해 야 할 몇 가지 중요 한 측면 있다.

분석 결과 대 한 사용 하는 웜 때문에 식이 제한에 영향을 미치는 SWIP17잘 먹이 되도록 주의 한다. 부드러운 따기 (백 금 선택을 사용 하는 경우에 일반적인 더) 또는 염소/NaOH 솔루션에 배아의 확장된 노출 동안 외상 할 수 있는 세포 중 잘 초과 염소/NaOH 처리는 중요 한 단계를 따기 동안 벌레의 처리 웜18 에 영구적인 손상을 원인과 따라서 수영을 자신의 능력을 손상 시킬.

무 균 기법 오염을 피하기 위...

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공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

저자 박사 오사마 Refai SWIP의 자동 분석 지침에 대 한 박사 랜디 Blakely의 연구소에서 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 LC NIH R01 DA042156에서 자금에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
알루미늄 호일Reynolds 랩1091835
AmphetamineSigma51-63-8   
오토클레이브
세균 인큐베이터New Brunswick ScientificM1352-0000
세균 등급, AgarLab Scientific, Inc  A466
Bacto (TM) PeptoneBDREF 211677
Calcium Chloride (dihydrate)Sigma-AldrichC3881
카메라 ThorlabsU-CMAD3
원심분리기 Eppendorf 5810R 15ampE215059
콜레스테롤Sigma-Aldrich57-88-5
탈이온수MilliporeZ00QSV0WWMilli-Q
Depression 유리 스포트 플레이트CorningCorning, Inc. 722085
Erlenmeyer 플라스크ThermoFisher4103-0250PK
속눈썹
유리 슬라이드Fisherbrand12-550-15
그래프 및 통계 소프트웨어PrismGraphpad 5
HEPESSigma-AldrichRB=H3375 & H7006
하이포아염소산염Hawkins차아염소산나트륨 4-6%, USP" 1
LB 육수, MillerFisherBP1426
염화마그네슘(육수화물)Sigma-AldrichRB=M0250500g
황산마그네슘(헵타하이드레이트)Sigma-AldrichM1880
마그네틱 스티어 바Fisherbrand16-800-510 
마이크로 원심 분리기 튜브ThermoFisher69715
NA 22 박테리아CGC
NystatinSigma1400-61-9
삼투압 계Advanced Instruments, Inc모델 3320
파스퇴르 피펫Fisherbrand13-678-20A
PetriplatesFalcon351007
pH 측정기Orion VersaStar ProIS-68X591202-B 0514
폴리스린 원뿔형 튜브Falcon352095
Potassium ChlorideSigma-Aldrich P9541
인산이수소 칼시그마-알드리치7778-77-0
인산칼륨 - 이염기성 시그마-알드리치P-8281
인산칼륨 - MONOBASIC시그마-알드리치P0662
혈청학 피펫VWR10ml=89130-898
셰이커신뢰할 수 있는 과학55S 12x16
염화나트륨FisherRB = BP358-1
인산이 수소 나트륨FisherRB = S381
스프레드 시트MS officeMicrosoft Excel
스테레오 현미경Zeiss모델 tlb3. 1 stemi2000
멸균 피펫 팁다양한02-707-400
설탕Sigma-AldrichRB=S5016
초강력록타이트1647358 .14 oz.
SwimR 소프트웨어10.18129/B9.bioc.SwimR
Tracker 2Worm Tracker 2.0www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/
비디오 녹화 소프트웨어Virtualdubhttp://www.virtualdub.org/
갤런 륨

참고문헌

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  5. Carvelli, L., Matthies, D. S., Galli, A. Molecular mechanisms of amphetamine actions in Caenorhabditis elegans. Molecular Pharmacology. 78 (1), 151-156 (2010).
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  7. Bermingham, D. P., et al. The Atypical MAP Kinase SWIP-13/ERK8 Regulates Dopamine Transporters through a Rho-Dependent Mechanism. The Journal of Neuroscience. 37 (38), 9288-9304 (2017).
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  14. Safratowich, B. D., Hossain, M., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine Potentiates the Effects of -Phenylethylamine through Activation of an Amine-Gated Chloride Channel. Journal of Neuroscience. 34 (13), 4686-4691 (2014).
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