Vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 Neurovascular 단위의 내 피와 폐해 장벽의 장애 시각화

요약

여기, 선물이 vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 혈관 단위의 장애를 조사 하는 프로토콜. 우리는 특별히 명과 limitans에서 혈액-뇌 장벽 침투성 및 백혈구 마이그레이션에 관련 된 gelatinase 활동을 확인 하는 방법 주소.

초록

혈관 단위 (NVU)는 혈액-뇌 장벽 (BBB), 포함 된 pericytes와 내 피 지하실 막 형성 microvascular 내 피 세포의 구성 및 명과 limitans 구성 parenchymal 지하실 막 그리고 astrocytic 끝-피드 중앙 신경 시스템 (CNS) microvessels의 abluminal 측면을 수용. CNS 유지 이외에 항상성은 NVU 면역 세포 CNS에 밀매 제어 합니다. CNS의 immunosurveillance 동안 활성화 된 림프 톨의 낮은 수 BBB 부전 또는 임상 질병을 유발 하지 않고 내 피 방 벽을 교차 수 있습니다. 대조적으로, 다 발성 경화 증 또는 그것의 동물 모델에서와 같은 neuroinflammation 동안 실험적인 자기 면역 뇌 (EAE) 면역 세포의 많은 교차 BBB와 이후 결국 CNS 실질 도달 명과 limitans 임상 질병을 선도. 면역 세포 마이그레이션 CNS 실질에 이렇게 독특한 분자 메커니즘을 채용 하는 NVU의 내 피와 폐해 장벽을 가로질러 순차적 마이그레이션을 포함 하는 2 단계 프로세스 이다. 만약 내 피 장벽을 가로질러 그들의 통행 다음, T 세포 발생 그들의 현지 재 gelatinases의 초점 활성화로 이어지는 후속 메커니즘을 시작할 것 이다 혈관 주위 항 원 제시 세포에 그들의 동족 항 원 하 폐해 방 벽을 교차 하 여 CNS 실질 입력 T 셀 수 있게 된다. 따라서, BBB 침투성 및 MMP 활동 EAE 동안 CNS에 면역 세포 축적에 공간 상관 관계에서 모두, 평가 NVU의 내 피와 폐해 장벽의 무결성의 손실을 지정할 수 있습니다. 우리는 여기 활성 예방 접종에 의해 C57BL/6 쥐에서 EAE를 유도 하는 방법과 이후에 BBB 침투성 생체 조건 exogenous 형광 추적기의 조합을 사용 하 여 분석 하는 방법을 보여줍니다. 우리 더 쇼, 시각화 하 고 현장에서 zymogaphy immunofluorescent stainings BBB 지하실 막과 CD45 + 침입 면역 세포의 결합에 의해 EAE 두뇌에 gelatinase 활동을 지역화 하는 방법.

서론

모든 신체 및 척추 동물, 정신 기능을 조정 하는 중앙 신경 시스템 (CNS) 그리고 CNS 항상성 뉴런의 적절 한 의사 소통을 위해 필수적 이다. CNS 항상성 neurovascular 단위 (NVU) CNS의 혈 류 변화 환경에서 보호에 의해 보증 된다. NVU 2 설정 CNS microvascular 내 피 세포의 화학적 고유 하 고 지속적인 누화와 pericytes, 이다, 신경, 세포 외 기질 (ECM) 구성 요소에에서 혈액-뇌 장벽 (BBB)를 설정, 구성 고유한 지하실 막¹. 내 피 지하실 막 BBB 내 피 세포의 abluminal 측면 pericytes의 높은 수 항구 이며 laminin α4와 다른 ECM 단백질²뿐만 아니라 laminin α5는 ensheathes. 반면, parenchymal 지하실 멤브레인 laminin α1 및 laminin α2의 구성 되어 있으며 astrocytic 끝-피트에 의해 포용입니다. 사이토 끝-피트 함께 parenchymal 지하실 멤브레인 가득 척수 혈관 주위 또는 거미 막 밑 공간³에서 CNS 신경 네트워크 분리 명과 limitans를 작성 합니다. NVU의 독특한 구조 때문에 CNS에 밀매 하는 면역 세포는....

프로토콜

모든 연구 동물의 보호에 스위스 법률에 따라 지침에 따라 실시 했다 고 구획의 베른, 스위스의 수의 사무실에 의해 승인 (허가 번호: 31/17 수 고 수 77/18).

1. 특정 병원 체 자유롭게 (SPF) 조건에서 C57BL/6 마우스의 주택

1. 집 쥐 개별 환기 케이지 12/12 h 빛-어둠에에서 주기. 음식을 제공 하 고 광고 libidum 물. 쥐의 미생물 품질 감독, 실험 코 호트 분기 상태 모니터링 더러운 침구 넬 FELASA 추천¹³다음으로 받았다.
2. 개별적으로 마크 8-12 주 오래 된 여성 C57BL/6 쥐 귀 펀치를 사용 합니다.

2입니다. C57BL/6 마우스의 면역

1. 솔루션¹⁴의 준비:
   1. 대 한 완전 한 Freund의 보조 제 (CFA), 혼합 갓 pestled 열 120 mg와 불완전 한 Freund의 보조의 30 mL 비활성화 증기 두건에서 결핵균 (H37RA). 4 ° c.에 게 재고 솔루션
   2. MOGaa35-55-펩타이드 재고 솔루션에 대 한 MOGaa35-55-펩타이드 살 균 PBS (4 mg....

결과

C57BL/6 쥐에서 EAE의 임상 과정의 평가 질병 곡선 그림 2A 와 그림 2B에 제시 된으로 마우스 몸 무게 변화에 묘사 된 대로 발생 한다. MOGaa35-55 일반적으로 접종 하는 C57BL/6 마우스 활성 예방 접종 (그림 1A) 후 하루 10-12 주위 질환 증상을 개발 하기 시작 합니다. 일반적으로, 면역된 생쥐 유제의 주입 및 백 일 해 독 소 (그림 1B)의 첫 번째 접종 후 하루 체중의 과도 한 방울을 표시합니다. EAE 유도 후 하루 2에서에서 다음 면역된 생쥐의 몸 무게 점차 증가 질병 시작까지 몸 무게 일반적으로 임상 증상의 개발에 앞서 1 일 삭제 하 고 계속 증가에 연관 감소 하 질병 증상 (그림 1A,B).......

토론

여기, 선물이 유도 하 고 여성 C57BL/6 쥐에서 EAE 모니터링 프로토콜. 여성은 우선적으로 선택 하 고, 그리고 여자의 발생률: MS에서 3: 1의 남자. 우리가 만든 EAE의 심각도 평가 하기 위해 3-포인트 점수 시트의 사용. EAE 심각도 모터 장애의 심각도 관하여 일반적으로 득점 된다. 마우스와 고급 EAE의 단계, 즉 2 위 점수를 전시 동물의 불필요 한 고통을 피하기 위해 희생 되어야 한다. 따라서,는 것이 좋습니다 예: 가까운 간격으로 쥐를 득점 하는 프로토콜에 설명 된 대로 두 번 매일.  여러 개의 0-6 포인트 0-3에서 도달 점수 루틴을 고용,^16,17,,1819 또는 더 많은 subpoints²⁰포인트. 그러나, 우리는 이전 살 일.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
AMCA 항토끼 항체	Jackson ImmunoResearch	111-156-045	Store at 4 ° C; 빛으로부터 보호
Anti-CD45 항체 (30F11)	Pharmingen	07-1401	4 °에 저장; C
안티 라미닌 항체	DAKO	Z0097	4 °에 저장; C
사육 식품	예: PROVIMI KLIBA SA	3336
개별 환기 케이지, 블루 라인 유형 II 또는 III	예: Tecniplast	1145T, 1285L
BSA fraction V	Applichem	A1391	에 보관; C
차가운 젤라틴	Sigma-Aldrich	G 9391
Coplin jar + 랙	예: Carl Roth GmbH + Co. KG	H554.1; H552.1
Cy3 항쥐 항체	Jackson ImmunoResearch	111-156-144	Store at 4 ° C; 빛으로부터 보호
커버 슬립 24 x 40 mm # 1	예 : Thermo Scientific	85-0186-00
Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW)	예 : 분자 프로브	D22910	-20 °에서 저장; C; 빛으로부터 보호하십시오
Dextran Texas Red (3000 MW)	Invitrogen	D3328	-20 °에 저장; C; 빛으로부터 보호
EnzChek 젤라티나아제/콜라겐분해효소 분석 키트	써모 피셔 사이언티픽; EnzCheck	E12055	-20 °에서 보관; C; 가벼운
암컷 C57BL/6J 마우스(8-12주)	예: Janvier Labs		암컷), 8-12
조직학 슬라이드용 냉동 상자	예: Carl Roth GmbH + Co. KG	2285.1
18G x 1½); ’ ’ (1.2mm x 40mm) 주사 바늘	예: BD, BD Microlance 3	304622
27G x ¾ ’ ’ – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) 주사 바늘	예: BD, BD Microlance 3	302200
30G x ½ ’ ’ (0.3 mm x 13 mm) 주사 바늘	예: BD, BD Microlance 3	304000
Incomplete Freund' s 보조제 (IFA)	예 : Santa Cruz Biotechnology	sc-24648	Store at 4° C
유지 보수 식품	예: PROVIMI KLIBA SA	3436
MOGaa35-55 펩타이드	예: -		Store; C
현미경 슬라이드 (Superfrost Plus)	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Mycobacterium tuberculosis H37RA	예: BD	231141	Store at 4 ° 씨
NaCl 0.9 %	B. 브라운	3535789
O.C.T. 화합물 (Tissue-Tek )	Sakura	4583
Omnican 50 30G x ½ ’ '	B. Braun	9151125S
파라포름알데히드	Merck	30525-89-4
백일해 독소	예: List biological laboratories, Inc.	180	4 °에 저장; C
폴리 (비닐 알코올) (Mowiol 4-88)	시그마 -알드리치	81381
프로테아제 억제제 EDTA 프리 (로슈)	시그마 알드리치	4693132001	4 °에 저장; C
반발 펜, 예: DAKO Pen	예: DAKO	S2002
밀봉 필름, 예: Parafilm M	: Sigma-Aldrich	P7793
실리카겔	예: Carl Roth GmbH + Co. KG	9351.1
스티치 가위	, F.S.T	15012-12
주사기 1ml	예: PRIMO	62.1002
주사기, 10ml	, 예: CODAN Medical ApS	2022-05
기화기 시스템 Univentor 400	UNO.