방법 논문

Vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 Neurovascular 단위의 내 피와 폐해 장벽의 장애 시각화

DOI:

10.3791/59249

⸱

2019년 3월 26일

 , 
1Theodor Kocher Institute, University of Bern

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기, 선물이 vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 혈관 단위의 장애를 조사 하는 프로토콜. 우리는 특별히 명과 limitans에서 혈액-뇌 장벽 침투성 및 백혈구 마이그레이션에 관련 된 gelatinase 활동을 확인 하는 방법 주소.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

혈관 단위 (NVU)는 혈액-뇌 장벽 (BBB), 포함 된 pericytes와 내 피 지하실 막 형성 microvascular 내 피 세포의 구성 및 명과 limitans 구성 parenchymal 지하실 막 그리고 astrocytic 끝-피드 중앙 신경 시스템 (CNS) microvessels의 abluminal 측면을 수용. CNS 유지 이외에 항상성은 NVU 면역 세포 CNS에 밀매 제어 합니다. CNS의 immunosurveillance 동안 활성화 된 림프 톨의 낮은 수 BBB 부전 또는 임상 질병을 유발 하지 않고 내 피 방 벽을 교차 수 있습니다. 대조적으로, 다 발성 경화 증 또는 그것의 동물 모델에서와 같은 neuroinflammation 동안 실험적인 자기 면역 뇌 (EAE) 면역 세포의 많은 교차 BBB와 이후 결국 CNS 실질 도달 명과 limitans 임상 질병을 선도. 면역 세포 마이그레이션 CNS 실질에 이렇게 독특한 분자 메커니즘을 채용 하는 NVU의 내 피와 폐해 장벽을 가로질러 순차적 마이그레이션을 포함 하는 2 단계 프로세스 이다. 만약 내 피 장벽을 가로질러 그들의 통행 다음, T 세포 발생 그들의 현지 재 gelatinases의 초점 활성화로 이어지는 후속 메커니즘을 시작할 것 이다 혈관 주위 항 원 제시 세포에 그들의 동족 항 원 하 폐해 방 벽을 교차 하 여 CNS 실질 입력 T 셀 수 있게 된다. 따라서, BBB 침투성 및 MMP 활동 EAE 동안 CNS에 면역 세포 축적에 공간 상관 관계에서 모두, 평가 NVU의 내 피와 폐해 장벽의 무결성의 손실을 지정할 수 있습니다. 우리는 여기 활성 예방 접종에 의해 C57BL/6 쥐에서 EAE를 유도 하는 방법과 이후에 BBB 침투성 생체 조건 exogenous 형광 추적기의 조합을 사용 하 여 분석 하는 방법을 보여줍니다. 우리 더 쇼, 시각화 하 고 현장에서 zymogaphy immunofluorescent stainings BBB 지하실 막과 CD45 + 침입 면역 세포의 결합에 의해 EAE 두뇌에 gelatinase 활동을 지역화 하는 방법.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 신체 및 척추 동물, 정신 기능을 조정 하는 중앙 신경 시스템 (CNS) 그리고 CNS 항상성 뉴런의 적절 한 의사 소통을 위해 필수적 이다. CNS 항상성 neurovascular 단위 (NVU) CNS의 혈 류 변화 환경에서 보호에 의해 보증 된다. NVU 2 설정 CNS microvascular 내 피 세포의 화학적 고유 하 고 지속적인 누화와 pericytes, 이다, 신경, 세포 외 기질 (ECM) 구성 요소에에서 혈액-뇌 장벽 (BBB)를 설정, 구성 고유한 지하실 막1. 내 피 지하실 막 BBB 내 피 세포의 abluminal 측면 pericytes의 높은 수 항구 이며 laminin α4와 다른 ECM 단백질2뿐만 아니라 laminin α5는 ensheathes. 반면, parenchymal 지하실 멤브레인 laminin α1 및 laminin α2의 구성 되어 있으며 astrocytic 끝-피트에 의해 포용입니다. 사이토 끝-피트 함께 parenchymal 지하실 멤브레인 가득 척수 혈관 주위 또는 거미 막 밑 공간3에서 CNS 신경 네트워크 분리 명과 limitans를 작성 합니다. NVU의 독특한 구조 때문에 CNS에 밀매 하는 면역 세포는 다릅니다 그 주변 조직으로 면역 세포는 2 단계 과정을 필요로 하 고, 먼저 위배 내 피 BBB와 그 후에 명과 limitans CNS 실질에 도달 합니다.

다 발성 경화 증 (MS)은 CNS, 순환 하는 면역 세포의 많은 CNS 입력 한 neuroinflammation, demyelination, 및 BBB 무결성4의 초점 손실의 일반적인 neuroinflammatory 질병 이다. BBB 무결성의 손실 가돌리늄 대조 자기 공명 영상 (MRI)5시각으로 CNS 병 변 강화의 존재에 의해 나타나는 것과 같이, MS의 초기 특징입니다. Postcapillary venules;의 수준에서 발생 하는 CNS에 백혈구 넘쳐 흐름 그러나, 면역 세포 diapedesis BBB 지하실 멤브레인와 이후 폐해 장벽에에서 관련 된 정확한 메커니즘 탐험 남아 있다. 실험적인 자기 면역 뇌 (EAE) ms는 동물 모델 역할 하 고 MS 병 인에 대 한 우리의 현재 지식에 크게 기여 했다. 예를 들어, EAE 모델을 사용 하 여 그것 발견 되었습니다 백혈구 넘쳐 흐름 초기 캡처를 포함 한 다단계 프로세스에서 발생 하 고 풀과 P selectin 당단백질 리간드 (PSGL)-1, 같은 mucin 같은 분자에 의해 중재 단계를 압 연 integrin 종속 회사 체포와 diapedesis6관대 면 BBB 내 피 세포에서 T 세포의 크롤 링에 의해 따라.

일단 T 세포는 내 피 BBB와 내 피 지하실 막 넘어, 그들은 그들의 동족 항 원 대 식 세포 나 수지상 세포를 환자의 또는 혈관 주위 공간에 전략적으로 지역화를 발생 해야 합니다. 이 상호 작용 그 트리거 후속 메커니즘 명과 limitans7,,89통해 면역 세포의 CNS 조직 침공에 필요한 프로-염증 성 중재자의 초점 생산을 유도 합니다. 매트릭스-metalloproteinases (MMP)-2 및 MMP 9의 초점 활성화 chemokine 활성화를 유도 하는 면역에 대 한 전제 조건 인 사이토 끝-피트, 수용 체 세포 외 매트릭스의 저하로 명과 limitans에서 마이그레이션 셀은 CNS 실질 EAE10,11의 임상 증상의 발병을 유도 하 고.

BBB와 면역 세포를 침투 하는 CNS의 탐지를 결합 하 여 CNS 조직 섹션에서 누설 및 gelatinase 활동 neuroinflammation의 맥락에서 내 피 및 폐해 장벽의 기능 무결성에 대 한 귀중 한 정보를 제공 합니다. 예를 들어, 우리는 최근 내 피 꽉 접합 분자 접합 접착 분자 (잼)의 제정 손실 조사-B 면역 세포 EAE의 맥락에서 CNS에 인신 매매. 건강 한 야생-타입 C57BL/6 마우스에 비해, vivo에서 침투성 평가 생 뿐만 아니라 외 인 추적기12를 사용 하 여 같이 건강 한 잼-B-결핍 littermates BBB 무결성의 아무 장애를 보였다. EAE의 맥락에서 잼 B 불충분 한 C57BL/6 마우스 환자 및 혈관 주위 공간12염증 성 세포 트래핑와 연결 했다 ameliorated 질병 증상을 보였다. 이 현상 검사 우리가 적용 현장에서 zymography, 잼-B-불충분 한 쥐에 gelatinase 활동의 부족은 면역 세포 위반 수의 감소 된 숫자에 대 한 책임이 있을 수 있습니다 하는 경우 테스트 하기 위해 gelatinase 활동의 식별을 허용 합니다 명과 limitans12.

가용성을 감안할 때 다른 유전자 수정 마우스 모델 부족, 예를 들어, BBB 기능에 변화를 일으킬 수 있는 다른 BBB 꽉 접합 분자 BBB 무결성 조사 방법론은 중요 하다. 또한, 새로 개발된 된 약물 NVU 장벽에 영향을 줄 수 있습니다. 여기 우리가 myelin oligodendrocyte 당단백질 (MOG)와 활성 예방 접종에 의해 C57BL/6 쥐에서 EAE를 유도 하는 방법을 보여줍니다-완전 한 Freund adjuvants에서 펩 티 드 aa35-55. 우리 다음 exogenous 추적기와 gelatinase 활동의 현장에서 감지 하 여 각각 vivo에서 내 피 및 폐해 장벽 무결성을 공부 하는 방법은 NVU의 내 피 및 폐해 장벽을 통해 면역 세포 침투를 지역화 하는 방법을 설명 합니다.

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프로토콜

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모든 연구 동물의 보호에 스위스 법률에 따라 지침에 따라 실시 했다 고 구획의 베른, 스위스의 수의 사무실에 의해 승인 (허가 번호: 31/17 수 고 수 77/18).

1. 특정 병원 체 자유롭게 (SPF) 조건에서 C57BL/6 마우스의 주택

  1. 집 쥐 개별 환기 케이지 12/12 h 빛-어둠에에서 주기. 음식을 제공 하 고 광고 libidum 물. 쥐의 미생물 품질 감독, 실험 코 호트 분기 상태 모니터링 더러운 침구 넬 FELASA 추천13다음으로 받았다.
  2. 개별적으로 마크 8-12 주 오래 된 여성 C57BL/6 쥐 귀 펀치를 사용 합니다.

2입니다. C57BL/6 마우스의 면역

  1. 솔루션14의 준비:
    1. 대 한 완전 한 Freund의 보조 제 (CFA), 혼합 갓 pestled 열 120 mg와 불완전 한 Freund의 보조의 30 mL 비활성화 증기 두건에서 결핵균 (H37RA). 4 ° c.에 게 재고 솔루션
    2. MOGaa35-55-펩타이드 재고 솔루션에 대 한 MOGaa35-55-펩타이드 살 균 PBS (4 mg/mL)에 녹이 고-80 ° c.에 저장
    3. 집 고 양이 유제 준비:
      1. CFA 1:2 2 mL microtube MOG 펩타이드 재고 솔루션을 희석.
      2. microtube 씰링 필름으로 밀봉 하 고 완전히 접착 테이프를 가진 튜브를 취재 하 여 소용돌이 믹서에 수정. 4 h 4 ° c.에 대 한 소용돌이 유제
    4. 안정 된 에멀젼과 주사기를 준비:
      1. microtube 하 고 신속 하 게 작은 테이블 원심 분리기를 사용 하 여 유제 아래로 회전. 18G x 1½' (1.2 m m x 40 m m) 주사 바늘을 사용 하 여 주사기로 유제를 수집 합니다.
      2. 쥐의 수에 따라 주사기 (100 µ L/마우스)에서 에멀젼 볼륨을 조정 하 고 18 G 바늘 27G x ¾' (0.4 m m x 19 m m) 주사 바늘으로 교체. 씰링 필름으로 주사기에 연결 된 주사 바늘을 봉인.
    5. 백 일 해 독 소 (PTx) 재고 솔루션에 대 한 분해 살 균 PBS의 500 µ L에 동결 건조 된 PTx의 50 µ g (100 ng / µ L). 4 ° c.에 게 재고 솔루션
    6. PTx 작업 솔루션에 대 한 살 균 PBS의 97 µ L 3 µ L 마우스 (용 복 주사 바늘 30G x ½' (0.3 m m x 13 m m)) 당 PTx 재고 솔루션 (300 ng/100 µ L)의 혼합.
  2. EAE 유도
    1. C57BL/6 마우스 기화 기 시스템을 사용 하 여 isofluorane와 anesthetize. 마우스 마 취 유도, 2.1 %isofluorane 안 면을 마우스를 전송 하기 전에 마우스는 작은 인큐베이션 챔버에 산소에 4.5 %isofluorane 노출. 패드 난방 장치를 갖추고 마 취 단위를 사용 하 여 마우스의 저체온증을 방지 하기 위해.
    2. 한 손으로 마 취 마우스를 수정 하 고 먼저 뒷 다리 측면에 MOG35-55/CFA-유제의 30 µ L를 피하 주사 (그림 1: 1 + 2; 총 60 µ L, 왼쪽 측면 30 µ L과 오른쪽 측면 30 µ L) 사 타 구니 림프절에 가까운.
    3. 마우스는 배꼽에 놓고 꼬리 루트에서 왼쪽 및 오른쪽 소프트 지방 조직으로 MOGaa35-55/CFA-유제의 20 µ L를 주사 (그림 1: 3 + 4; 40 µ L 총; 왼쪽 꼬리 루트 20 µ L와 오른쪽 꼬리 루트 20 µ L)와 MOGaa35-55/CFA-유제 int의 작은 방울 o 마우스의 목 (그림 1: 5).
    4. 마우스에 intraperitoneally PTx 솔루션의 100 µ L를 주입 수 있습니다. 소장으로 주사를 피하는 몸 센터 아래 마우스의 머리를 잡으십시오.
    5. 유지 다이어트를 대체 (한다 주요 영양소: 조 단백질 18.5%, 조 지방 4.5%, 조 섬유 4.5%, 원유 재 6.5%; 전 분 35%, 대사 에너지: 13.1 MJ/kg) 다이어트를 번 식 하 (한다 주요 영양소: 조 단백질 23.5%, 조 지방 5.5%, 조 섬유 3%; 원유 재 5.7%; 전 분 36%; 대사 에너지: 14.3 MJ/kg) 전에, 예상된 임상 질병 중 쥐 높은 에너지 콘텐츠는 음식 제공.
    6. 얼굴 마스크를 제거 하 고 지구 온난화 패드의 홈 케이지를 마우스를 전송. 마우스는 완전히 깨어 운동 10 분 후에 다는 것을 확인 하십시오.
    7. PTx 주사 (2.2.4) 48 h 첫 번째 치료 후 반복 합니다.

3. 점수 EAE 쥐의

  1. 감 금 소 내 통해 매일 아침 EAE 쥐의 건강 상태를 확인 하십시오.
  2. EAE 쥐 매일 오후 점수.
  3. 꼬리에 tonus는 손가락으로 위쪽으로 이동 하 여 감 금 소 및 확인 EAE 실험에 포함 된 모든 개별 마우스를 가져가 라. 건강 한 마우스 꼬리를 유지할 것 이다 (꼬리는 tonus는). 임상 EAE 시작 했다 꼬리 tonus 낮은, 꼬리의 점진적 하락으로 표시 될 것입니다. 결국 마우스에 꼬리 리프트 수 없습니다.
  4. 깨끗 한 벤치에 EAE 실험에 포함 된 모든 개별 마우스 관찰 하 고 걷는 동작을 문서화. 질병의 심각도 평가 기준 점수 표 115 참조 (EAE 점수).
  5. 평가 하는 실험에 포함 된 모든 마우스의 무게를 문서화 합니다.
  6. 마우스 임상 EAE를 표시 하 여 적절 한 음식과 물 통풍 관을 위해 1의 점수는 감 금 소의 바닥에 플라스틱 접시에 moistened 식품을 공급 하 고 매일 새로 고침.

4. vivo에서 침투성 분석 결과

  1. 솔루션의 준비:
    1. Dextran 재고 솔루션, 0.9% 염화 나트륨 용액 (20 mg/mL)의 500 µ L에서 3 kDa Dextran 텍사스 레드 10 kDa Dextran 알 렉 사 Fluor 488의 10 mg을 디졸브.
    2. Dextran 작업 솔루션에 대 한 주입 피펫으로 55 µ L 10 kDa Dextran 알 렉 사 Fluor 488의 전에 영화 씰링의 조각에 솔루션 (20 mg/mL)을 재고 하 고 3 kDa dextran 텍사스 레드 재고 솔루션 (20 mg/mL)의 55 µ L를 추가 합니다. 혼합 및 일회용 미세 주사기 (최종 농도 2 mg/100 µ L)으로 100 µ L를 수집 합니다.
    3. 10% 포름알데히드 (PFA) 재고 솔루션에 대 한 결합 10 g 100 mL PBS의 여분의 퓨어 파우더 PFA, 깨끗 한 유리 비이 커에 정확 하 게 56 ° C에서 자력;를 사용 하 여 교 반까지 열 1N NaOH의 200 µ L의 PFA는 완전히 해산; 때까지 30 분 동안 56 ° C에서 유지 실내 온도;에 진정 pH 7.4;를 조정합니다 고 종이 필터를 통해 필터링 합니다. -20 ° c.에 게 PBS를 사용 하 여 추가 재고 솔루션을 희석 수 있습니다.
  2. 곧 건강 한 C57BL/6 쥐 또는 C57BL/6 마우스 (마우스는 약 1 분 동안 진정 될 것입니다) isoflurane EAE에서 고통 anesthetize. 2.2.1 (쥐 4.5 %isoflurane 유도 실에서 산소에서에 노출 되며 2.1 %isoflurane 안 면을 전송) 단계에서 자동화 된 시스템을 사용 합니다.
  3. 마 취 마우스 위치에 배치 측면, 테이블에 다음 정 맥 (예: 복고풍 orbitally) 형광 추적기의 100 µ L을 마우스 주입 전에 마우스 깨어나면.
  4. 바로 안 면을 제거 하 고 마우스는 완전히 깨어 메구미 짧은 마 취 후 다는 것을 확인 한다. 15 분 순환 추적 하자.
  5. 5.1 단계 진행.

5입니다. 마우스의 관류

  1. Vivo에서 침투성 평가:
    1. 깊은 isoflurane 마 취 유도 형광 추적 프로그램 삽입 후 15 분 절차를 시작 합니다. 유도 하기 위해 쥐에 깊은 마 취 산소에서 isoflurane의 2.3%를 사용 합니다. 발 철수 반사를 사용 하 여 마 취의 깊이 판단 (발가락 사이 피부를 꼬집어, 굴곡의 부족 충분 한 깊이 나타냅니다), forelimb와 쥐 EAE 대상이 hindlimb의 반사를 조사 하 고.
    2. 그것의 뒤에 마우스를 해결 하 고 에탄올으로 배를 살포. 한가 위를 사용 하 여 가슴 열고 막 제거 합니다. 한가 위를 사용 하 여 뛰는 심장의 오른쪽 아 트리 움 열고 뒤에 4%의 10 mL PBS의 10 mL와 함께 심장의 좌 심 실을 통해 마우스 perfuse PFA PBS에.
      주의: PFA 흡입을 방지 하는 증기 두건에서 마우스 perfuse.
    3. 섹션 6로 이동 합니다.
  2. 제자리에서 zymography에 대 한:
    1. EAE에서 고통을 마우스에 산소에 2.3 %isoflurane 사용 하 여 깊은 isoflurane 마 취를 유발 하 고 단계 5.1.1에서 마 취의 깊이 확인.
    2. 다음, 그것의 뒤에 마우스를 해결 하 고 에탄올으로 배를 살포. 한가 위를 사용 하 여 가슴 열고 막 제거 합니다. 한가 위를 사용 하 여 뛰는 심장의 오른쪽 아 트리 움 열고 PBS의 20 mL와 함께 심장의 좌 심 실을 통해 마우스를 perfuse.
    3. 섹션 6로 이동 합니다.

6. 해 부와 두뇌의

  1. 냉각 목욕의 준비:
    1. 짓 눌린된 드라이 아이스와 플랫 dewar 용기와 액체 드라이 아이스 팩 위에 약 1 cm를 도달할 때까지 2-methylbutane (Isopentane) 추가. 커버는 느슨한 뚜껑-예를 들어, 얼음 양동이 커버.
  2. 날카로운가 위 perfused 마우스의 머리 공간이 부족 잘라냅니다 고 피부와 귀가 위의 작은 세트를 사용 하 여 제거 합니다.
  3. 왼쪽 및 오른쪽 뇌에 upfold skullcap를 수 있도록 전면 구멍 매그넘에서 절단 하 여 신중 하 게는 skullcap를 해 부. 다음, 조심 스럽게 들어올립니다 그대로 뇌를 두개골의 기지에서 밖으로 평면 금속 주걱을 사용 하 여 광학 신경을 절단 하는 동안.
  4. 알루미늄 호 일에 두뇌를 놓고 두 코로나 컷을 배치 하 여 3 개의 조각 (정면 뇌, 중간 뇌 및 소 뇌 + 뇌 줄기)에서 뇌를 잘라.
  5. Cryomold (25 m m x 20 m m x 5 m m) 1 분기에 최적의 온도 절단 (O.C.T.) 매트릭스, cryomold에 아래쪽으로 직면 하 고 각 뇌의 앞쪽 측면 뇌 조각 장소를 커버 O.C.T. 매트릭스와 완전히 조직.
  6. 2 Methylbutane 목욕으로 수평 방향으로는 조직으로 cryomold를 놓고는 조직을 동결 하단에서 상단에 1 분 이내 목욕으로 전체 조직 블록을 찍기 피하 여 다는 것을 확인 합니다.
  7. 저장용-80 ° c 냉동된 조직 전송 및 섹션 7 진행.

7입니다. 언된 조직 단면도의 준비

  1. 온도-20 ° c에서 30 분 동안 cryostat-80 ° C에서 냉동된 조직에서 equilibrate
  2. Cryomold와 cryostat 조직 홀더 (-15 ° C로 설정)에 산에서 조직 블록 제거 O.C.T. 매트릭스를 사용 하 여.
  3. 날카로운 메스로 cryostat의 소유자 조직 블록의 가장자리를 트림 하 고 조직 표시 될 때까지 cryostat 칼으로 20 µ m 섹션을 제거 하 여 조직 블록으로 절단 시작 합니다.
  4. Vivo에서 BBB 침투성의 분석:
    1. 6-10 µ m 조직 단면도 절단, 접착 유리 슬라이드에 그들을 수집 하 고 즉시 이미지 섹션 형광 현미경을 사용 하 여 커버 슬립으로 덮여.
    2. 뇌 (형광 패턴 새 혈관에 대 한 관찰을 확산에 비해 비 새는 혈관의 날카로운 주의)에서 혈관의 모양을 평가 합니다. 긍정적인 컨트롤로 circumventricular 장기 또는 부족 한 BBB 맥락 막 신경 총의 기질에는 추적의 누설을 확인 합니다.
  5. 제자리에서 zymography에 대 한:
    1. 6 µ m 조직 단면도 cryostat를 사용 하 여 절단, 접착 유리 슬라이드에 그들을 수집 하 고 동결 조직 섹션-20 ° c에서 냉동 상자 뚜껑에 실리 카 젤을 포함 하.

8. 현장에서 zymography laminin/CD45 면역 형광 얼룩과 결합

  1. 솔루션을 준비:
    1. 포함 한 솔루션을 준비:
      1. 글리세롤 (분석 등급)의 6 g, 폴 리 (비닐 알코올)의 2.4 g, ddH2O의 6 mL과 0.2 M Tris 버퍼, pH 8의 12 mL를 혼합 하 고 실시간에 4 h에 대 한 솔루션 (자력)를 저 어
      2. 솔루션 50 mL 원심 분리기 튜브에 전송 하 고 실시간에서 2 h 동안 휴식 그 후 50 ° C (물 탕)에 10 분에 대 한 솔루션 및 실 온에서 2700 x g에서 20 분 동안 원심 분리기를 품 어.
      3. 상쾌한 고-20 ° c.에 aliquots에 고정
    2. 차가운 젤라틴 솔루션을 준비:
      1. DdH2O의 10 ml에서 소 피부에서 차가운 젤라틴의 0.1 g을 분해.
      2. 그것은 적어도 1 일 동안 담가 4 ° c.에 aliquots를 저장 하자
    3. 준비 얼음 메탄올 (-20 ° C):
      1. Coplin jar에 100% 메탄올을 넣고-20 ° c.까지 냉각
    4. 10% 나트륨 아 지 드 재고 솔루션을 준비:
      1. DdH2O의 10 mL를 1 g의 나트륨 아 지 드를 추가 하 고 상 온에서 저장.
    5. 0.1% 나트륨 아 지 드 작업 솔루션을 준비:
      1. 10% 나트륨 아 지 드 재고 솔루션의 1 µ L와 믹스 99 µ L의 ddH2O.
    6. 나트륨 아 지 드 솔루션 및 저장소 100 µ L aliquots 4 ° c.에 빛에서 보호 작업의 1 mL에 돼지 피부에서 활용 된 fluorescein 염료 침묵 (DQ) 젤라틴의 1 마그네슘을 분해
    7. 30 mg의 에탄올과-20 ° c.에 게 76 µ L에서 1,10 phenanthroline 토스의 분해
    8. 프로 테아 제 억제 물 솔루션 x 25를 준비:
      1. DdH2O의 2 개 mL를 EDTA 무료 protease 억제제의 1 태블릿을 추가 합니다. -20 ° c.에 게
    9. 그냥 사용 하기 전에, 반응 솔루션 (150 µ L/섹션) 준비:
      1. 1 mg/mL DQ 젤라틴 솔루션 13300 x g에 5 분 동안 원심
      2. DdH2O, 15 µ L 반응 버퍼 (Gelatinase/콜라 분석 결과 키트, 참조 테이블의 재료) x 10의, 20 mg/mL 차가운 젤라틴의 0.3 µ L, 1 mg/mL DQ 젤라틴의 1.5 µ L 및 프로 테아 제 억제 물 솔루션 x 25의 6 µ L의 믹스 127.2 µ L.
    10. 그냥 사용 하기 전에 phenantroline 부정적인 제어 반응 솔루션 (150 µ L/섹션) 준비:
      1. DdH2O, 반응 버퍼, 20 mg/mL 차가운 젤라틴, 1 mg/mL DQ 젤라틴의 1.5 µ L, protease 억제제 EDTA 무료, x 25의 6 µ L의 0.3 µ L x 10의 15 µ L 2 M 1,10-phenantroline (MMP 억제제)의 2 µ L의 믹스 125.2 µ L.
    11. 그냥 사용 하기 전에 차가운 젤라틴 (비 형광) 부정적인 제어 반응 솔루션 (150 µ L/섹션) 준비:
      1. DdH2O, 15 µ L 반응 버퍼 x 10의, 20 mg/mL 차가운 젤라틴의 0.3 µ L EDTA 무료 25 x protease 억제제의 6 µ L의 믹스 128.7 µ L.
    12. 1 차적인 항 체 칵테일 counterstaining, 예를 들어 위한, 0.95 µ g/mL polyclonal 토끼 안티 laminin 항 체와 10 µ g/mL PBS에 1 %BSA polyclonal 쥐 안티 CD45 항 체를 준비 하 고 적절 한 isotype 제어 1 차적인 항 체 칵테일을 준비.
    13. 준비 2 차 항 체 해결책, 예를 들어 7.5 µ g/mL Cy3 염소 반대로 쥐 + 15 µ g/mL PBS에서 1 %BSA AMCA 안티 토끼 (빛에서 보호).
  2. 피하 조직에 물을 보존 하 고 펜을 격퇴 하는 물으로 라인을 그려서 하나의 슬라이드에 2 조직 단면도 분리 하는 증기 두건에서 뚜껑에 실리 카 젤을 포함 하는 플라스틱 냉동 상자 안에 EAE 쥐에서 6 µ m 비 고정 뇌 조직 단면도 녹여
  3. 반응 솔루션 (단계 8.1.9-8.1.11) 준비, 실내 온도, 그리고 사전 따뜻한 물 목욕을 사용 하 여 37 ° c에서 13,400 x g 에 5 분 동안 원심.
  4. 1x 반응 버퍼를 사용 하 여 37 ° C에서 5 분에 대 한 조직 단면도 리하이드레이션 다음, 반응 버퍼 x 1 부 조직 단면도에 반응 솔루션을 추가 하 고 37 ° c.에 4 h에 대 한 품 어 DdH2O에서 슬라이드 5 번을 씻어.
  5. -20 ° C에서 얼음 처럼 차가운 메탄올을 가진 5 분에 대 한 섹션을 수정 하 고 나중 섹션 한 번 실 온에서 PBS 씻어.
  6. 섹션에 PBS에서 1 %BSA 추가 하 고 실 온에서 20 분 동안 품 어 (빛에서 보호). 다음, 조직에 슬라이드를 틀 지 하 여 섹션에서 PBS에서 1 %BSA 삭제, 기본 항 체 칵테일을 추가 하 고 실 온에서 1 h에 대 한 품 어 (빛에서 보호).
  7. 섹션 PBS로 두번 세척, 이차 항 체 칵테일을 추가 하 고 실 온에서 1 h에 대 한 품 어 (빛에서 보호).
  8. 섹션 PBS로 두번 세척, 솔루션에 포함 된 슬라이드를 탑재, 건조 한 실 온에서 밤에 탑재 된 섹션 (빛에서 보호). 마지막으로, 형광 현미경을 사용 하 여 얼룩진된 조직 섹션 분석.

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결과

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C57BL/6 쥐에서 EAE의 임상 과정의 평가 질병 곡선 그림 2A 와 그림 2B에 제시 된으로 마우스 몸 무게 변화에 묘사 된 대로 발생 한다. MOGaa35-55 일반적으로 접종 하는 C57BL/6 마우스 활성 예방 접종 (그림 1A) 후 하루 10-12 주위 질환 증상을 개발 하기 시작 합니다. 일반적으로, 면역된 생쥐 유제의 주입 및 백 일 해 독 소 (그림 1B)의 첫 번째 접종 후 하루 체중의 과도 한 방울을 표시합니다. EAE 유도 후 하루 2에서에서 다음 면역된 생쥐의 몸 무게 점차 증가 질병 시작까지 몸 무게 일반적으로 임상 증상의 개발에 앞서 1 일 삭제 하 고 계속 증가에 연관 감소 하 질병 증상 (그림 1A,B)...

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토론

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여기, 선물이 유도 하 고 여성 C57BL/6 쥐에서 EAE 모니터링 프로토콜. 여성은 우선적으로 선택 하 고, 그리고 여자의 발생률: MS에서 3: 1의 남자. 우리가 만든 EAE의 심각도 평가 하기 위해 3-포인트 점수 시트의 사용. EAE 심각도 모터 장애의 심각도 관하여 일반적으로 득점 된다. 마우스와 고급 EAE의 단계, 즉 2 위 점수를 전시 동물의 불필요 한 고통을 피하기 위해 희생 되어야 한다. 따라서,는 것이 좋습니다 예: 가까운 간격으로 쥐를 득점 하는 프로토콜에 설명 된 대로 두 번 매일.  여러 개의 0-6 포인트 0-3에서 도달 점수 루틴을 고용,16,17,,1819 또는 더 많은 subpoints20포인트. 그러나, 우리는 이전 살 일...

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공개 사항

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관심 없음 충돌 선언.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 기꺼이 우리와 함께 그녀의 원래 제자리에 zymography 프로토콜10 공유는 리 디 아 Sorokin 인정 합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
AMCA 항토끼 항체Jackson ImmunoResearch111-156-045Store at 4 ° C; 빛으로부터 보호
Anti-CD45 항체 (30F11)Pharmingen07-14014 °에 저장; C
안티 라미닌 항체DAKOZ00974 °에 저장; C
사육 식품예: PROVIMI KLIBA SA3336
개별 환기 케이지, 블루 라인 유형 II 또는 III예: Tecniplast 1145T, 1285L
BSA fraction VApplichemA1391에 보관; C
차가운 젤라틴Sigma-AldrichG 9391
Coplin jar + 랙예: Carl Roth GmbH + Co. KGH554.1; H552.1
Cy3 항쥐 항체Jackson ImmunoResearch111-156-144Store at 4 ° C; 빛으로부터 보호
커버 슬립 24 x 40 mm # 1예 : Thermo Scientific85-0186-00
Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW)예 : 분자 프로브D22910-20 °에서 저장; C; 빛으로부터 보호하십시오
Dextran Texas Red (3000 MW)InvitrogenD3328-20 °에 저장; C; 빛으로부터 보호
EnzChek 젤라티나아제/콜라겐분해효소 분석 키트 써모 피셔 사이언티픽; EnzCheckE12055-20 °에서 보관; C; 가벼운
암컷 C57BL/6J 마우스(8-12주)예: Janvier Labs암컷), 8-12
조직학 슬라이드용 냉동 상자예: Carl Roth GmbH + Co. KG2285.1
18G x 1½); ’ ’ (1.2mm x 40mm) 주사 바늘예: BD, BD Microlance 3304622
27G x ¾ ’ ’ – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) 주사 바늘예: BD, BD Microlance 3302200
30G x ½ ’ ’ (0.3 mm x 13 mm) 주사 바늘예: BD, BD Microlance 3304000
Incomplete Freund' s 보조제 (IFA)예 : Santa Cruz Biotechnologysc-24648Store at 4° C
유지 보수 식품예: PROVIMI KLIBA SA3436
MOGaa35-55 펩타이드예: -Store; C
현미경 슬라이드 (Superfrost Plus)Thermo ScientificJ1800AMNZ
Mycobacterium tuberculosis H37RA예: BD231141Store at 4 ° 씨 
NaCl 0.9 %B. 브라운3535789
O.C.T. 화합물 (Tissue-Tek )Sakura4583
Omnican 50 30G x ½ ’ 'B. Braun9151125S
파라포름알데히드Merck30525-89-4
백일해 독소예: List biological laboratories, Inc.1804 °에 저장; C
폴리 (비닐 알코올) (Mowiol 4-88)시그마 -알드리치81381
프로테아제 억제제 EDTA 프리 (로슈)시그마 알드리치46931320014 °에 저장; C
반발 펜, 예: DAKO Pen예: DAKOS2002
밀봉 필름, 예: Parafilm M: Sigma-AldrichP7793
실리카겔예: Carl Roth GmbH + Co. KG9351.1
스티치 가위, F.S.T15012-12
주사기 1ml예: PRIMO62.1002
주사기, 10ml, 예: CODAN Medical ApS2022-05
기화기 시스템 Univentor 400UNO.
4°C에서 보호(주 (80 °의 GenScript , , , 예, , , , , BV

참고문헌

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