Method Article

목공 딱정벌레의 부속물을 위한 주사 및 투과 전자 현미경의 시료 제조 방법

DOI:

10.3791/59251

⸱

February 3rd, 2020

 ,  ,  ,  , 
1The Key Laboratory for Silviculture and Conservation of the Ministry of Education, School of Forestry, Beijing Forestry University, 2School of Forestry, Inner Mongolia Agricultural University, 3Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 4School of Forestry, Fujian Agriculture and Forestry University

In This Article

Summary

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곤충 센실라의 초구조를 관찰하기 위해, 스캐닝 및 투과 전자 현미경(SEM 및 TEM) 시료 준비 프로토콜을 각각 연구에서 발표되었다. Tween 20은 SEM에서 샘플 변형을 피하기 위해 고정식에 첨가되었습니다.

Abstract

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이 보고서는 주사 및 투과 전자 현미경 관찰, 목공 딱정벌레, 클로로 포러스 카라가나 Xie & 왕 (2012)의 부속물을 제조하여 입증 된 샘플 준비 방법을 설명, 전자 현미경의 두 가지 유형. 스캐닝 전자 현미경(SEM) 샘플 전처리 프로토콜은 일련의 에탄올 목욕, 건조 및 스퍼터 코팅에서 샘플 화학적 고정, 탈수에 기초하였다. Tween 20(폴리옥시에틸렌 소르비탄 라우레이트)을 고정액 및 세척 용액에 첨가함으로써, 목공 딱정벌레의 곤충 체표면을 SEM에서 보다 깨끗하게 세척하였다. 이 연구의 전송 전자 현미경 검사법 (TEM) 견본 준비는 고착, 에탄올 탈수, 수지에 있는 포함, 형광 현미경 검사법을 사용하여 위치, 단면도 및 염색을 포함하여 일련의 단계를 관련시켰습니다. Tween 20을 이용한 고정제는 트웬(20)이 없었을 때보다 더 쉽게 목공 딱정벌레의 곤충 몸벽을 관통하고, 이어서 체내에 더 나은 고정 조직과 장기를 침투시켜 곤충 센실라 울트라구조의 명확한 투과 전자 현미경 관측을 산출하였다. 이 제제의 다음 단계는 형광 현미경을 사용하여 수지 블록에 내장된 샘플에서 곤충 센실라의 위치를 결정하여 표적 센실라 포지셔닝의 정밀도를 높이는 것이었다. 이렇게 하면 슬라이스 정확도가 향상되었습니다.

Introduction

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주사 전자 현미경 검사법은 SEM이 표면 구조를 보여줍니다 많은 형태학 연구에서 중요한 도구입니다1,2. 전송 전자 현미경 검사법의 매력은 세포의 구조와 세포기관의 초구조에서, 거대 분자 복합체 및 단백질의 구조에, 나노 미터 규모에 있는 생물학 구조물의 넓은 범위를 공부하는 것을 이용될 수 있다는 것입니다. TEM은 내부 구조를 보여줍니다3,4,5.

콜레옵테라는 약 182가구와 350,000여 종의 곤충을 포함한 가장 큰 곤충 군이다. 콜레옵테란 곤충의 대부분, 특히 목공 딱정벌레는 식물을 먹고, 그 중 많은 식물은 숲과 과일 나무의 중요한 해충이며, 나무에 치명적인 손상을초래6. 현재, 화학생태이론에 근거한 해충의 예방 및 방제 인구는7. 효율적이고 독성이 낮고 무공해 페로몬 제어 방법이 효과적인방법이되었습니다 8. 곤충의 센실라 형태와 초구조....

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Protocol

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주의: 시약의 재료 안전 데이터 시트를 사용하기 전에 참조하십시오. 샘플 준비 중에 사용되는 여러 화학 물질은 독성, 돌연변이, 발암 성 및 / 또는 재현독성입니다. 개인 보호 장비(장갑, 실험실 코트, 전신 바지 및 닫힌 발가락 신발)를 사용하고 샘플을 처리하는 동안 연기 후드 아래에서 작업하십시오.

1. SEM 견본 준비 및 화상 진찰

  1. 샘플 고정 및 세척
    1. C. 카라가나 발생 지역에서 작업, 이소포론16등의 식물 매력으로 미끼 필드 트랩에 성인을 유치. 0.1 molL-1 인산 완충 식염수(PBS, pH 7.2), 글루타랄데히드(Anhydrous EM Grad) 및 0.06%(vol/vol) 트웬트 20에 성인 C. 카라가나의 깨끗한 몸을 보존합니다. 주말에 4 °C에서 샘플을 고정합니다.
    2. 보존 액에서 시체를 제거하고 인산염 완충액으로 헹시다. 입체 현미경을 사용하여 부속물을 제거하고 0.1 mol L-1 인산완식염수(pH 7.2)에서 0.06%(vol/vol) 트웬 20(PBST)로 초음파(40kHz)로 세척합니다. 100초 동안 세척한 후 샘플을 현미경으로 옮겨 깨끗한지 확....

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Results

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Tween 20을 사용한 세척 및 고정 용액을 사용하여, 더 깨끗한 SEM 이미지는 트웬 20(그림3)이없는 것보다 더 깨끗한 SEM 영상을 관찰하였다. 트웬 20 고정용액은 글루타랄데히드 고정액을 조직 내로 침투하였다. 미세소관 구조가 명확하게 보였다. 샘플의 내부 구조의 TEM 이미지는 Tween 20(도4)없이흐려졌다.

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그림 3: SEM 하에서 클로로포러스 카라가나 안테나상에 위치하는 센실라. SEM 이미지를 Tween20(A)과

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Discussion

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이 기사에서는 목공 딱정벌레에 대한 주사 및 투과 전자 현미경 검사법을 위한 샘플 준비 계획을 발표했습니다. 곤충 부속을 대표적인 연구 대상자로 사용하여 기존의 시료 전처리 방법에 비해 몇 가지 개선된 방법을 입증했습니다.

고체 표면에서 분리된 액체 오일은 작은 액적으로 유화되어, 이는 물체의 표면에 재증착을 감소시키기 위해 세척 매체에 잘 분산되고 부유될 수 있다. 계면활성제의 세척 성능은 습윤성, 투과성, 유화 특성, 분산성, 용해성11,12,13,14와같은 모든 기본 특성을 포함한다. 골든 네마토드의 전자 현미경 시료 제제에 대한 상이한 세제의 효과는 트웬(20)이 가장 좋은 세정 효과를 보였으며, 그 다음으로 중탄산나트륨,

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Disclosures

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우리는 공개할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

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우리는 베이징 전문 대학, 원자력 응용 연구소 (중국 농업 과학 아카데미), 베이징 임업 대학의 바이오 연구 센터 및 산간 교수의 관대 한 지원에 감사드립니다. 동물학 연구소의 장, 중국 과학 아카데미. 이 연구는 중국의 국가 핵심 R&D 프로그램(2017YFD0600103), 중국 국립자연과학재단(보조금 제31570643, 81774015), 중국 공공복지 산림과학연구(201504304), 내몽골의 지원을 받았습니다. 농업대학 고위인재연구창업계획(203206038) 및 내몽골 자치구 고등교육연구사업(NJZZ18047), 내몽골 자치구 린수 "더블 퍼스트 클래스" 건설사업(170001)

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
해부학 적 렌즈충칭 자동차 광학 < BR / > 유한 책임 회사1425277
탄소 접착 테이프SPI 공급, 구조 프로브, Inc.의 부서7311
사염화탄소시그마56-23-5
구리 그리드GilderGridsG300
인산수소이나트륨Sinopharm 그룹 화학 시약 co., LTD10039-32-4
에탄올J.T. 베이커64-17-5
플랫 임베딩 몰드Hyde Venture (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.70900
형광 현미경LEICADM2500
글루타르알데히드시그마-알드리치111-30-8무수 EM 등급
이소포론시그마78-59-1
리드 시트레이트시그마512-26-5
메탄올시그마67-56-1
일염기성 인산나트륨 group chemical reagent co., LTD7558-80-7
객관적인 마이크로미터Olympus0-001-034
오스뮴 테트록사이드시그마541-09-3
페트리 접시Aldrich1998
면도날질레트
수지SpurrERL4221
메스LianhuiGB/ T19001-2008
SEM히타치S-3400
실리카겔 건조제쑤저우 Longhui 건조제 Co., Ltd.112926-00-8
소형 브러시MartolG1220
수산화나트륨시그마1310-73-2
스퍼터 이온 기기Hitachi Koki Co. Ltd., Tokyo, JapanE-1010
실체 현미경LeicaEZ4 HD
TEMHitachiH-7500
트윈 20Tianjin Damao 화학 시약9005-64-5
초박 절편기LeicaUC6
초음파 세척기GT SonicGT-X1
우라닐 아세테이시그마6159-44-0
트

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Song, Y. Q., Dong, J. F., Sun, H. Z. Scanning Electron Microscope Technology of Insect Material. Hubei Agricultural Sciences. 52, 1064-1065 (2013).
  2. Liu, C. The develo....

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