이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

Fucosylated 인간 우유 Trisaccharides 유전자를 사용 하 여 바이오 컨텍스트에서 분석 인코딩된 바이오 센서

5.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/59253

⸱

2019년 4월 13일

 , 
1Department of Chemical and Biological Engineering, Iowa State University

이 논문에서

요약

우리 여기 높은 처리량 탐지 및 정량화 fucosylated 인간의 우유 oligosaccharides (Hmo)의 전체 셀 바이오 센서를 사용 하 여 설명 합니다. 또한 설명 여기, HMO 생산 종자의 분석으로이 플랫폼의 적응 신호 대 노이즈 비를 향상에 초점을 맞추고 합니다.

초록

인간의 우유 oligosaccharides (Hmo)는 복잡 한 탄수화물의 구성 요소 인간의 모유는 유아 건강에 많은 혜택. 그러나, 그들의 바이오 합성의 최적화는 탐지의 상대적으로 낮은 처리량 및 단 당 류와 연계의 정량화에 의해 제한 됩니다. Glycan 분석의 전통적인 기술을 자동화 없이 하루 샘플 수백 순서 처리량 크로마/질량-spectrometric 메서드가 포함 됩니다. 여기, 높은 처리량, 연계 관련 검색 및 fucosylated HMO 구조, 2'-fucosyllactose와 3-fucosyllactose, 우리는 분리를 통해 달성의 정량화에 대 한 유전자 인코딩된 세균성 바이오 센서 설명 fucosidases의 표현입니다. 으로 유 당 우유 또는 바이오 프로세스의 존재는 가양성으로 이어질 수 있는, 우리 또한 다른 전략을 사용 하 여 유 당에서 신호 감소를 보여줍니다. 이 기술은 높은 처리량으로 인해 많은 반응 조건 또는 생물 매개 변수 HMO 제조의 최적화에 대 한 허용 하는 시간의 문제에 동시에 분석 될 수 있습니다.

서론

인간의 우유 oligosaccharides (Hmo) 유 당 파생 oligosaccharides, 일반적으로 3 ~ 8 설탕 단위체로 구성 된 있습니다. 그들은 끝 (Gal β1, 4-Glc) 유 당 감소 그리고 더 glycosidic 링크에 의해 길쭉한 (β-1, 3-또는 β-1, 6-) 포도 당 (Glc), 갈 락 토스 (Gal), 또는 N-acetylglucosamine (GlcNAc). 또한, fucose (Fuc, α-1, 2-또는 α-1, 3-) 또는 sialic acid (Sia 또는 NeuAc, α-2, 3-또는 α-2, 6-) 잔류물은 종종1추가.

Oligosaccharides과 다른 탄수화물의 현재 분석 크로마/질량 spectrometric (MS) 기술2,3,,45, 에 대 한 필요에 의해 처리량 그리고 범위에 제한 됩니다. 6 , 7, 대략 걸릴 수 있는이 장비8의 가동에 고가의 장비, 특수 열과 derivatizing 에이전트 및 전문성에 대 한 필요성을 언급 하지 않기 위하여 샘플 당 한 시간. 올리고 당 연계는 특히 어려운 결정, 고급 MS9,10 또는 핵 자기 공명 (NMR) 기법11. 이러한 oligosaccharides의 합성의 빠른 최적화 따라서이 느린 분석 단계의 처리량에 의해 제한 됩니다.

이 연구에서 설명 하는 fucosylated trisaccharide의 연계 관련 검색 유 기반 Hmo, 2'-fucosyllactose (2'-플로리다) 인간의 우유에 있는 가장 풍부한 HMO에 초점을 맞추고, 유전자 암호화를 사용 하 여 대장균 전체 셀 4 mg/l.에서 검출 한도 바이오 센서 이 바이오 센서의 중요 한 기능은 이성질체 trisaccharides 사이 구별 하는 기능입니다. 디자인 원리는 존재에 형광 신호를 생성 하는 락 오 페론에 의해 검출 된다 Hmo에서 유 당을 해방 하는 대장균 의 특정 fucosidases의 식을 기반으로 합니다. 우리는 링크 전용 fucosidase와 다른 형광 기자 단백질을 품고 하나 2-플라스 미드 시스템을 구축 하 여 이것을 달성. 이 바이오 센서 플랫폼은 높은 처리량 검열 cytometry 또는 마이크로 플레이트 리더에 적합 합니다. 우리는 또한 2'-플로리다 설계 변형12제작한 측정에 바이오 센서의 활용을 보여 줍니다. 이 연구에서 또한 선물이 세 가지 전략, 바이오 센서에서 거짓 긍정적인 신호에서 발생할 수 있는 유 당의 선택적 제거에 조작된 프로듀서 스트레인 성장 유 당에는.

함께 찍은, 유전자 인코딩된 바이오 센서 수 감지 하 고도 어려운 연계 특정 방식으로 Hmo를 계량 컬럼에, MS, 또는 NMR 기법. 높은 처리량 및 사용의 용이성,이 메서드는 대사 공학 및 Hmo의 합성에 광범위 하 게 응용 프로그램 있어야 합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

1. 세포 문화와 유도 조건

참고: 다음 실험에 세는 사용: 대장균 BL21 (DE3)와 빈 벡터, 대장균 BL21 (DE3) 플라스 미드 pAfcA14 와 pET28:green 형광 단백질 (GFP)와 대장균 BL21 (DE3) 플라스 미드와 pAfcB14 그리고 pET28:GFP입니다. 모든 종자는 Luria Bertani 국물 (파운드) 또는 적절 한 항생제로 최소한의 미디어에서 재배 됩니다. 물 이온 (디) 1000 x 대 (50 mg/mL) 및 carbenicillin (100mg/mL)의 재고 솔루션을 준비 합니다.

  1. 미디어 준비
    1. 디 물 1 l 파운드 분말 주식의 25 g을 추가 하 여 파운드 미디어를 준비 합니다. 오토 클레이 브 소독을 20 분 동안 121 ° C에서 솔루션. 멸 균된 파운드 미디어 온도 60 ° c 파운드 미디어의 모든 1 mL에 대 한 항생제의 1 µ L의 추가 하기 전에 때까지 기다립니다.
    2. 파운드 플레이트를 준비 하려면 15 g 천 살 균 전에 파운드 미디어를 추가 합니다. 멸 균된 파운드 agar 온도 60 ° c 항생제의 추가 하기 전에 때까지 기다립니다.
    3. 1.1.3 바이오 센 싱 셀에 대 한 미디어 또는 듀얼 항생제, 대와 carbenicillin 접시를 준비 합니다.
  2. 탄수화물 inducers
    1. 20 g/L의 유 당을 어 금 니 동등 물에서 탄수화물 inducers의 재고 솔루션을 준비: 2'-플로리다와 3 층의 29 g/L
      참고: 셀의 각 200 µ L 2'-층 또는 3 층의 20 µ L 필요 합니다.
    2. 유 당 또는 2.9 g/L 2'-플로리다/3-층 품 연속 떨고와 37 ° C에서의 최종 농도의 2.0 g/L 최종 농도와 셀의 200 µ L를 유도 하 고 밤새 껏 성장 하는 문화.
  3. 세포 배양
    1. 실험 전에 하루 씨 대와 무 균 기술을 사용 하 여 신선한 세균성 식민지에서 carbenicillin 보충 파운드 매체의 5 mL.
    2. 동요와 함께 37 ° C에서 모든 문화를 품 어 하룻밤 문화를 성장 하 고.
    3. 신선한 파운드/M9 미디어 대와 carbenicillin의 5 mL로 50 µ L의 숙박 문화를 전송 합니다. 문화에는 600에서 광학 밀도 도달 했습니다 때까지 지속적인 동요를 37 ° C에서 품 어 성장과 0.5-0.7 nm (OD600). 이 중간 로그 단계에서 세포 유도 될 수 있다.

2. 측정 형광의 탐지의 한계

  1. Cytometry 셀의 준비
    1. 1.5 mL 튜브를 1 분 동안 12500 x g 에서 원심 분리기 숙박 문화를 전송 합니다.
    2. 상쾌한 삭제 하 고 다시 단일 세포 현 탁 액을 준비 하 여 단일 셀을 전송 1 x 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, 6 m m 나2HPO4, 1.8 m m NaH2포4, 145 m NaCl 디 물, pH 7.2 m)의 500 µ L에 펠 릿을 일시 중지 현 탁 액 5 mL 흐름 cytometry 관에.
    3. 교류 cytometer에서 샘플을 실행까지 4 ° C에서 어둠 속에서 셀 유지. 최상의 결과 얻으려면 가능한 한 빨리 셀을 분석 합니다.
    4. GFP 자극 488 nm 레이저를 선택 합니다. 525/50 nm 대역 통과 필터 fluorescein isothiocyanate (FITC) 형광 레벨 (20000-40000 이벤트, 문이 집계 셀과 파편을 피하기 위해 앞으로 옆 분산에 대 한)를 수집 합니다.
  2. 바이오 센서 보정
    1. 보정 곡선을 범위 0-2500 mg에는 표준 2'-플로리다의 8-10 희석을 확인/l.
    2. 2'-플로리다 바이오 센 싱 셀 (pAfcA 및 pET28:GFP를 포함 하는) 문화 하 고 이전 섹션에서에서 설명한 대로 1.3 표준 희석으로 유도. 각 희석에 대 한 3 개의 생물 복제를 실시 합니다.

3. 탐지 및 정량화의 2'-프로듀서 스트레인에서

  1. 프로듀서 긴장의 경작
    1. 최소한의 미디어를 만들기 위한 준비 1 M K2HPO4, FeSO4·7H2O, 나트륨 구 연산 염, 티 아민 1 M의 별도 솔루션-HCl. 소독 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 솔루션. 디 물 1 L 국물 분말 M9 미디어 믹스. 압력솥 15 분을 위한 121 ° C에서 M9 솔루션 쿨 50 ° c.까지 솔루션 추가 MgSO4, CaCl2, K2HPO4, FeSO4·7H2O, 나트륨 구 연산 염, 티 아민 2 m m, 0.1 m m, 12 g/L, 11 mg/L, 75 mg/L의 최종 농도 7.5 µ g/L, 각각.
    2. 2'-플로리다 스트레인, 예를 들어, JM109 gwBC-F2, 파운드 미디어의 5 ml에서을 생산 하 고 성장 하룻밤에 37 ° C, 바 움 가트너 외.12에 설명 된 대로 그것의 문화를 시작 합니다.
    3. 하위 1% 단계 1.3.3에서 250 mL 단계 3.1.1에서에서 준비 하는 최소한의 미디어의 앞부분에서 설명한 대로. 최종 농도 10 g/L의 글리세롤을 추가 하 고 37 ° c.에 문화를 품 어
    4. 문화에서 0.5-0.7의 OD600 에 도달 하면 0.5 m m와 유 당 2 g/l.의 최종 농도에 최종 농도에 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 추가
    5. 연속 떨고와 37 ° C에서 품 어 고 24 h에 대 한 성장 하는 문화.
  2. 2'-플로리다의 추출
    1. 살 균 50 mL 튜브와 15 분 동안 900 x g 에서 원심 분리기를 숙박 문화를 전송 합니다.
    2. 3.2.2 상쾌한 삭제 하 고 다시 디 물에 펠 릿을 일시 중단. 잔여 유 당을 제거 하 고 마지막으로 다시 디 물 5 mL에 일시 중지를 세척 단계 세 번을 반복 합니다.
    3. Lyse 세포 현 탁 액, 한 sonicator 30 s 펄스에서 30% 전력에서 사용 합니다. 모든 시간에 얼음에 셀을 계속.
    4. 2000 x g에 25 분 lysed 세포 원심 제거는 상쾌한, 한 살 균을 통해 전달 (예: 0.22 μ m) 필터링 및 분석까지 4 ° C에서 그것을 저장.
  3. 바이오 센서와 정량화
    1. 2'-플로리다 바이오 센 싱 셀 및 중간 로그 단계에서 문화를 접종, 2'-플로리다 섹션 2.2에에서 설명 된 대로 보정 곡선을 만드는 데 사용의 예상된 농도에 세포 lysate 동일 유도. 분석할 샘플으로 동일한 환경에서 보정을 수행 (예: 세포 lysate) 2'-플로리다의 희석 컨트롤에 추가 하 여 (즉, 비-프로듀서) 필터링 된 셀 바이오 센서 세포를 유도 하기 전에 lysate.
    2. 교류 cytometer에서 샘플을 실행 합니다. 올리고 당 농도 대 한 형광 출력을 그려서 복용량 응답 곡선을 생성 합니다. 세포 lysate를 기준의 응답을 비교 합니다.

4. 선택적 유 당 제거

참고: 바이오 센 싱 세포는 유 당에 과민 한 그리고 그것은 선택적으로 Hmo 유 당 감지를 바이오 센서에 대 한 바람직한. 한 전략 섹션 3.2에에서 설명 된 대로 셀의 세척을 포함할 것입니다. 3 개의 다른 전략은 아래 설명 되어 있습니다.

  1. 상업적인 정화 β-galactosidase 치료
    1. 동결 건조 된 β-galactosidase 1000 (FCC lactase) 단위/mL, 1 mm MgCl2 를 분해 하거나 솔루션에서 상업 β-galactosidase를 사용 합니다.
    2. 필요한 효소의 최적 농도 확인 하려면 2'-플로리다 바이오 센 싱 셀 inoculum 성장과 유 당 2 g/L 및 2.9 g/L 2' 유도-중간 로그 단계에서 플로리다.
    3. 100 µ L 문화, β-galactosidase, 최대 12 단위, 양의 추가 하 고 지속적인 동요를 37 ° C에서 하룻밤 성장 문화를 보자.
    4. 섹션 2.1에에서 설명 된 대로 형광을 측정 하 고 최소 효소 농도 결정 하 여 원하는 신호 감쇄를 달성 하는 데 필요한 효소의 최적 단위 계산.
    5. 2'-플로리다 생산 셀 24 h에 대 한 성장, β-galactosidase의 최적의 단위를 추가 하 고 37 ° c.에서 밤새 품 어 3.3 섹션에 설명 된 대로 2'-플로리다 titer를 결정 하기 위한 프로토콜 진행.
  2. LacZ + 스트레인와 전처리
    1. 25 mL 문화 2'-플로리다 생산 긴장의 고 일단 중간 로그 단계에서 유도 시작, 24 h에 대 한 37 ° C에서 문화를 품 어.
    2. 접종 한 대장균 BL21 (DE3), 파운드에서 37 ° C에서 중간 로그 단계로 성장 문화와 24 h 문화를 문화 (2:1) 50 mL를 추가.
    3. 3.3 섹션에 설명 된 대로 2'-플로리다 titer를 결정 하기 위한 프로토콜 3 h. 진행에 대 한 37 ° C에서 품 어.
  3. 유 강 수 에탄올
    참고:이 섹션은 타 외.12에서 적응.
    1. 25 mL 문화 2'-플로리다 생산 긴장의 고 일단 중간 로그 단계에서 유도 시작, 24 h에 대 한 37 ° C에서 품 어.
    2. 문화, 100% 에탄올의 두 개의 볼륨, 동요 4 h 37 ° C에서 품 어 추가 합니다.
    3. 원심 900 x g 15 분 수집에서 정지는 상쾌한 고는 유 당을 침전 하는 4 ° C에서 밤새 품 어.
    4. 필터 종이 (11 µ m)를 통해 솔루션을 전달 하 여 침전 된 유 당을 제거 합니다. 세포 lysate 2'-플로리다, 다음 섹션 3.3으로 양이 정해질 수 있는 포함 하는 filtrate를 수집 합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

우리는 전체 셀 바이오 센서를 2'-플로리다는 올리고 당의 biotechnological 생산와 함께에서 사용할 수 있는 특정 설계 되었습니다. 이 유 당을 생성 하는 터미널 설탕 수정 특정 효소 분열에 의존 함으로써 선도 유 당 유도할 수 있는 발기인에서 기자 형광 단백질의 표현에 걸리면 lac 오 페론의 활성화는 2'-플로리다의 수량 그것의 결합 특이성, 3-fucosyllactose (3 층), 한 이성질체를 보여 주기 위해 테스트도 했다. 두 부분을 포함 하는 유전자 회로: fucosidase 유전자, afcA 또는 afcB제정 식 결과 제정 발기인에 의해 구동 인코딩된 pelB의 신호 순서 벡터에 복제 하는 fucosidase 유전자의 상류 GFP의 식 운전 T7 발기인을 포함 하는 형광 기자 시스템 뿐만 아니라 periplasmic 수출을 촉진 한다. 첫 번째 부분은 플라스 미드 pAfcA 및 플라스 미드 pET...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

우리는 인간 우유 oligosaccharides fucosylated의 연계 관련 검색에 대 한 높은 처리 전략 제시. 이 특정 glycans와 유도 따라 형광 신호 응답 대장균 유전자 공학에 의해 전체 셀 바이오 센서를 구축 하 여 달성 되었다. 프로토콜 또한 감지 metabolically 조작된 세균성 긴장에 Hmo를 계량 하는 바이오 센서를 사용 하는 방법에 자세히 설명 합니다.

우리의 프로토콜 크로마/MS 방법에 비해 그 결합 특이성에 뿐만 아니라 그것의 높은 처리량으로 인해 다른 방법 이상의 장점을 제공 합니다. 감지 및 광범위 한 다이나믹 레인지의 낮은 한계 Hmo의 직접 측정 할 수 있습니다.

이 프로토콜의 중요 한 단계 세포 lysate 프로듀서 종자의 준비에서 발생합니다. 2'-플로리다의 최대 titer를 보장 하기 위한 최적의 조건을 제공 하 결정적 이다. 일괄 처리에서 variabilities ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

이 작품은 아이오와 주립 대학 시작 기금에 의해 지원 되었다. F.E.는 NSF Trinect 친교와 맨리 Hoppe 교수에 의해 부분적으로 투자 되었다. T.J.M. 카 렌과 데 니 본 학부 친목에 의해 부분적으로 지원 되었다. 저자 형광와 LC MS 연구 아이오와 주립 대학 Flow Cytometry 시설 및 W.M. 켁 대사체학 연구 실험실 지원에 대 한 감사합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2'-푸코실락토스 카르보신스 41263-94-9
3-푸코실락토스 카르보신스 41312-47-4
AgarFisher ScientificBP9744500
칼슘 클로라이드, 이수화물Fisher ScientificC79-500
카르베니실린 Fisher ScientificBP26481
포도당(D-포도당), 무수Fisher ScientificD16-1
유세포 분석기BDFACSCanto Plus RUO
HPLCAgilent Technologies1100 시리즈 HPLC 시스템
HPLC 컬럼LunaC18 역상 컬럼
KanamycinFisher Scientific
LB 육수, 밀러 Fisher Scientific12-795-027
유당Fisher Scientific64044-51-5
M9, 최소 염, 5xSigma-AldrichM6030
황산 마그네슘, 무수Fisher ScientificM65-500
MSAgilent TechnologiesMass Selective Trap SL 검출기
염화나트륨Sigma-Aldrich7647-14-5
인산나트륨 이염기성시그마-알드리치7558-79-4
인산나트륨 일염기성시그마-알드리치13472-35-0
11815024

참고문헌

  1. Ninonuevo, M. R., et al. A strategy for annotating the human milk glycome. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (20), 7471-7480 (2006).
  2. Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: a review of recent developments. Analytical Chemistry. 86 (1), 196-212 (2014).
  3. Royle, L. Chapter 8 - Glycans and Monosaccharides. Liquid Chromatography. , 185-202 (2013).
  4. Shubhakar, A., Reiding, K. R., Gardner, R. A., Spencer, D. I. R., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. High-Throughput Analysis and Automation for Glycomics Studies. Chromatographia. 78 (5-6), 321-333 (2015).
  5. Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases. Analytical Biochemistry. 300 (1), 53-68 (2002).
  6. Evangelista, R. A., Liu, M. -S., Chen, F. -T. A. Characterization of 9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate Derivatized Sugars by Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection. Analytical Chemistry. 67 (13), 2239-2245 (1995).
  7. Jiao, J., Zhang, H., Reinhold, V. N. High Performance IT-MS Sequencing of Glycans (Spatial Resolution of Ovalbumin Isomers). International Journal of Mass Spectrometry. 303 (2-3), 109-117 (2011).
  8. Doherty, M., et al. An automated robotic platform for rapid profiling oligosaccharide analysis of monoclonal antibodies directly from cell culture. Analytical Biochemistry. 442 (1), 10-18 (2013).
  9. Hsu, H. C., Liew, C. Y., Huang, S. -P., Tsai, S. -T., Ni, C. -K. Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides. Scientific Reports. 8 (1), 5562(2018).
  10. Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (1), 231-250 (2019).
  11. Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy. Archives of Biochemistry and Biophysics. 434 (1), 116-127 (2005).
  12. Baumgärtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2’-fucosyllactose. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-13 (2013).
  13. Matsuki, T., et al. A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development. Nature Communications. 7, 11939(2016).
  14. Enam, F., Mansell, T. J. Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli. Cell Chemical Biology. 25 (10), 1292-1303 (2018).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

더 많은 논문 탐색

푸코실화 HMO바이오센서 검출유세포 분석고속 대량 스크리닝유당 간섭베타 갈락토시다아제유전공학E.Coli 발현올리고당 정량 분석결합 특이성
Fucosylated 인간 우유 Trisaccharides 유전자를 사용 하 여 바이오 컨텍스트에서 분석 인코딩된 바이오 센서
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.