경작 된 인간 세포 블루 네이티브 Polyacrylamide 젤 전기 이동 법 및 Immunoblotting 사용 하 여에서 미토 콘 드리 아 호흡 사슬 단지의 분석

미토 콘 드리 아 에너지 생산, 세포 물질 대사, 신호, apoptosis, 노화, 등^1,2,3의 규칙에에서 중요 한 역할을 재생 하는 다기능 세포입니다. 미토 콘 드리 아에서 에너지 생산 호흡 ATP 합성 커플 산화 인 산화 기능에 의존 합니다. 인간 세포에 있는 미토 콘 드 리아 산화 인 산화 시스템 (OXPHOS) 5 단지의 구성 됩니다. 단지 I-IV 복잡 한 V ATP를 생산 하는 데 사용 되는 미토 콘 드 리아 intermembrane 공간에서 전기 양성자 기온 변화도를 만듭니다. 복잡 한 각 OXPHOS multimeric 이며, 복잡 한 II, 제외 하 고 핵과 미토 콘 드리 아 유전자에 의해 subunits의 구성. 어떤 결함 돌연변이 또는 환경 스트레스에 기인 하는 OXPHOS 복합물의 핵심 구성 요소에는 어셈블리 및 산화 인 산화 시스템의 기능 교란 수 있습니다. 또한, 기능 OXPHOS 복합물의 적절 한 어셈블리는 어셈블리 요소^4,,56의 많은 필요합니다.

블루 기본 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (BN-페이지) 그대로 단백질 복합물의 분석을 사용 하는 기본적인 기술 이며 OXPHOS 복합물의 어셈블리를 공부 하는 데 사용할 수 있습니다. 첫째, 미토 콘 드리 아는 격리 된 세포에서 digitonin에 의해 세포의 원형질 막 permeabilizes 온화한 세제. 그런 다음, 라우릴 maltoside를 사용 하 여 OXPHOS 단지 미토 콘 드리 아 막에서 해제 됩니다. 그라데이션 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 OXPHOS 단지 그들의 질량에 따라 분리 된다. Coomassie 파란 G-250 (하지 R-250) 샘플 버퍼와 블루 음극 버퍼에 추가 세제 정한 연결을 분리 하지만 개별 호흡 사슬의 단지 그대로⁸을 유지. 전기 이동 법, 동안 블루 음극 버퍼 염료를 포함 하는 염료, PVDF 막⁸OXPHOS 단지의 효율적인 전송을 보장 없이 음극 버퍼도 대체 됩니다. OXPHOS 단지 시각화, PVDF 막 5 OXPHOS 단지의 선택 된 하위 단위에 해당 하는 항 체와 incubated 순차적으로.

여기에 설명 된 몇 가지 수정 하는 방법은 어떤 교양된 셀에 적용할 수 있습니다. 또한, 조직 샘플⁹에서 고립 된 미토 콘 드리 아에서 OXPHOS 복합물의 분석을 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다. BN-페이지 실행 당 각 샘플에 대 한 미토 콘 드리 아의 적어도 5-10 µ g을 필요합니다. 여기 설명 하는 방법을 사용 하 여, 500000 교양 HEK293, SH-SY5Y와 같은 셀 또는 143B 세포는 미토 콘 드리 아의 약 10 µ g을 얻을 수 있습니다. 그러나, 충분 한 양의 비 엔 분석에 대 한 셀 특정 셀 형식에 따라 달라 집니다.

미토 콘 드리 아 OXPHOS 단백질을 공부 하는 가장 일반적인 방법은 SDS 페이지 이며 서 부 럽. 그러나, SDS 페이지만 개별 OXPHOS 소 단위를 공부 하 고 있으며, BN-페이지, 달리 평가 전체 OXPHOS 복합물의 어셈블리를 사용할 수 없습니다. 분명 기본 페이지 분리 부정 청구 염료의 존재 없이 기본 조건에서 단백질 복합물 그리고 억 페이지에 비해 훨씬 낮은 해상도. 그러나, 분명 기본 페이지 이므로 10 억 페이지 보다 온화한 조건¹⁰억 페이지 아래 해리 OXPHOS supercomplexes 같은 단백질 복합물의 정한 supramolecular 어셈블리를 유지할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 그라데이션 젤 복합물; 분리 하는 그러나, 또는, 비 그라데이션 분리 사용할 수 있습니다 경우 상대적으로 비싼 그라데이션 메이커 사용할 수¹¹.

중요 여기에 설명 된 메서드는 단지의 기능 평가 하지 OXPHOS 복합물의 어셈블리를 분석할 수 있습니다. 고해상도 BN 페이지 젤에 활동 분석 결과¹¹ 미토 콘 드 리아 단지¹² 의 spectrophotometric 효소 활동 분석 결과 의해 다음 OXPHOS 단지의 기능 분석에 대 한 효율적인 기술이 있습니다. 그러나, 이러한 두 가지이 방법 OXPHOS 복합물의 어셈블리를 시험 하지 않습니다.

따라서, BN 페이지 개별 OXPHOS 복합물의 어셈블리를 조사 하는 최적의 방법입니다. 예를 들어 Leber 유전 눈 신경 병 (LHON), 유산 증 및 뇌졸중 같은 에피소드 (MELAS), 미토 콘 드리 아 뇌 등 일부 미토 콘 드 리아 장애, 하나 이상의 구성 요소는 OXPHOS의 변경 된 어셈블리와 관련 된 시스템⁵. 를 사용 하 여 설명 하는 BN 페이지 방법을 여기 미토 콘 드 리아 질병의 분자 메커니즘을 공부 될 수 있다.

spaNOTE:이 프로토콜은 기반 관련된 간행물 Hilander 외.¹³ .

1입니다. 버퍼 솔루션의 준비

참고: 모든 버퍼 및 프로토콜에 사용 되는 솔루션 표 1에 요약 됩니다. 버퍼의 지정 된 볼륨 준비 하 고 10 샘플을 실행 하기에 충분 한 있습니다. 모든 버퍼 + 4 ° C에서 최대 1 년 동안 저장할 수 있습니다.

1. 젤 버퍼 1.5 M aminocaproic 산, 150mm 두번째-트리 증류수 (dH₂O)에 포함 된 x 3의 20 mL를 준비 합니다. 7.0에 pH를 조정 합니다.
2. DH₂오 2 M aminocaproic 산의 10 mL를 준비
3. 다음 결합 하 여 미토 콘 드 리아 버퍼의 1 mL를 준비: 0.5 mL 젤 버퍼, 2 M aminocaproic 산의 0.5 mL 및 500 mM EDTA의 4 µ L x 3의.
4. 두번째-트리 스와 50 m m tricine dH₂O. 조절 pH 7.0의 15 m m를 포함 하는 음극 버퍼의 1000 mL를 준비 합니다.
   1. 0.04 g Coomassie 파란 G-250의 음극 버퍼의 200 mL를 추가 하 여 파란색 음극 버퍼의 200ml를 준비 합니다.
5. 50mm 두번째-트리 스 dH₂O. 조절 pH 7.0에 포함 된 양극 버퍼의 1000 mL를 준비 합니다.
6. 750 mM aminocaproic 산 및 5 %Coomassie 파란 포함 하는 샘플 버퍼의 2.5 mL 준비 dH₂O. G-250

2입니다. 미토 콘 드리 아 lysates의 준비

1. 플레이트 셀 컬렉션 전날. HEK293 또는 143B 셀 사용 Dulbecco의 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1 %L-글루타민, 100 mg/mL 페니실린 및 100 mg/mL 스가 글의 중간 (DMEM) 수정. +37 ° c 5% CO₂ 습도 분위기에서 셀 문화 인큐베이터에서 세포 성장. 컬렉션의 날에 각 샘플에 대 한 적어도 500000 셀 인지 확인 합니다.
2. 부드럽게 한번 얼음 처럼 차가운 PBS로 세포 세척. 접시에서 세포를 분리 하지 마십시오. 세포를 긁어와 800 x g + 4 ° c.에서 10 분 동안에 작은
3. 얼음 처럼 차가운 PBS로 두 번 셀 펠 릿을 세척 하 고 단계 2.2에서 원심. 브래드 퍼 드 방법 상업 키트를 사용 하 여 단백질 농도 측정 합니다. 800 x g + 4 ° c.에서 10 분 동안에 세포를 작은
   참고: 셀 컬렉션 후 + 4 ° C에서 모든 단계를 수행 하 고 소용돌이 하지 마십시오.
4. PBS의 20 mL를 100 x protease 억제제의 200 µ L을 추가 하 여 20 mL PBS의 protease 억제제와 함께 준비 합니다. 얼음에 계속. 5 mg/mL의 최종 단백질 농도에 protease 억제제와 함께 PBS에 셀 resuspend
   1. 5 mg/mL에서 세포를 resuspend 하는 데 필요한 효소 억제제와 PBS의 볼륨을 계산 하려면 각 샘플의 단백질 양을 계산 합니다. 이 계산에 대 한 단백질 농도 측정 단계 2.3 단계 2.3에서에서 세척 후 셀을 resuspend 하는 데 사용 하는 PBS의 볼륨에서 사용 합니다.
5. 효소 억제제와 PBS에서 3.3 m m digitonin의 1 mL를 준비 합니다. 1.65 m m의 최종 농도를 3.3 m m digitonin를 추가 합니다. 잘 혼합 하 고 5 분 동안 얼음에 품 어.
   1. Protease 억제제와 PBS에서 3.3 m m digitonin의 1 mL를 준비 될 때까지 아무 침전 볼 수 하 고 시원한 얼음에 즉시 100 ° C에서 PBS의 1 mL에 digitonin의 4 mg를 분해. Digitonin 솔루션의 1 mL를 100 x protease 억제제의 10 µ L를 추가 합니다.
      참고: digitonin의 신선한 솔루션만을 사용 합니다.
      주의: Digitonin은 독성! 사용 하 여 얼굴 마스크, 장갑 및 실험실 외 투.
6. 1.5 mL의 최종 볼륨을 가수분해 억제 물 (준비 단계 2.4에서에서)와 PBS를 추가 합니다. 10000 x g에서 원심 분리기에서 10 분 동안 + 4 ° c. 제거는 상쾌한. 이 단계에서 미토 콘 드리 아는 일지도.
7. 미토 콘 드 리아 버퍼에 미토 콘 드리 아 펠 릿을 resuspend. 미토 콘 드 리아 버퍼의 볼륨 단계 2.4에서에서 PBS의 볼륨의 절반 이다.
8. 신선한 10% 라우릴 maltoside 프로 테아 제 억제 물 (준비 단계 2.4에서에서)를 포함 하는 PBS에 준비 합니다. 1 mL 10 샘플에 대 한 충분 하다입니다. 1%의 최종 농도를 10% 라우릴 maltoside를 추가 합니다. (이 단계는 몇 시간까지 긴 될 수 있습니다) 15 분 동안 얼음에 품 어.
9. 20000 x g 에서 원심 분리기에서 20 분 + 4 ° c. 새로운 관으로는 상쾌한을 수집 합니다. 키트를 사용 하 여 Bradford 메서드에서 단백질 농도 측정 합니다. 샘플 버퍼, 라우릴 maltoside 단계 2.8에서에서 사용의 볼륨의 볼륨을 추가 합니다. 샘플-80 ° C에서 최대 6 개월까지 저장할 수 있습니다.

3. 그라데이션 젤 BN-페이지에 대 한 준비

1. 실 온에서 10 억-페이지에 대 한 그라데이션 젤 하 거 라. 그라데이션 메이커를 저 어 접시에 놓고 유연한 튜브 연동 펌프를 연결 합니다. 주입 튜브에 바늘 세트를 연결 합니다. 그라데이션 메이커의 인접 챔버로 자력 장소. 10 분 최대 펌프 속도에서 dH₂O와 튜브를 세척.
2. 빈 관과 그라데이션 메이커. 피펫으로 사용 하 여 그라데이션 메이커의 챔버 사이 채널에 남은 dH₂O를 제거. 채널 및 튜브 밸브를 닫습니다.
3. 캐스팅 프레임 및 클램프를 사용 하에 하단에 있는 구멍은, 홀더 2 개의 유리 접시를 조립 하 고 스탠드에 배치. 그것이 물 균형 직선 표면에 더 많거나 적은 다는 것을 확인 하십시오. 장소 바늘 유리 접시 사이 배관에 연결.
4. 6%와 15% 젤 솔루션 (표 2)를 준비 합니다. 얼음에 계속. 암모늄 persulphate (AP) 및 tetramethylenediamine (TEMED) (그들은 시작 중 합) 추가 마지막. 부드럽게 공기를 만드는 방지 하려면 믹스 거품.
5. 6% 젤 그라데이션 젤 믹서 튜브 챔버의 근 위 끝과 15% 젤 선단부를 로드 합니다. 총 볼륨 젤의 유리 접시 사이 분리 젤의 볼륨을 동일 해야 합니다. 따라서, 2.6 mL 6% 젤의 그리고 15% 젤 그라데이션 젤 믹서의 2.1 mL를 사용 하 여 하나의 8.3 cm x 7.3 c m 크기의 젤.
6. 자력에 스위치와 튜브와 그라데이션 메이커의 챔버 사이 채널을 엽니다. 연동 펌프에 5 mL/분으로 즉시 전환 유리 접시를 거품 젤 입력을 허용 하지 않습니다. 때 아무 젤 튜브에 바늘을 제거 합니다.
7. 부드럽게 dH₂오 유지 중 합에 대 한 1 시간 이상 실 온에서 젤 젤 오버레이.
8. 젤을 붓는 후 즉시 씻어 튜브 dH₂O 그라데이션 챔버를 작성 하 고 최대 속도로 연동 펌프를 사용 하 여. 2 더 많은 젤을 준비할 때 항상 깨끗 한 시스템 사이.
9. 젤 버퍼 x 3의 3 mL를 혼합 하 여 1 x 젤 버퍼를 준비 하 고 필터 종이 젤의 표면에서 부드럽게 dH₂O. 제거 dH₂O 6 mL를 추가 합니다. 젤 젤 버퍼 x 1의 표면 세척. 부드럽게 필터 종이 젤 버퍼 x 1을 제거 합니다.
   1. 젤에 필터 종이에서 섬유를 하지 마십시오. 이 보장 하기 위해,가 위, 종이 작은 조각으로 잘라 하지만 종이 찢 어 하지 마십시오.
10. 유리 접시 사이 빗을 배치 하지만 그것을 완벽 하 게 부 어 빗에서 겹쳐 쌓이는 젤 수 담그지 마십시오. 겹쳐 쌓이는 젤 (표 2) 4%를 준비 합니다. APS와 TEMED 추가 그들은 쉽게 중 합을 시작으로 최근. 부드럽게 피하 공기 방울 혼합.
11. 오버레이 겹쳐 쌓이는 젤, 빗, 아래 거품을 방지 하 고 빗을 완전히 몰입할. 하자 겹쳐 쌓이는 젤 유해 적어도 30 분 빗을 제거 하 고 세척 젤 버퍼를 피펫으로 사용 하 여 x 1와 우물.
    1. 중 합, 후 며칠에 대 한 젤 + 4 ° C에서 저장 수 있습니다. DH₂O와 플라스틱 젖은 종이에 젤 포장 저장 젤, 젤의 건조를 방지 하기 위하여 필름.

4. 블루 기본 젤 전기 이동 법

참고: OXPHOS의 저하를 방지 하기 위해 단지 실행 법 + 4 ° c.에 미리 냉장된 버퍼를 사용 합니다.

1. 우물의 바닥까지 블루 음극 버퍼와 젤 카세트를 로드 합니다. 샘플의 로딩 때 카세트 상단에 가득 하지 쉽습니다. 블루 음극 버퍼와 우물을 세척 하 고 피펫으로 사용 하 여 블루 음극 버퍼를 채울 우물.
2. 웰 스에 샘플 (5-30 µ g 단백질)를 로드 합니다. 부드럽게 블루 음극 버퍼와 양극 버퍼 탱크 상단에 젤 카세트를 작성.
3. 40 V의 정 전압에서 15 분 동안 젤을 실행 합니다. 다음 80 V 전압을 증가 (또는 6의 정 전류를 사용 하 여 mA), 10을 초과 하지 않는 엄마. 염료의 젤 길이 2/3에 도달할 때까지 젤을 실행 합니다.
4. 음극 버퍼와 블루 음극 버퍼를 교체 하 고 전기 이동 법 염료 전면 밖으로 실행 하고있다 때까지 계속. 총, 전기 이동 법 약 3 시간 걸립니다.
5. 유리 접시를 검색 하 고 세미 드라이 blotting에 의해 polyvinylidene 불 소 (PVDF) 막에 단백질을 전송. 25 V와 전류 1.0 A 30 분 제한의 정 전압을 사용 합니다.
   1. 또는 사용 하 여 젖은 blotting PVDF 막에 OXPHOS 단지 전송.
6. 계속 표준 immunoblotting 프로토콜에 따라 멤브레인과 항 체 외피의 차단 합니다. OXPHOS 복합물의 소 단위에 대 한 1 차 항 체를 순차적으로 사용 합니다.
   참고: 예를 들어 복잡 한에 대 한 안티-NDUFA9 항 체 (1: 2000)를 사용 나, 복잡 한 II, 복잡 한 III, 안티 COX1 복잡 한 IV 및 안티-ATP5A 항 체 (1: 2000) 복잡 한 v에 대 한 항 체 (1: 2000)에 대 한 안티-UQCRC2 항 체 (1:1000)에 대 한 안티-SDHA 항 체 (1: 2000). 항 체의 목록 자료의 테이블에에서 표시 됩니다.

BN-페이지를 사용 하 여, 미토 콘 드리 아 OXPHOS 복합물의 어셈블리에 결함 조사 수 있습니다. 그림 1A 인간의 신경 세포 (SH-SY5Y) 페니, 특히 번역 mtDNA 인코딩된 OXPHOS subunits의 억제와 치료에 호흡기 체인 단지의 어셈블리를 보여 줍니다. 페니 고갈 mitochondrially 인코딩 하위 단위를 포함 하는 OXPHOS 복합물 (복잡 한 전, 3 세, 4; 그림 1A), 복잡 한 2 차 핵 유전자에 의해 인코딩된 독점적으로 upregulated compensatorily 동안. 단지 V immunoblotted 여기 아니었다.

여러 freeze-thaw 주기 OXPHOS 단지 파괴. 그림 1B freeze-thaw 주기에 의해 OXPHOS 단지의 저하를 보여 줍니다. 여러 freeze-thaw 주기 받은 샘플 3에서에서 미토 콘 드리 아 호흡 단지 낮은 밴드 강도 있고 한 번만 냉동 같은 샘플에 비해 이동 된다. 그림 1B 의 자르지 서쪽 오 점 이미지 보 그림 1에 표시 됩니다.

젤의 품질이 선명 하 고 뚜렷하게 밴드에 대 한 중요 합니다. 그림 1 C 에서 잘 유해 하지 않은 젤 immunoblot을 보여줍니다. 막의 스트립 또한 OXPHOS 복합물의 감지를 발생할 수 있습니다. 그림 1 D, 복잡 한 내가 검색 되었습니다 스트립 전후. 신호 대 잡음 비 스트립 후 훨씬 낮습니다.

그림 1. 성공적이 고 최적의 실험에서 BN 페이지 immunoblots. (A) 미토 콘 드 리아 번역의 억제제에 의해 고갈의 OXPHOS 단지. 인간의 신경 세포 (SH-SY5Y)는 48 시간 동안 페니 (CAP)으로 치료 했다. Ctrl 키, 페니 치료 없이 제어 셀입니다. 하단 패널은 immunoblot의 정량화를 보여줍니다. 컨트롤의 값은 1 (점선으로 표시 된)가지고 간다. 데이터는 ± SD, 의미 하는 대로 표시 됩니다 n = 3, * P 제어를 사용 하 여 비교 < 0.0001 짝이 없는 학생의 t 시험. (B) 여러 동결-해 동 하 여 OXPHOS 복합물의 주기. 샘플 1-3은 동일한 조건에서 인간의 다리 셀 (143B)에서 준비 되었다. 샘플 숫자 1과 2는 동결 되었고 샘플 번호 3 수술 4 freeze-thaw 주기 동안 한 번만 녹아. (C) OXPHOS 단지 HEK293 세포에서 고립의 BN 페이지 immunoblots. 밴드의 번짐 젤의 낮은 품질에 의해 발생 합니다. (D) OXPHOS 복합물의 검출에 스트립의 효과. 복잡 한의 인간의 신경 세포 (SH-SY5Y) 같은 막의 제거 전후에서 나. OXPHOS 단지 안티-NDUFA9 항 체를 사용 하 여 검색 된 (복잡 한 나), 안티-SDHA 항 체 (복잡 한 II), 안티-UQCRC2 항 체 (복합물 III)와 안티 COX1 항 체 (복잡 한 IV). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

표 1입니다. 버퍼 및 BN-페이지에 사용 하는 솔루션

표 2입니다. BN 페이지 젤의 조리법입니다.

보충 그림 1. 자르지 서쪽 오 점 이미지의 그림 1B. 이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

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