음 세포 기관이 격리 키트를 사용 하 여 급속 한 지질 작은 물방울 격리 프로토콜

요약

이 프로토콜 지질 작은 물방울 고립과 확고 바인딩과 그물 격리 키트를 사용 하 여 마우스 간에서 정화의 새로운 방법을 설정 합니다.

초록

지질 작은 물방울 (LDs)는 가장 진 핵 어떤 prokaryotic 세포의 cytosol 내 생리 세포. LDs는 인지질과 단백질의 단층에 의해 쌌 다 중립 지질 구성 됩니다. 간장 LD 지질, ceramides, 및 단백질 등 간 steatosis의 원인이 여러 가지 질병에 연루 됩니다. 이전 방법 LD 격리에 대 한 설립 되었습니다, 하지만 그들은 시 약의 준비 시간이 필요 하 고 여러 subcellular 구획의 격리에 대 한 설계 되지 않았습니다. 우리 민 변, 바인딩과 그물 (응급실), 및 단일 마우스 간에서 리소좀의 격리 수 있도록 새로운 프로토콜을 확립 하고자 했다.

더, 여기에 제시 된 프로토콜에 사용 된 모든 시 약 상업적으로 사용할 수 있으며 LD 순수성을 희생 하지 않고 최소한의 시 약 준비 필요. 여기 우리가 비교 순 결, 형태학, 고 수율을 보여주는 데이터를이 새로운 프로토콜 표준 자당 그라데이션 프로토콜을 비교 제시. 또한, 우리가 격리 수 응급실과 같은 샘플을 사용 하 여 리소좀 형성 및 지질 및 그들의 관련 된 단백질의 세포내 유량으로 상세한 통찰력을 제공.

서론

LDs는 생리 세포 가장 진 핵 세포의 cytosol 그리고 어떤 prokaryotic 세포^1,,23에서 발견. LD 코어 triglyceride (TG) 및 콜레스테롤 에스테 르와 같은 중립 지질으로 구성 된다. 그들은 또한 ceramides, 생리 활성 지질 세포 신호 통로^4,5에 포함 되어 있습니다. LDs는 인지질 단층으로 둘러싸여 있으며 perilipin 단백질 perilipin 2 (PLIN2) 및 3 (PLIN3)^1,,56을 포함 하 여 단백질 코팅. 또한 현재는 lipogenic 효소, lipases, 그리고 무 알콜 지방 간 질환, C 형 간염^{3,5, 알코올 간 질환 등 여러 가지 간장 steatotic 질병에 연결 된 멤브레인 밀매 단백질}

프로토콜

모든 실험 biosafety 수준 1, 실험실 외 투, 안전 고글, 장갑, 등에 대 한 적절 한 개인 보호 장비와 실험실 벤치에서 실시 했다. 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 펜실베니아 대학에 의해 찬성 하는 프로토콜에 따라 수행 했다. 모든 노력, 동물 불편을 최소화 하 고 동물 인도적인 치료로 치료 했다.

1. LD 격리 응급실 격리 키트를 사용 하 여

1. 준비
   참고: 나열 된 금액은 단일 1 g 마우스 간에 적합 합니다.
   1. 초순의 8 mL와 5 x IE 버퍼의 2 개 mL를 희석 하 여 1 x isotonic 추출 버퍼 (IE 버퍼, 응급실 격리 키트에서) 10 mL를 준비 합니다. 얼음에 그것을 배치 하 여 버퍼를 냉각 하십시오.
   2. 초순의 90 mL에 10 x PBS의 10 mL를 diluting 하 여 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1의 100 mL를 준비 합니다. 얼음에 그것을 배치 하 여 차가운.
   3. Diluting 500 µ L PGPE의 초순 9.5 mL에 의해 5% 폴 리 에틸렌 글리콜 p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-페 닐 에테르 (PGPE)의 10 mL를 준비 ....

결과

우리는 약 30 쥐에 어 키트 LD 격리를 수행 하 고 약 40 쥐에 자당 격리 프로토콜을 따르고 그 결과 비교. 보고 된 연구 결과 두 프로토콜에 대 한 전형적인입니다. 마우스는 LD 수율을 높이기 위해 물에 자유 접근에와 함께 하룻밤 금식 했다. 자당 기온 변화도 사용 하 여 LD 격리 응급실 키트 LD 격리 프로토콜와 병렬로 실행 되었습니다. PNS, PMS, 샘플 당, CLDs, 그리고 LDs 응급실 키트 LD 격리 프로토콜에 걸쳐 수집 했다. 자당 격리 프로토콜의 워크플로 제한 때문만 PNS와 LD 분리 수집 했다.

형광 현미경 검사 법에 대 한 격리 LDs의 50 µ L 100 µ M 4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene (DPBDI)의 동등한 양으로 혼합 했다. 샘플 빛에서.......

토론

간장 LD 생물학은 점점 건강 및 질병에 간세포 생리학의 중요 한 레 귤 레이 터로 인식 되 고 있습니다. 타고 난 세포로 LDs는 동적와 상호 작용 다른 세포 구조, 지질 및 포도 당 항상성에서 포함 된 그들 bioactive 구성 요소에서 포함. 자당 그라데이션 LD 격리 일상적으로 사용 하 고 LD 구조, 연구 조사를 가능 하 게 하지만 그것은 수많은 버퍼를 만들기 위해 그들을 요구 한다. 우리는 증명 하고있다 상용 ER 격리 키트의 사용 뿐만 아니라 LD 격리 하지만 응급실의 리소좀, 탠덤 격리에 대 한 사용할 수 있는 다른 도구는 세포 역학 변화에 대 한 응답의 더 포괄적인 보기 허용 실험 조건, 워크플로 크게 증가 하지 않고입니다.

이 새로운 프로토콜의 힘은 상업적으로 사용 하 여 설치 또는 쉽게 사용할 수 있는 시 약 및 그것의 능력을 동시에 여러 세포를 분리의 용이성 이다. 그러나, 명심할 것이 새로운 방법에 잠재적인 단점이 있다. 이 프로토콜의 여러 단계 간에서 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
BioExpress Vortex Mixer	GeneMate	S-3200-1	Vortex Mixer
Centrifuge 54242 R	Eppendorf	54242 R	냉장 카운터 마이크로 원심분리기 로터: FA-45-24-11
원심분리기 Sorvall RC6 +	Thermo Scientific	RC6+	냉장 고속 원심분리기 로터: F21S-8x50Y
원심분리기 Sorvall Legend RT+	Thermo Scientific	Legend RT +	냉장 고용량 원심 분리기 로터 : 75006445 버킷 : 75006441
cOmplete 프로테아제 억제제 칵테일	시그마 Aldrich	04 693 116 001	프로테아제 억제제 정제
Diagenode Bioruptur UCD-200	Diagenode	UCD-200	초음파 처리 시스템
Dounce Tissue Grinder (45 mL)	Wheaton	357546	사용 느슨한 유봉
Dulbecco의 인산염 완충 식염수 (1x)	Corning	21-031-CM
소포체 분리 키트	시그마 알드리치	ER0100	ER 키트 추출: 포함: 등장성 추출 버퍼 5X 100 mL Hypotonic 추출 버퍼 10 mL 염화칼슘, 2.5 M 용액 5 mL OptiPrep 밀도 그라디언트 매체 100 mL 블런트 코 바늘 1개.
형광 여기용 외부 광원	Leica Leica	EL6000
염산	Sigma Aldrich	H1758	염산
ImageJ			이미지 분석 소프트웨어
Inverted Modulating Contrast Microscope	Leica	Leica DM IRB
조직 및 배양 세포용 리소좀 농축 키트	Thermo Fisher Scientific	89839	리소좀 절연
현미경 카메라	Qimaging	QICAM fast 1394
Optima XL-100K 초원심분리기	Beckman-Coulter	XL-100K	초원심분리기 로터: SW41Ti
파스퇴르 피펫	Fisher Scientific	22-042817
페트리 접시 5cm	Fisher Scientific	FB0875713A
Pierce BCA 단백질 분석 키트	Thermo Fisher Scientific	23225
PhosSTOP	Sigma Aldrich	04 906 845 001	Phosphatase Inhibior 정제
멸균 수술용 칼날 #10	Pioneer	S2646
설탕	Fisher Scientific	S5-500	결정질/인증 ACS
트리글리세라이드 Liquicolor Kit	Stanbio	2200-225	비색 트리글리세라이드 키트
트리스 베이스	피셔 사이언티픽	BP152-1	TE 버퍼
트리톤 X-100	피셔 바이오 시약	BP151-100	5%, 폴리에틸렌 글리콜 p-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)-페닐 에테르, 단백질 용해 시약
초순수 EDTA (0.5M, pH 8.0)	버퍼용	Thermo Fisher Scientific	15575-038