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방법 논문

유 방 땀 샘에서 조사 된 유기 체의 성장과 특성화

7.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/59293

⸱

2019년 5월 3일

 ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Vanderbilt University, 2Department of Biomedical Engineering, Vanderbilt University, 3Department of Radiation Oncology, Vanderbilt University Medical Center

이 논문에서

요약

마우스 유 방 땀 샘에서 개발 된 소기관을 조사 하 고 면역 세포와의 상피 특성과 상호 작용을 평가 하는 것을 특징으로 한다. 조사 된 유기 체는 조사 된 정상 조직에서 종양 세포 모집을 유도할 수 있는 세포-세포 상호작용을 더 잘 평가 하기 위해 사용 될 수 있다.

초록

소화 조직 으로부터 유래 된 오 르가 노이 드는 세포 단층 보다 생체 내 조건에서 더 잘 탈환 되는 다중 세포 3 차원 (3d) 구조 이다. 비록 그들은 완전히 생체의 복잡성을 모델링할 수 없습니다., 그들은 원래 장기의 일부 기능을 유지. 암 모델에서, 오 르가 노이 드는 일반적으로 종양 세포의 침략을 연구 하는 데 사용 됩니다. 이 프로토콜은 정상 조직에서 방사선 반응을 평가 하기 위해 정상 및 조사 된 마우스 유선 조직에서 유기 체를 개발 하 고 특성화 하는 것을 목표로 합니다. 이러한 유기 oid는 방사선 조사 된 소기관과의 종양 세포 상호작용을 평가 하기 위해 미래의 시험관 내 암 연구에 적용 될 수 있다. 유 방 땀 샘은 절제 되었고, 20 Gy에 조사 되었으며, 콜라 게 나아 제 VIII 용액으로 소화 되었습니다. 상피 소기관은 원심 분화를 통해 분리 되었고, 3 차원 유기 체는 96-잘 저 접착 마이크로 플레이트에서 개발 되었다. 유기 oid는 특징적인 상피 마커 사이토 케 라틴 (14)을 발현 시켰다. 대 식 세포와 소기관 간의 상호작용은 공동 배양 실험에서 관찰 되었다. 이 모형은 종양 간 질 상호 작용, 면역 세포의 침 윤 및 조사 된 미세 환경 내에서의 대 식 세포 분극을 연구 하는 데 유용할 수 있습니다.

서론

삼중 음성 유방암 (TNBC)의 약 60% 환자는 치료1의 한 형태로 서 유 방 보존 요법 (bct)을 선택 한다. 이러한 치료 양상에서, 유 방 조직의 일부를 포함 하는 종양은 제거 되 고, 주변 정상 조직은 잔류 종양 세포를 죽이기 위해 이온화 방사선에 노출 된다. 치료는 유방암 인구의 다량에 있는 재발을 감소 시킵니다; 그러나 TNBC를 사용한 치료 대상 환자의 약 13.5%가 locoregional 재발2를 경험 한다. 따라서, 방사선은 순환 종양 세포를 모집 할 수 있는 방법을 연구 (ctcs) 로컬 재발에 대 한 중요 한 통찰력으로 이어질 것입니다3,4.

이전 작업에서는 정상 조직의 방사선이 다양 한 세포 유형5의 모집을 증가 시킨다는 것을 보여주었습니다. TNBC의 전 임상 모델에서 정상 조직에 대 한 대 식 세포 증가 및 후속 적 종양 세포의 조사는 정상 조직5에 관한 것 이다. 면역 상태는 조사 된 사이트에 종양 세포 모집에 영향을 미쳤다, 종양 세포 이동은 면역 손상 된 과목에서 관찰. 유 방 땀 샘에서 파생 된 오 르가 노이 드를 사용 하 여 이러한 상호 작용은 현미경 및 살아있는 세포 이미징을 통해 실시간으로 세포 이동 및 세포 간 질 상호 작용을 관찰 하 여 변경 시 방사선 손상의 역할을 결정할 수 있습니다. 종양 세포 행동.

마우스 유 방 소기관은 유선의 발달에서 주요 단계를 명료 하 게 도왔습니다. 유 방 소기관은 50 μm6,7,9,10보다 큰 고립 된 유 방 상피의 다중 세포, 3 차원 구조입니다. 1 차적인 상피 소기관을 사용 하 여, 시 미안 외. 유선에서 분기에 필요한 요인을 평가7. 샤미르 외. 확산은 중간 엽 전이에 상피 없이 발생할 수 있음을 발견, 전이성 캐스케이드에 대 한 통찰력을 제공8. 유선 조직 으로부터 유기 oid를 생성 하 고 특성화 하는 방법은 잘 확립 되어 있다6,11,12,13. 그러나, 우리의 지식에, 유 방 땀 샘에서 조사 된 유기 체를 성장 시키는 방법은 보고 되지 않았습니다. 조사 된 오 르가 노이 드의 성장 및 특성화를 위한 프로토콜은 방사선-유도 면역 및 종양 세포 모집을 탈환 하는 중요 한 단계 일 것 이다.

이 논문에서, 우리는 구상 된 유 방 상피 소기관의 성장 및 특성화를 위한 방법을 보고 하며,이는 구형 oid의 형성을 지 원하는 친수성 고분자로 코팅 된 저 밀착 마이크로 플레이트입니다. 이들 유기 체는 면역 세포 침투 동역학을 조사 하기 위해 대 식 세포와 공동 배양 하였다. 이 작업은 종양-면역 세포 상호 작용을 연구 하기 위해 종양 세포 모집 및 CD8 + T 세포를 가시화 하기 위해 유 방 특성, 유방암 세포를 다시 캡처하는 지방 세포와의 공동 배양을 포함 하도록 확장 될 수 있다. 이전에 확립 된 프로토콜은 조사 된 유기 체를 평가 하는데 사용 될 수 있다. 이전 모델은 유 방 소기관 및 면역 세포를 공동 배양 하 여 전이 및 보급 메커니즘에 빛을 발산 했습니다. DeNardo et al. 종양 관련 대 식 세포의 CD4 + T 세포 규제가 유 방 암 종의 전이성 표현 형을 향상시켰다는 것을 발견 하였다. 공동 배양 모델은 또한 생물학적 개발의 메커니즘을 명료 하 게 하는 데 사용 되었습니다. Plaks et al. 유선의 다운 조정기로 서 CD4 + T 세포의 역할을 명확히 했다15. 그러나, 우리 그룹은 정상 조직 조사가 면역 세포 행동에 미치는 영향을 시각화 하는 절차를 확립 하는 첫 번째입니다. 정상 조직 조사는 종양 세포 모집5를 강화 하는 것으로 나타났습니다 때문에,이 프로토콜은 종양 세포 행동이 정상 조직과 세포의 조사에 의해 변경 되는 방법을 분석 하기 위해 추가로 개발 될 수 있기 때문에, 더 큰 이해를 선도 암 재발.

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프로토콜

동물 연구는 밴 더 빌 트 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회가 승인한 제도적 지침 및 프로토콜에 따라 수행 되었습니다.

1. 쥐 및 세포 취득의 준비 (응 우 옌-옥 외11)

  1. 아 티 믹 Nu/Nu 마우스 (8-10 주)를 희생 하 여 자 궁 경부 탈 구가 이어지는 co2 질 식 사용. 70% 에탄올을 사용 하 여 피부를 청소 합니다.
  2. 사전 멸 균 된가 위 및 집게를 사용 하 여 쥐에서 복 부 및 사 타 구니 유 방 동맥을 절제 하십시오. 절제술 전에 림프절을 제거 하십시오. 멸 균 된 1x 인산 완충 식 염 수가 (도 1a)로 헹 궈 냅니다.
  3. Dulbecco의 변성이 글 미디어/영양 혼합물 10ML(DMEM/F12)를 사용 하 여 15 mL 튜브에 넣고 운반 하십시오. 샘플은 4°c에서 밤새 보관 하거나 즉시 처리 될 수 있다. 얼음을 계속.
  4. 세 슘 소스를 사용 하 여 20gy에서 샘플을 조사 합니다 (그림 1b).
  5. 조사 후 45 분이 지나면 유 방 땀 샘을 35 mm의 멸 균 셀 플레이트에 놓고 scalpels를 사용 하 여 다진에 놓습니다 (그림 1c, D). 약 40 획이 있는 mince는 조직이 이완 되 고 조각이 얻어질 때까지 약 1mm2 의 지역 보다 크지 않습니다.
  6. 50 mL 원심 분리기 튜브에 콜라 게 나아 제 용액으로 옮깁니다. 콜라 게 나아 제 용액은 2mg/ml의 콜라 게 나아 제 ( 물질 표참조), 2mg/ml의 태아 소 혈 청 (FBS), 5 μ g/m l 인슐린 및 50 μ g/m l의 겐 타 마이 신을 DMEM/F12 배지에서 구성 하였다. 마우스 당 10ml의 콜라 게 나아 제 용액을 사용 하십시오.
  7. 37 ° c의 수조에 넣고 10 분 간격으로 30-60 분 동안 볼 텍 싱 합니다. 콜라 게 나아 제 용액이 흐린 경우에는 소화가 완료 된다 (도 1e, F).
  8. 실 온 (RT)에서 10 분 동안 450 x g 의 소화 용액을 아래로 돌립니다. 세 개의 레이어가 관찰 됩니다. 상기 상층 액은 지방으로 구성 되 고, 중간층은 수 용액 이며, 바닥은 펠 렛 이다. 펠 릿은 상피 세포, 개별 기질 세포 및 적혈구의 혼합물로 서 적색으로 나타난다 (그림 1g).
  9. 접촉 하기 전에 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 용액으로 모든 파이 펫, 피 펫 팁 및 원심 분리기 튜브를 미리 코팅 하십시오. BSA 솔루션은 Dulbecco의 인산 완충 식 염 액 (DPBS)에서 2.5% BSA로 구성 되어 있습니다. 사전 코팅을 위해, 단순히 다음 파이 펫 팁과 튜브의 내부에 BSA 솔루션을 제거 추가. BSA 솔루션을 재사용할 수 있습니다., 비록 그것은 각 실험 전에 멸 균 필터링 해야.
  10. 추가 회복을 위해, 상층 액을 신선한 BSA 코팅 15 mL 튜브로 전달 하십시오. 위 아래로 적극적으로 지방 층을 분산 하는 파이 펫. RT에서 10 분 동안 450 x g 에서 원심 분리기를 사용 하 여 상층 액을 흡입 하 여 세포 펠 렛을 흡입 하지 않도록 튜브에 소량의 배지를 남깁니다.
  11. 원래 펠 릿 튜브에서 수성 층을 흡입.
  12. 원래 펠 렛으로 튜브에 10ml의 DMEM를 넣고 두 번째 튜브로 이동 합니다. 파이 펫은 두 개의 펠 릿을 결합 하 고 소생 시킵니다.
  13. RT에서 10 분 동안 450 x g 에서 원심 분리기를 통해 상층 액을 흡입 하 고 튜브에 DMEM/F12를 추가 합니다.
  14. 40 μ l (DNase)을 현 탁 액에 추가 하 고 deoxyribonuclease에서 2-5 분 동안 손으로 부드럽게 흔들어 DMEM/F12에서 4U/mL DNase로 구성 됩니다.
  15. DMEM/F12 및 파이 펫 6 mL을 철저히 추가 하십시오. RT에서 10 분 동안 450 x g 에서 튜브를 원심 분리기.
  16. 0.5 mL 마크에 상층 액을 흡입. 10ml의 DMEM 및 피 펫에 완전히 소생 시킵니다.
  17. 450 x g 에 펄스를 하 고 그 속도에 도달 하면 4 초를 중지 합니다.
  18. 1.16-1.17 단계를 3 회 더 반복 하 여 원심 분화를 통해 소기관을 정화 합니다. 펠 릿은 이제 상피 소기관 으로만 구성 된 오프 화이트 색상 이어야 합니다 (그림 1h).
    참고: 유기 Oid는 멸 균 메시 40 μ m 필터를 사용 하 여 필터링 할 수도 있습니다. 1.16 단계 후, 필터를 통해 유기 oid를 포함 하는 피 펫 배지를 원심 분리기 튜브에 넣고, 5 내지 10ml의 DMEM/F12 배지로 헹 궈 냅니다. 새로운 50 mL 원심 분리기 튜브 위로 필터를 뒤집습니다. DMEM/F12 미디어 10ml를 통과 하 여 그 반대 방향으로 헹 궈 냅니다. 리 텐 테이 트는 오 르가 노이 드로 구성 되어야 하며, 여 액은 주로 폐기 되거나 원할 경우 보관할 수 있는 기질 세포로 구성 되어야 합니다.

2. 밀도 및 도금 유기 oid 결정

  1. 10MlDMEM/F12에서의 소생 펠 렛. 완벽 하 게 균질 한 용액을 만듭니다.
  2. 50 µ L을 30 mm 페 트리 디쉬로 전송 하 고, 위상차 현미경을 20x로 볼 수 있습니다. 집계 카운터를 사용 하 여 소기관 수를 셉니다.
    참고: 여기에서 피 펫 팁은 457 μ m의 최소 지름과 함께 일관 되 게 사용 되었으며,이는 시드 된 소기관의 지름 5-10 배입니다. 2 mL 이상의 부피를 전송 하는 경우 (예: 1.16 및 2.1 단계), 팁 직경이 1500 μ m를 초과 하는 혈 청 피 펫을 사용 하십시오.
  3. 다음 방정식을 사용 하 여 관 능 밀도를 계산 합니다.
    figure-protocol-1
    원하는 밀도는 1000 유기 체/m l은 추가 희석을 단순화 합니다. 밀도가 너무 낮으면, 5 분 동안 450 x g 에서 원심 분리 하 고 미디어를 흡 인 한다. 1000 유기 체/m l에 도달 하는 데 필요한 매체를 추가 하 고 균질 한 혼합물을 생성 하기 위해 피 펫을 철저히 합니다.
    1. 단백질 매트릭스에서 오 르가 노이 드를 성장 시키기 위해, 콜라겐 유형 1에서 1 개의 세포/L의 농도로 씨앗 소기관을 87%로 희석 하 고, 엥 겔 브 스-홀 름-군단의 쥐 육 종에서 추출한 지 하 막에서 추출 하였다. 샘플로 작업 하는 동안 얼음을 유지 하십시오.
    2. 소기관을 동결 하려면 원하는 체적을 별도의 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. 450 x g 에서 5 분 동안 스핀 다운 하 여 미디어를 흡 기 한 다음 동일한 부피의 90% FBS을 추가 합니다. 유기 체를 소생 시킨 다음, 동결 튜브로 분해 합니다. -80 ˚ C로 이동한 다음 1 주일 이내에 액체 질소로 전송 합니다.
    3. 해 동 하려면, 37 ˚ C 수 조에서 1 분간 따뜻하게 하 고, 5 분간 450 x g 에서 원심 분리 한 다음, 동결 매체를 흡 인 한다. 멸 균 된 DPBS로 헹 군 다음 다시 원심 분리기. DPBS를 흡입 하 고 소기관 매체를 추가 합니다.
  4. 피 펫 50 µ L (50 소기관)을 저 밀착 판의 각 웰에 투입 한다 (그림 1i).
  5. 150의 µ L을 추가 하 여 총 작업 볼륨을 200 µ l. 유기 체 미디어는 DMEM/F12 미디어에서 1% 페니실린 streptomycin 및 1% 인슐린 트랜스 페 린 셀레늄으로 구성 됩니다.
  6. 이틀 마다 미디어를 주의 해 서 교체 하십시오.
    참고: 낮은 접착 판은 조직 배양 처리 되지 않습니다; 따라서, 세포는 쉽게 분리 될 수 있다. 플레이트를 기울여 각 웰의 가장자리에 파이 펫 팁을 삽입 하 여 미디어를 천천히 흡입 합니다. 우물의 바닥에 소량의 매체를 남겨 두십시오. 새 미디어를 천천히 추가 하 여 유기 체에 불필요 한 전단 력을 적용 하지 않도록 합니다.

3. 대 식 세포와의 공동 배양

  1. 10% FBS 및 1% 페니실린 streptomycin로 보충 되는 DMEM 매체에 있는 GFP 또는 dTomato-라벨링 된 원시 264.7 대 식 세포를 유지 하십시오. 종자 1 x 104×104 또는1 x 105 세포/ m l을 관 능 적 매체에 투입 한다.
  2. 살아있는 세포 상 대조 및 형광 성 화상 진 찰을 사용 하 여 시간에 따른 대 식 세포 침투를 모니터링 합니다.

4. 유기 oid의 면역 형광 염색

참고: 유기 Oid는 낮은 접착 웰에 얼룩이 있거나 챔버 슬라이드로 옮길 수 있습니다. 전달 하려면, 유기 체를 접시에서 분리할 때까지 부드럽게 발라 주세요. 챔버 슬라이드에 전송 하 고 4-8 h에 대 한 배양을 통해 유기 oid가 플레이트 표면에 부착 되도록 합니다.

  1. 조심 스럽게 흡입 하 여 우물에서 소기관 매체를 제거 합니다. RT에서 15 분 동안 10% 중성 완충 포 르 말린으로 샘플을 수정 합니다.
  2. PBS 1 개에서 3x 5 분을 씻으십시오. 원하는 경우, 고정 된 샘플은 추가 염색을 위해 1 주일 동안 4°c에서 보관할 수 있습니다.
  3. 5 분 동안 0.1%의 페 닐 폴 리 에틸렌 글리콜과의 투과와 Tetramethylbutyl.
    참고: 액 틴에 대 한 얼룩을 위해 phalloidin 희석 1:1000 및 1.67 nM의 비 벤 제 이미 드 핵 염료를 RT에서 1 시간 동안 1% PBS/BSA에서 시료를 배양 합니다. 그런 다음 4.8 단계로 진행 합니다.
  4. 0.5 PBS와의 가용성. 샘플은 4opy 이미지와 면역 형광 이미지에 저장할 수 있습니다. 0.1%의 정상 염소 혈 청으로 CTC rlock에 기여 하는 기계 장치 RT에서 1 시간 동안 pbs/폴 리 에틸렌 글리콜 소 르 비 탄 monolaurate (PBST)를 사용 하 여 3 ~ 5 분.
  5. 항 사이토 케 라틴 (14) 희석, 전자 Cadherin 희석 1:200 또는 타이트 접합 단백질을 RT에서 1 시간 동안 PBST에서 1% NGS로 희석 1:100을 사용 하 여 PBST에서 3x 5 분간 씻으십시오.
  6. RT에서 1 시간 동안 1% NGS/PBST의 염소 반 토끼 2 차 희석 1:200으로 배양 합니다. 빛 노출을 피하기 위해 호 일 커버.
  7. PBS에서 3 배 5 분간 씻으십시오. 핵 염료 ( 재료 표참조)를 사용 하 여 핵 염색을 합니다.
  8. PBS에서 3 배 5 분간 씻으십시오. 챔버 슬라이드를 사용 하는 경우 커버 슬립으로 장착 하십시오. 4 ° c에서 최대 2 주 동안 포 일에 싸서 보관 하십시오.

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결과

조사 된 상피 유선 유기 체는 마우스 유 방 땀 샘에서 성공적으로 장악 되 고, 처리 되 고, 저 접착 판에서 배양 되었습니다 (그림 1). 오 르가 노이 드 수율은 상이한 성장 환경에서 시 딩에 의해 시험 되었다 (도 2Ag). 10 cm 세포 판을 처리 한 조직 배양 물에 직접 세포를 파 종 하는 것은 섬유 아 세포의 자라 난을 산출 했습니다. 섬유 아 세포는 유기 체와 같은 초점의 동일 평면에 또는 가까운 상 대조 현미경에서 확인 되 고, 그들은 며칠 안에 도금 된 소기관에서 빨리 성장 했습니다. 섬유 아 세포의 성장 또한 지 하 막 및 콜라겐 단백질 매트릭스에서 소기관 될 때 관찰 되었다 (도 2e, F).

조사 된 소기관 성장을 최적화 하기 위해 다양 한 조건이 테스트 되었습니다 (그림 2h). 콜라 게 ...

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토론

이 프로토콜에서, 우리는 조사 된 유 방 유기 체의 성장 및 특성화를 재현 하기 위한 방법을 개발 했습니다 (그림 1). 20gy의 조사 량은 종양 세포 모집5의 생체 내 모델 이전에 거울에 적용 되었다. 유 방 땀 샘의 조사는 생체 내 형성 이전에 면역 세포의 상응 하는 침 윤 없이 방사선 손상 효과의 분리를 허용 하였다. 시험관 내 조사 된 정상 조직 모델의 개발은 방사선 유도 CTC 모집11,12에 기여할 수 있는 세포 상호작용의 실시간 시청을 가능 하 게 한다.

오 관 능 수율을 극대화 하기 위해 1.5-1.18 단계를 밀접 하 게 수행 하는 것이 중요 했습니다. 우리는 소화 용액에 농축 된 콜라 게 나아 제를 해 동 하는 것을 추가 했습니다. 농축 된 콜라 게 나아 제 분...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

우리는 GFP와 dTomato 표지 된 원시 264.7 대 식 세포를 제공 하는 닥터로 라 l. 브 론 사르 감사 합니다. 이 연구는 재정적으로 NIH 그랜트 #R00CA201304에 의해 지원 되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10% 중성 완충 포르말린VWR16004-128
항시토케라틴 14abcamab181595로트: GR3200524-3
소 혈청 알부민시그마A1933-25G
콜라겐 유형 I코닝354236
클로스트리듐 히스톨리티쿰의 콜라겐 분해 효소, 유형 VIII시그마C2139
콜라겐 분해 효소 IGibco17018029
DMEM / F12Thermofisher11320-033
DNAseRoche10104159001
DPBSFisher14190250
E-Cadherin세포 신호전달 24E10Lot : 13
FBSSigmaF0926
GentamicinGibco15750
염소 안티 토끼 보조abcamab150077green
로트: GR3203000-1
염소 안티 토끼 보조abcamab150080red
로트: GR3192711-1
Hoechst 33342Fisher62249로트: TG2611041
인슐린(10mg/mL)Sigmai9278
인슐린-트랜스페린-셀레늄, 100xGibco51500-056
Matrigel Basement Membrane (Engelbreth-Holm-Swarm 마우스 육종에서 추출한 기저막)Corning356237
Normal Goat SerumVector LaboratoriesS-1000
Nuclon Sphera 96 well platesThermo174927
PBSVWR10128-856
Pen/strepFisher
Phalloidinabcamab176757Lot: GR3214582-16
Tight Junction Protein 1NovusNBP1-85047Lot: C115428
Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol)SigmaX100-100ML
TrypsinGibco27250-018
Tween-20 (폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노라우레이트)시그마P1379-100ML
15140122

참고문헌

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  11. Nguyen-Ngoc, K. -V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. 3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion. Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).
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유 방 땀 샘에서 조사 된 유기 체의 성장과 특성화
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