방법 논문

미토 콘 드리 아 호흡기 사슬 슈퍼 복합체의 분리 및 분석을 위한 하이브리드 클리어/블루 천연 전기 영동

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DOI:

10.3791/59294

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2019년 5월 19일

 , 
1Interdisciplinary School of Health Science, Faculty of Health Sciences and Department of Cellular and Molecular Medicine, Faculty of Medicine, University of Ottawa

이 논문에서

요약

여기에서는 세제 및 Coomassie 청색에 대 한 노출을 최소화 하는 미토 콘 드리 아 슈퍼 복합체를 추출, 해결 및 식별 하는 프로토콜을 제시 합니다. 이 프로토콜은 분해능과 효소 활동의 보존 사이에 최적의 균형을 제공 하는 동시에 불안정 한 단백질-단백질 상호작용을 잃을 위험을 최소화 합니다.

초록

산화 적 인 산화 기계 장치의 복합체는 미토 콘 드리 아에 구조적이 고 기능적인 이점을 부여 하는 것으로 추정 되는 슈퍼 복합체 (SCs) 라는 초 분 자체 단백질 배열을 형성 한다. SCs는 효 모에서 포유류에 이르기까지 많은 종에서 확인 되었으며, 연구의 증가는 유전 및 후천성 인간 질병에 있는 그들의 조직의 중단을 보고 합니다. 결과적으로, 실험실의 증가 수는 방법론적으로 까다로울 수 있는 SCs 분석에 관심이 있습니다. 이 문서에서는 블루 및 클리어 네이티브 페이지 방법의 장점을 결합 하 여 시간 효율적인 방식으로 SCs를 확인 하 고 분석 하는 최적화 된 프로토콜을 제공 합니다. 이 하이브리드 CN/BN 페이지 방법으로, 중성 세제의 최적 양으로 추출 된 미토 콘 드리 아 SCs는 다른 세제에 노출 되지 않고 전기 영동의 시작 부분에서 음이온 성 염료 Coomassie 블루 (CB)에 간략하게 노출 digitonin. CB에 대 한이 짧은 노출은 기존의 BN 페이지 방법과 마찬가지로 SCs를 효과적으로 분리 하 고 해결 하는 동시에, SCs 내에서 젤 내 활성 분석에 대 한 높은 CB 수준의 부정적인 영향을 피하는 한편, 불안정 한 단백질-단백질 상호작용을 허용 합니다. 이 프로토콜을 사용 하면 SCs의 고급 분석을 위한 2D 전기 영동, 면역 검출 및/또는 프로 테오 믹스를 포함 하는 분석 기법과 젤 활성 측정에서 정밀 하 고 신속 하 게 결합할 수 있습니다.

서론

미토 콘 드리 아는 산화 적 인 산화를 통해 에너지를 생산 하 고 호흡기 복합체 I-II-III-IV는 기질을 산화 시키고 전자를 산소로 전달 하 여 ATP 신 타제 (CV)에 의해 ADP의 인 산화를 허용 하는 그라데이션을 생성 합니다. 지난 몇 년 동안, 광범위 한 연구에 따르면 호흡기 사슬 복합체는 미토 콘 드리 아 막 내부에서 선형 방식으로만 통합 되지는 않았지만 슈퍼 복합체 (SCs) 배열1,2로 구성 됩니다. 포유류 미토 콘 드리 아에서, SCs는 다양 한 stoichiometries에 존재 합니다: CI/CIII2/문명1-4 (respirasome로 명명 되 고 nadh의 능력이 있는 경우)2, CI/ciii 2 및 ciii 2 /문명1-23,4. 또한, 호흡기 복합체는 자유로운 형태와 SCs 배열 사이의 상이한 비율로 분배 된다. 따라서 SCs의 85%는 CIII의 55% ~ 65%, 그리고 CIV의 15%가 발견 되는 것으로 추정 됩니다. 이러한 초 분자 구조는 ROS 생산을 감소 시키거나, 개별 복합체의 조립을 안정화 시키거나, 호흡기 사슬 활성을 조절 하 고, 단백질이 풍부한 내부 미토 콘 드리 아 막 5에서 단백질 응집을 방지 하는 것으로 생각 된다 ,6,7,8. 그들의 에너지 수요의 변화와 질병의 발병 기 전에 서의 중요성에 대 한 그들의 재 모델링 능력은 여러 실험실에서 조사 되 고 있습니다. 11 , 12 , 13 , 14. 연구에의 하면 SCs 조립 체의 병리학 적 변화는 심장 마비16의 심장과 올 리 핀 합성에서 유전적 결함을 포함 하 되이에 국한되지 않는 다양 한 장애에 존재 한다는 것을 입증 하였으며, 허 혈 재 관류17, 당뇨병12및 노화18.

기본 전기 영동 및 면역 검출은 oxphos 복합체 4 차 배열2,19,21을 해결 하기 위해 SCs 연구에서 널리 사용 됩니다. 천연 전기 영동은 다양 한 SCs 어셈블리1,19의 정밀한 분자 측정을 가능 하 게 하기 위해 겔 활성 분석 또는 2d-sds 페이지에서 특정 하 게 결합 될 수 있다. SCs를 연구 하는 능력은 사용 되는 세제의 유형 및 농도, 이온 강도 및 pH 뿐만 아니라 완충 조성, CB, 젤의 존재를 포함 하는 전기 영동 마이그레이션 조건 등 추출 조건에 결정적으로 의존 합니다. 크기 및 아크릴 아 미드 비율2.

프로토콜 및 SCs 대역 해상도는 논문에 따라 크게 달라 지 며, 연구 간의 비교는 어렵고22에 도전 하는 방법의 적응을 어렵게 합니다. 따라서, 본 논문은 비 이온 성 세제 digitonin와 다른 소스의 격리 된 미토 콘 드리 아 로부터 SCs를 추출 하 고, 고 분자량 SCs 대역을 해결 하기 위해 강력 하 고 최적의 프로토콜을 제안 한다. 최적화 된 세제 농도, 추출 완충 액의 조성, 시료 전처리 시 Coomassie 청색의 부재는 단백질 복합체의 파괴를 최소화 합니다. 이 프로토콜 ( 그림 1 참조)은 대형 젤에 대 한 최적의 SCs 어셈블리 분해능을 위해 CN 페이지와 BN 페이지를 결합 하 고 있으며, 반응성 밴드의 더 나은 시각화를 가능 하 게 하는 젤 내 활동 분석과 호환 됩니다. 상세한 분석을 위한 면역 검출 SCs 배열 및 조성 물.

프로토콜

1. SC 추출

  1. 물에 EDTA를 용 해 하 여 추출 완충 액 100 mL를 준비 합니다 ( 표 2참조). KOH를 완전히 녹을 때까지 pH를 증가 시킨 다음 HCl로 pH를 7.5로 조정 하십시오. 용액에 남아 있는 성분을 추가 하 고 물로 최종 부피를 완성 하 고 얼음을 유지 합니다. 튜브에서 추출 완충 액을 digitonin 용 해 하 여 10%의 스톡 용액을 완전히 녹을 때까지 철저히 녹 인 후 얼음을 유지 하십시오.
    주: 추출 완충 액은 미리 준비 하 여 4°c에서 최대 2 개월 동안 보관할 수 있다. 물결 모양의 밴드가 겔의 바닥에 나타나기 시작 하면 추출 버퍼가 너무 오래 되었음을 의미 합니다. 10% digitonin 용액을 준비 하는 경우, 마우스 간 미토 콘 드리 아를 사용 하는 경우 샘플 당 500 µ L을 계산 하는 스톡 볼륨을 준비 합니다. Digitonin 용 해도는 원산지 및 제품 로트에 따라 다릅니다 ( 재료 표참조).
  2. 동물 조직 으로부터 분리 된 미토 콘 드리 아 (쥐 심장, 근육, 간; 쥐 심장) 또는 표준 프로토콜을 사용하 여 (인간 섬유 아 세포),25 는 SCs의 추출을 위해 사용 될 수 있다. 미토 콘 드리 아가 얻어진 후에는 제조사의 권장 사항에 따라 bicin전북 산 성 분석 키트를 사용 하 여 단백질 함량을 정량화 합니다. 필요에 따라이 단계에서 프로 테아 제 및 phosphatases 억제제와 격리 된 미토 콘 드리 아를 보충.
    참고: SCs는 신선한 또는 해 동 된 미토 콘 드리 아 중에서 추출할 수 있습니다. 동시에 모든 샘플에서 SCs를 추출 하 여 동일한 조건에서 동일한 솔루션 배치로 처리 되도록 하는 것이 좋습니다.
  3. 얻어진 미토 콘 드리 아 단백질 농도에 기초 하 여, 원하는 최종 digitonin/단백질 비는 표 1에 따라 필요한 스톡 digitonin 용액 및 추출 완충 액의 부피를 계산 한다. SC 추출의 경우, 미토 콘 드리 아 단백질의 10 µ g에 대 한 digitonin를 포함 하는 추출 완충 액 (표 2)의 1 µ l을 추가 한다. Digitonin/단백질 비율은 2에서 8g에 변화할 수 있습니다. Digitonin 적정은 사용 되는 각각의 새로운 샘플 유형에 대해 항상 수행 해야 합니다 (예제는 그림 2 참조).
  4. 펠 릿 미토 콘 드리 아, 16000에서 원심 분리 하 여 1.5 mL 튜브에서 4°c에서 10 분 동안 x g .
  5. 상층 액을 버리고 계산 된 부피의 digitonin를 포함 하는 얼음-저온 추출 완충 액에서 미토 콘 드리 아 펠 렛을 다시 일시 중단 한다. 튜브를 미니 튜브 회전자에 놓고 중간 회전 속도로 4°c에서 30 분 동안 배양 합니다. 샘플이 제대로 혼합 되어 있는지 확인 하십시오.
  6. 시료를 4°c에서 45 분 동안 20400 x g 에서 원심 분리 하 여 불용 화 된 조각을 제거 합니다.
  7. 얼음에 새로운 튜브에 상층 액을 전달 하 고 단백질을 정량화. 이 분 획은 호흡기 수퍼 복합체 추출 물을 나타낸다. 전기 영동을 같은 날에 수행 하지 않으면-80 ° c에서 샘플을 저장 합니다.
    참고: 1) 추출 물의 동결/해 동 주기를 피하십시오, 이것은 SCs의 더 높은 분자 배열을 방해 하기 때문에 제 1 동결/해 동 주기 전에 샘플 필요. 2) 표준 BN 페이지 실험을 수행 하려면이 단계에서 SCs 추출 물에 CB를 추가 해야 합니다. CB는 사용 되는 세제의 양을 기준으로 1g/8g 비율로 첨가 해야 합니다.

2. 그라데이션 젤 주조 및 전기 영동

  1. 그라데이션 젤, 분 취 제를 만들기 위한 3 배의 그라데이션 버퍼 및 아크릴 아 미드 스톡을 준비 하 고-20°c에서 보관 하십시오 ( 표 3참조).
  2. 양극 및 음극 버퍼를 준비 하 고 4°c에서 유지 합니다 ( 표 5참조).
  3. 캐스팅 챔버를 열고 챔버에 외부 유리판 (20cm x 22cm)을 놓습니다. 정렬 카드를 사용 하 여 스페이서의 한 세트 (1.5 mm)를 배치 하 여 챔버의 측면과 모서리에 단단히 고정 되도록 합니다. 내부 유리 접시 (20cm x 20cm)를 스페이서의 상단에 올려 놓고 (이것은 젤 샌드위치를 형성 합니다), 유리판 위에 플라스틱 분리 시트를 넣는다.
  4. 원하는 수의 젤이 도달할 때까지 2.3 단계를 반복 합니다. 이 프로토콜의 경우 4 개의 젤이 주조 됩니다. 우리가 사용 하는 주조 챔버 시스템 ( 재료 표참조)은 한 번에 최대 10 개의 젤을 주조 할 수 있습니다. 필요에 따라 먼저 많은 아크릴 블록을 추가 하 여 챔버의 나머지 공간을 차지 하 고, 필요한 경우 유리 접시.
    참고: 몽타주는 단단히 봉인 해야 합니다. 챔버의 젤 샌드위치 사이에는 공백이 없어야 합니다.
  5. 개스킷 노치에 단단히 가스 켓을 장착 하기 전에 홈에 파라 필름의 스트립을 놓습니다. 실링 플레이트를 챔버에 놓고 나사 6 개를 모두 조입니다. 캐스팅 챔버를 서 있습니다.
  6. "빛" 혼합 챔버에 자석 교 반기가 있는 교 반 판에 그래디언트 전자를 배치 하십시오. 그라데이션 전자에 주조 챔버의 튜브를 연결 하 고, 연동 펌프의 카세트에 튜브를 고정 하 고, 그라데이션 전자의 모양이 닫혀 있는지 확인 합니다.
  7. 4 개의 젤을 시 전할 때, 60 mL의 4%와 60 mL의 12% 젤 용액을 준비 합니다 ( 표 4참조) 삼각 플라스 크에 넣고 완전히 소용돌이 어 서 섞어 줍니다. "빛" 혼합 챔버에 4% 젤 용액 60 mL를 붓고 그라데이션 전자의 "무거운" 저수지 챔버에서 12%의 60 mL를 부 어 줍니다. 350 rpm에서 교 반 판의 교 반 속도를 설정 합니다. 스톱 콕을 열고 35 rpm에서 펌프를 켜십시오.
  8. 일단 광 분 율이 중량 분 율 보다 낮으면 펌프를 일시 중지 하 고 "빛"과 "무거운" 저장소 사이에 밸브 스템을 열고 분 획 량 평형을 하 게 하 고 펌프를 다시 시작 하십시오.
    참고: 거품이 시스템을 입력 하 고 유리 접시 사이에 갇혀 얻을 하는 것이 중요 합니다. 이 경우, 몽타주를 실행 취소, 씻고 다시 실행.
  9. 일단 그라데이션 젤을 완전히 붓고, 펌프를 중지 하 고 젤의 건조를 방지 하기 위해 각 젤 샌드위치에 물 (약 1 mL)을 오버레이. 2 시간 동안 중 합 하자.
  10. 에 르 렌 마이어에서 25 mL 스태킹 젤을 준비 하 고 완전히 섞어 줍니다. 물을 제거 하 고 각 젤 샌드위치에 15 우물 빗을 삽입 합니다. 스태킹 젤을 붓고 2 시간 동안 중 합 하자.
    참고: 젤은 1 주일 동안 4°c에서 주조 및 보관할 수 있습니다.
  11. 샌드위치 클램프에 젤을 넣고 빗을 제거 합니다. 짧은 유리판이 아래로 향하게 하 여 냉각 코어에 젤 샌드위치를 넣습니다. 반대쪽을 반복 하 고, 전기 영동 탱크에 코어를 놓습니다.
  12. 전기 영동 탱크의 내부 챔버에 청색 음극 완충 액 300 mL를 붓 습니다. 전기 영동 탱크의 외부 챔버에 양극 버퍼의 2l를 붓는 다.
    참고: 전극은 음극 완충 액에 잠겨 있어야 하며이는 약 300 mL가 필요 합니다.
  13. 웰 당 75 μ g과 단백질 175 μ g 사이의 부하. 차가운 방 (4°c)에서 1.5 시간 동안 또는 샘플이 모두 그라데이션 젤에 들어갈 때까지 150 V에서 젤을 실행 하십시오.
    참고 1:1) 젤 내 활성 밴드의 양호한 분해능을 위해 웰 당 최소 75 μ g가 필요 합니다. 단백질의 175 μ g 이상을 적재 하면 과도 한 효소 활성으로 인 한 명확한 밴드가 손실 될 수 있습니다. 2) 샘플의 복제는 OXPHOS 복합체의 젤 내 활동과 면역 분석의 병렬 측정을 가능 하 게 하기 위해 별도의 웰에 적재 되어야 합니다. CI, CII, 문명 및 CV에 대 한 IGA의 병렬 결정에는 최소 300 µ g이 필요 합니다. CI, CII, CII, 문명 및 CV의 병렬 면역 분석 분석이 최소 375 µ g이 필요 합니다.
  14. Pipet 또는 진공을 사용 하 여 파란색 음극 버퍼를 제거 하 고, 300 mL Coomassie 무 블루 캐 소드 버퍼로 교체 하 고, 콜드 룸 (4°c)에서 하룻밤 동안 200 V에서 젤을 실행 합니다. 젤 내 활성 측정 또는 면역 조절에 대해 3 단계 또는 4 단계로 진행 합니다.

3. 복합체 I, II, IV 및 CV에 대 한 젤 내 활동

  1. 전기 영동이 끝나기 전에 표 6에 따라 젤 내 활동 버퍼를 준비 하 고 RT에서 어둠 속에 보관 하십시오. 3 개의 샘플 레인에 대해 젤 내 활성 완충 액 20 mL이 충분 합니다.
    참고:이 CV-겔 활성 분석은 ATPsynthase의 역 활성을 기반으로 하며 (즉, ATP 가수분해) 겔에서 침전 되는 보조 인자로 칼슘을 사용 합니다. 칼슘은 다른 프로토콜에서 사용 되는 납 보다 덜 유해 하다. 더욱이,이 프로토콜의 사용은 겔 (23)의 사전 활성화/컨디셔닝을 필요로 하지 않는다.
  2. 전기 영동을 멈추고 젤을 회수 하십시오. 필요한 경우 차선을 자르고 비닐 봉지에 젤 레인을 옮겨 (3 개의 면이 자르고 비닐 봉지를 책 처럼 열었습니다). 열 실러와 함께 3 면의 2를 밀봉.
    참고: 실험 그룹 간에 SC 밴드의 구성을 비교 하려면 동일한 젤에서 동일한 샘플을 복제에 실행 하는 것이 좋습니다. 각각 다른 젤 내 활동 버퍼 (CI, IV, V)에서 복제를 배양 하는 차선을 절단 합니다. 분석 법의 특이성을 확인 하기 위해, 추가의 복제는 특정 호흡기 사슬 억제제의 존재 하에 젤 활동에서 실행 되도록 준비 될 수 있다.
  3. 3 개의 실험 시료 (예: 3 웰)의 경우 20 mL의 젤 내 활동 완충 액을 넣고 거품을 제거 하 고 비닐 봉지의 4번째 면을 밀봉 합니다.
    참고: 수행 되는 경우 네거티브 컨트롤 실험에 억제제를 추가 하십시오: 1 µ M; CII: 나트륨 말론 10 mM; CIII: Antimycin 8 µ M; 문명: KCN 0.6 mM; CV: Oligomycin 0.5 µ
  4. 어둠 속에서 37 ° c에서 젤 레인을 배양 하 고 15 분 마다 확인 하십시오. 배양 시간은 단백질과 복합체의 양에 따라 달라진 다. CI는 문명 또는 CV 보다 더 빠르게 반응할 것입니다. 최적의 염색은 보통 CI의 경우 2 시간, 문명에는 4 시간, CII 및 CV의 경우 6 시간 후에 발생 합니다.
  5. 반응 정지를 위해 물에 젤 레인을 헹 구 고 CV에 대 한 CI, CII, 문명 또는 검은색 배경의 흰색 배경에 이미지를 바르 십시오.
    참고: 젤은 몇 개월 동안 RT 또는 4°c에서 비닐 봉지에 보관할 수 있습니다.

4. 면역 세포

  1. 표 7에 따라 전송 버퍼를 준비 하 고, RT. Tbst를 준비 하 고 rt에 보관 하십시오.
  2. 전체 젤 또는 선택한 레인을 컨테이너에 배치 하 고 SDS (0.25% 최종 전송 버퍼)로 보충 된 전송 버퍼를 추가 합니다. 로커에 용기를 놓고 1 시간 동안 배양 하십시오.
  3. 절단 PVDF 멤브레인 (겔의 크기에 상응 하는 크기)을 2 분 동안 교 반 하에 20 ml의 메탄올로 교체 하 고 2 분간 교 반 하에서 20 mL의 이동 완충 액으로 대체 한다.
  4. 아래쪽에서 위쪽으로 전송 샌드위치를 준비 하 고 젤과 활성화 된 PVDF 멤브레인 사이에 거품이 없는지 확인 하십시오. 카세트/블랙 스폰지/종이/멤브레인/젤/종이/검은 색 스폰지/카세트의 투명 한 쪽. 카세트를 닫고 잠급니다.
  5. 전송 탱크에 배치 샌드위치를, 전극의 적색 면에 직면 샌드위치의 명확한 측면, 그리고 겔을 immerge 전송 버퍼를 붓는 다. 냉각 시스템을 이송 탱크에 연결 하 고 4°c에서 설정 합니다. 전원 공급 장치에 연결 하 고 40 mA로 설정 하 고 24 시간 동안 실행 합니다.
  6. 멤브레인을 검색 하 고, TBST에서 5% BSA에서 1 시간 동안 차단 하 고, 4°c에서 하룻밤 동안 TBST에서 5% BSA로 제조 된 일차 항 체 용액을 배양 하였다.
    참고: 사용 된 항 체에 대해서는 표 8 을 참조 하십시오.
  7. 각각 10 분간 TBST 3x에서 멤브레인을 헹 굽 니다.
  8. 상 온에서 2 시간 동안 TBST에서 5% BSA에서 제조 된 이차 항 체 용액에서 배양 된 멤브레인.
  9. 각각 10 분간 TBST 3x에서 멤브레인을 헹 굽 니다.
  10. 멤브레인 및 이미지에 화학 발광 솔루션을 추가 합니다.

5. 분석

  1. 인 겔 활성 분석 이미지 또는 면역 세포는 SCs 분석에 사용 될 수 있다. 밴드의 구성을 분석 하기 위해, 정렬 복제 및 각 주어진 밴드에 대해 긍정적으로 반응 하는 복합체를 확인 합니다.
  2. 복합체의 분포를 분석 하기 위해, 다양 한 초 분자 어셈블리에서, ImageJ에서 이미지를 열고 젤 분석 도구를 사용 합니다 (예를 들어 그림 5 참조).
    1. 직사각형 도구를 사용 하 여 차선을 선택 하 고 차선을 플롯 합니다.
    2. 선을 그려 각 관심 밴드의 곡선 아래 영역을 닫고 선택 도구를 사용 하 여 각 영역을 클릭 하 여 곡선 값 아래의 영역을 포함 하는 테이블을 생성 합니다.
    3. 복합체의 분포를 계산 하기 위해, 단량체에 대 한 각 밴드에 대 한 값을 보고 한다.

결과

도 2 는 SCs의 추출에 필요한 적절 한 digitonin 양을 식별 하는 것을 목적으로 하는 digitonin 적정 실험의 결과를 보여준다. 이 양은 조직/세포 유형 및 샘플이 동결 되었는지 여부에 따라 달라질 것 이다. 이 실험을 위해, CIV-겔 활성은 신선한 마우스 간 미토 콘 드리 아 로부터 분리 된 SCs를 가시화 하기 위해 수행 되었다. 2/1에서 10/1 그램의 digitonin 단백질의 비율을 검사 하였다. 이 샘플에 대 한 최적의 digitonin 양은 단량체 성 CIV 및 고 분자량 SCs의 양호한 분해능을 제공 하므로 4g/g입니다. 낮은 비율에서, 밴드는 명확 하 고 전기 영동 하는 동안 얼룩으로 해결 하는 반면, digitonin의 높은 비율의 사용은 고 분자량 SC의 중단으로 이끌어 냅니다.

도 3 과 도 4 는 4g digitonin/g 단백질로 추출한 마우스 간 미토 콘 드리 아의 제조에 수행한 완전 한 실험의 결과를 보여준다. 단백질은 하이브리드 BN/CN 페이지, 표준 BN 페이지 또는 CN 페이지를 사용 하 여 분리 하였다. 세 개의 젤이 모두 동시에 주조 되었고, 동일한 샘플에 대 한 복제로 차선이 로드 되었습니다. 전기 영동을 거쳐 그림 3의 ci, CII, 문명 및 cv와 같은 젤 활동 측정에 개별 차선을 절단 하 고 처리 하였으며, 그림 4에는 ci, CII, CII, 문명 cv 등의 면역이 있습니다.

캐 소드 버퍼 (하이브리드 CN/BN 페이지) 또는 전기 영동을 통해 샘플 및 음극 완충 액에 순간적으로 CB를 추가 하는 것은 SC 대역의 이동성 및 분해능을 크게 향상 시키며 개별 호흡기 복합체 페이지를 참조 하십시오 (그림 3). 밴드는 CIV에 대 한 젤 내 활동 후 하이브리드 기법 또는 BN 페이지와 쉽게 구별할 수 있지만, CN 페이지에서 해결 한 동일한 샘플에서는 SCs 및 단량체 성 CIV 반응성 밴드를 식별할 수 없습니다.

도 3 및 도 4 는 oxphos 단량체 및 초 분자 어셈블리의 해상도 및 밴딩 패턴이 하이브리드 CN/BN 페이지 및 bn 페이지 사이에서 질적으로 필적 함을 보여준다. 그러나 주목할 만한 차이점이 존재 합니다. 첫째, OXPHOS 복합체의 전기 영동 이동성은 CB의 감소로 인해 하이브리드 CN/BN 페이지 조건 대 표준 BN 페이지를 사용 하 여 단백질을 분리할 때 약간 감소 합니다. 이러한 이동성 변화는 문명 단량체, CV 단량체 및 CI에 대해 더 크다 (도 3 및 도 4). 둘째, 파란색 배경은 BN 페이지 (그림 3, 왼쪽 차선)와 비교 하 여 하이브리드 CN/bn 페이지에서 더 낮습니다. 그 결과, BN 페이지 다음의 높은 배경 레벨은 CII에 대 한 인 겔 활성 염색을 완전히 마스크 하 고, CIV이 머의 활동과 관련 된 배경 잡음을 향상 시킨다 (도 3). 셋째, cv의 활성은 CV 촉매 활성을 방해 하는 것으로 알려져 있는 CB의 감소 된 양으로 인해 샘플이 BN 페이지 (그림 3)에 비해 하이브리드 CN/bn 페이지 조건에서 실행 될 때 더 높다. 26 CN/BN 페이지 또한 cv 다이 머와 관련 되는 총 cv 활성의 더 큰 비율로 도시 된 바와 같이 cv 초 분 자체 어셈블리의 더 나은 보존을 허용 한다 (도 3). 또한, CV 올리고 머는 BN 페이지 조건에서 완전히 해리 되는 반면 CN/BN 페이지에서 볼 있습니다. 흥미롭게도, cv 활성을 표시 하는 별개의 밴드는 샘플이 CN/BN-페이지에서 실행 될 때 CV 단량체와 디 머 사이 에서도 관찰 됩니다 (그림 2).

도 5 는 초 분자 어셈블리에서의 oxphos 복합체 분포의 대표적인 분석을 보여준다. 이 이미지는 4 가지 건강 한 마우스 간 미토 콘 드리 아 제제 로부터 얻어진 샘플의 겔 활성에 CI를 보여준다. 치밀도 분석은 CI 반응성 밴드의 곡선 하에서 면적을 측정 하 고 단량체 성의 C1 활성과 초 분 자체의 상대 분포를 제시 하는 것을 가능 하 게 한다 (1 iii,나는iii 2 IV 1III2IVn). 유사한 분석은 면역 세포 후에 수행 될 수 있다.

단백질 정제 공정; CN/BN-PAGE 다이어그램; 원심분리, 완충액 재현탁, 전기영동.
그림 1: 분석 워크플로 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

단백질 분리 젤, 다양한 디지토닌 비율, 전기영동 결과, 단백질 복합체 분석.
그림 2: 신선한 쥐 간 미토 콘 드리 아에서 슈퍼 복합체를 추출 하는 Digitonin 적정. 이 예는 호흡기 슈퍼 복합체를 추출 하는 digitonin의 증가 금액으로 치료 된 한 동물에서 고립 된 마우스 간 미토 콘 드리 아의 알리 쿼 츠를 보여줍니다. 그런 다음 하이브리드 CN/BN 페이지에 의해 샘플을 해결 하 고, CIV의 젤 내 활동을 결정 하였다. 문명1: 복합 IV 단량체; 문명2: 복합 IV 디 머; SC: 슈퍼 콤플렉스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

하이브리드 및 BN-PAGE 겔 전기영동, 단백질 복합체 분석, 효소 활성 검출, 다이어그램.
도 3: 하이브리드 cn/bn 페이지, bn 페이지 또는 cn 페이지에 따라 OXPHOS 복합체의 젤 내 활동. 한 마우스 로부터 분리 된 간 미토 콘 드리 아는 호흡기 슈퍼 복합체를 추출 하기 위해 digitonin (4g/g 비 digotonin/단백질)로 처리 하였다. 이 샘플의 각은 다음 세 개의 별개의 젤에 여러 우물에 로드 하 고 CN/BN 페이지, BN 페이지 또는 CN 페이지에 제출 했다. 각 겔 내의 각각의 복제 차선은 이어서 절단 되 고 즉시 겔 활성 분석 (CI, CII, CIV 및 CV로 표지 됨)을 위해 사용 되었다. 한 레인은 Coomassie 파란색으로 배경 (레이블이 붙은 BG) 염색을 표시 하는 컨트롤로 사용 되었습니다. OXPHOS 복합체 및 초 분 자체는 표준 명명법을 사용 하 여 식별 되며, 각각의 OXPHOS 복합체의 분자 화학 량 론을 나타내는 지 수와 함께 표시 됩니다. Ciii에 대 한 인 겔 활성이 특정 실험에서 수행 되지 않았기 때문에 CIII 함유 초 분자 어셈블리의 위치는 면역 검출에 기초한 다는 점에 유의 해야 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

하이브리드 CN/BN-PAGE 면역블롯 다이어그램, 단백질 복합체 분석, CI-VI 경로, 전기영동 결과.
도 4: 하이브리드 CN/bn 페이지 또는 bn 페이지에 따라 OXPHOS 복합체의 면역 세포 분석. 도 3 에 기재 된 실험 으로부터 복제 된 범례는 단일 멤브레인 상에 서 전기 전사 되었다. 트랜스퍼 후에, 개별 차선을 절단 하 고 CI, CII, CII, 문명 및 CV를 인식 하는 특정 항 체와 함께 인큐베이션 하였다. OXPHOS 복합체 및 초 분 자체 어셈블리는 표준 명명법을 사용 하 여 식별 되며, 숫자를 나타내는 인덱스는 각 OXPHOS 복합체의 분자 화학 량 론이 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

CI 활성 분석의 막대 차트와 함께 단백질 복합체 형성을 보여주는 전기영동 다이어그램.
도 5: 단량체 성 및 초 분자 어셈블리에서의 CI 분포의 정량화. (A)-4 마리의 마우스 로부터 얻어진 간 미토 콘 드리 아 SC 추출 물의 하이브리드 CN/BN 페이지에 따라 결정 된 CI-겔 활성. (B) ci 단량체에 대응 하는 뚜렷한 피크를 나타내는 imagej의 겔 분석 도구를 사용 하 여 얻어진 치밀도 (i 1) 및 다양 한 ci 함유 초분자 복합체(i 1iii,나는 제 2 IV 1 나는 III2IVn). (C) C1 활성의 상대적인 분포의 정량화. 데이터는 4 마리의 생쥐의 평균과 SEM을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Digitonin/단백질 비율 (g/g)2 g/g4 g/g6 g/g8 g/g
추출 완충 액 (µ L)의 부피400300200100
10% 재고 digitonin (µ L)100200300400
총 추출 버퍼 체적 (µ L)500500500500

표 1: 다양 한 digitonin/단백질 비율을 사용 하 여 5 mg의 미토 콘 드리 아 단백질 로부터 SCs를 추출 하는 데 필요한 부피.

화합물최종 농도
EDTA, pH 7.51Mm
헤 페 스30mm
칼륨 아세테이트150 mM
글리세롤12
6-아미노 카프로 산2Mm

표 2: SC 추출 완충 액 (최종 농도). 최대 3 개월 동안 4°c에서 보관 하십시오.

화합물최종 농도
3X 젤 버퍼: -20°c, pH 7.5에서 유지
이미 다 졸/HCl pH-7.075 mM
6-아미노 카프로 산1.5 M
아크릴 아 미드 버퍼: -20°c에서 유지
아크릴 아 미드99.5%
비스 아크릴 아 미드3

표 3: 젤 스톡 버퍼.

2 젤:4% 6012% 60스태킹 (4%) (25ml)
3X 젤 버퍼19.8 mL19.8 mL8.25 mL
아크릴 아 미드 완충 액4.8 mL14.4 mL2 mL
H2o35 mL13.1 mL14.6 mL
글리세롤-12 mL-
AP 10%360 μ l60 μ l150 μ l
TEMED24 μ l12 μ l10 μ l

표 4:4%-12% 그라데이션 젤

화합물최종 농도
양극 버퍼: 4°c, pH 7.5에서 유지
이미 다 졸25mm
음극 완충 액: 4°c, pH 7.5에서 유지
순도50 mM
이미 다 졸7.5 mM
Coomassie 블루 (G250) 유무0.022%

표 5: 전기 영동 완충 액.

화합물최종 농도
복합 I 활동 버퍼: 5mm에서 신선 하 게 준비 합니다. 트리 스-HCl pH 7.4
Nitrotetrazolium 블루3mm
NADH14 mM
복합체 II 활동 완충 액: 5mm에서 신선 하 게 준비 합니다. 트리 스-HCl pH 7.4
숙 시 네이트20mm
PMSF0.2 mM
Nitrotetrazolium 블루3mm
복합 IV 활성 완충 제: 50 mM Na 인산 염 pH 7.2에서 신선한 준비
시 토 크롬 C0.05 mM
산물이2.3 mM
ATPsynthase 활동 완충 액: 물에서 신선 하 게 준비 하 고, 코로 pH를 8로 조정 합니다.
글리신50 mM
MgCl2 5Mm
헤 페 스50 mM
CaCl2 30mm
Atp5Mm

표 6: 겔 내 활성 분석 버퍼.

화합물최종 농도
전송 버퍼
트리 트리 베이스25mm
글리신192 mM
Sds4
메탄올20
Tbst
트리 트리 베이스20mm
Nacl137 mM
트윈 200.1%

표 7: 면역 조절 버퍼.

복잡Subunit복제
나NDUFA920C11B11B11
IiSDHA2E3GC12FB2AE2
IiiUQCRC213G12AF12BB11
IvCOX41D6E1A8
VATPB3D5

표 8: 호흡기 사슬 SC를 검출 하기 위해 면역 세포를 사용 하는 항 체. 회사 및 로트 번호에 대 한 자료 표 를 참조 하십시오.

토론

미토 콘 드리 아 슈퍼 복합체는 그들의 생리 적 역할을 명료 하 게 연구 하 고 있으며, 수많은 인간 질병의 발병 기 전에 서 그들의 중요성, 또는 유전 적 미토 콘 드리 아 질환의 획득 여부는3,7 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해서는 몇 가지 측면을 고려해 야 합니다. 이 프로토콜은 마우스 간 미토 콘 드리 아로 테스트 되었습니다, 마우스 골격 근육 미토 콘 드리 아 (결과 표시 되지 않음), 쥐 심장 미토 콘 드리 아 및 인간 섬유 아 세포 미토 콘 드리 아 (결과 표시 되지 않음), 하지만 확실히 고립의 다른 소스에 적응 될 수 있다 미토 콘 드리 아. 이 방법은 BN 및 CN 페이지 프로토콜의 다양 한 측면을 최적으로 결합 하 여 출판 된 프로토콜20,27,28에 비해 세제 및 음이온 성 화합물에 대 한 노출을 최소로 줄일 수 있습니다.

시료 전처리

샘플 준비는 SCs의 성공적인 분리를 위한 중요 한 단계를 나타냅니다. 완충 조성 물은 단백질 및 단백질 어셈블리의 적절 한 가용 화를 달성 하기 위해 신중 하 게 선택 되어야 하며, 가능한 한 많은 기능을 유지 하면서 및 구조적 무결성. 추출 완충 액의 이온 강도와 pH는 고려해 야 할 두 가지 중요 한 요소 이다. 너무 낮은 염 농도 (< 50 m K 아세테이트 또는 염화 나트륨)는 비 이온 성 세제의 존재 하에 단백질의 낮은 가용 화를 초래할 것이 고, 500 mM 이상의 염 농도는 단백질 적 층/응집을 촉진 하 고 CB의 침전 및 단백질29. 따라서 SCs는 거의 생리 적 이온 강도에서 완충 액을 사용 하 여 추출 되어야 합니다. PH에 관해서는, 가까운 생리 적 pH의 사용을 권장 합니다.

최적의 SC 추출을 위해서는 세제 유형 및 세제/단백질 비율이 중요 합니다. 기본 SCs의 최대 보존을 위해, digitonin가 바람직하다26. 본 프로토콜 및 기타 공개 된 방법에 도시 된바와 같이,도31,32,이 중성 세제는 다 수의 SC 어셈블리의 초 분자 조성 물을 보존 하 고,이 성체 및 올리고 머 구조 ATPsynthase (도 3 및 도 4). 효소 활동과 생리 적 단백질 상호 작용을 보존 하면서 최적의 가용 화를 가능 하 게 하는 조건을 확인 하기 위해서는 다양 한 양의 digitonin 관심 샘플을 적정 하는 것이 중요 합니다. 적정은 2~8g/g26사이의 비율로 수행 해야 합니다. 간, 골격 근 및 심장 미토 콘 드리 아에 대 한 최적의 결과는 각각 4, 5 및 6g digitonin/g 단백질로 얻어진 다. Digitonin는 트리톤 X-100으로 대체 될 수 있으며, 최적의 조건에서 digitonin2에서 관찰 되는 것과 유사한 마이그레이션 및 SC 구성을 초래 한다는 점에 유의 해야 합니다. 그러나이 세제는 세제/단백질 비율이 상대적으로 약간 증가 하기 때문에 (예: 1 ~ 1.5/g) SCs 어셈블리2의 완전 한 해리를 초래할 수 있으므로 주의 해 서 사용 해야 합니다 .이는 실험적 불일치를 초래할 수 있습니다. 추출 후 샘플은 전통적 CN (20페이지)을 제외 하 고 젤에 적용 될 때 단백질을 충전 하기 위해 coomassie 청색으로 일반적으로 보충 됩니다. Coomassie 청색 및 불안정 한 단백질의 잠재적인 해리에 대 한 단백질 노출을 최소화 하기 위해, 샘플은이 프로토콜에서 Coomassie 청색으로 보충 되지 않습니다.

전기

모두 CN 페이지 및 십억-페이지는 미토 콘 드리 아 OXPHOS 복합체를 연구 하는 데 사용 되었습니다., 그들 각각의 뚜렷한 장점과 한계를가지고. CN-페이지 (주로 세제와 같은 효과를 가진 CB의 부재)에서 사용 되는 온화한 조건은 ATP 신 타제 in 젤 활성을 더 잘 보존 할 수 있으며 고 분자량 SCs 및 ATP에서 불안정 한 단백질의 해리를 제한 합니다 신 타제 어셈블리26. 그러나, 단백질 추출 물 및 전기 영동 완충 액에서 음이온 성 염료 CB의 부재는 단백질이 젤 (26) 내의 단백질의 전기 영동 이동성을 감소 시키는 그들의 본질적인 전 하 및 등전기 점을 기준으로 이동 하는 원인이 된다. 또한, CB가 없는 경우, 불충분 한 음 전 하를 갖는 단백질은 응집 하는 경향이 있으므로, 겔 (20)에서 단백질 복합체의 분해능이 감소 한다 (26). 이러한 한계를 회피 하기 위해, 소위 고 분해능 CN-페이지는 Wittig 및 Schragger20에 의해 개발 되었다. 이 프로토콜에서 나트륨 deoxycholate (DOC) 및 다양 한 온화한 비 이온 성 세제 (DDM, 트리톤 X100)가 음극 완충 액에 첨가 되어 멤브레인 단백질의 가용 화를 유지 하 고 단백질에 음의 전 하 시프트를 부과 하 여 상당한 개선을 초래 합니다. 해상도20.

본 하이브리드 CN/BN 프로토콜의 특징은 이러한 세제 없이 비교 가능한 분해능에 도달할 수 있다는 것입니다. 전기 영동의 시작에서 캐 소드 버퍼에 CB를 순간적으로 첨가 하는 것은 단백질 응집을 제한 하 고 겔에서 이동성을 향상 시키기에 충분 하다 (도 3 및 도 4). 결과적으로,이 하이브리드 기술은 별개의 SC 어셈블리의 탁월한 분해능을 가능 하 게 하며 세제에 대 한 노출이 매우 낮습니다. 낮은 양의 CB의 존재는 또한 CV 활성의 향상 된 보존,이 성체 및 올리고 머 CV 어셈블리의 개선 된 보존 (그림 3 과 Wittig 및 Schägger 200526)을 허용 하 고 파란색 배경 노이즈의 감소 특히 CII와 문명에 대 한 젤 활동의 정량화를 방해 합니다 (그림 2). 더욱이, 단백질 추출 물에서 CB의 부재는 SCs 내에서 불안정 한 단백질 상호 작용의 중단을 제한 합니다. 예를 들어, synthasome 33 를 형성 하는 ANT와 함께 ATP 신 타제의 물리적 협회 또는 PTP 개방 34 을 조절 하는 사이클로 필 인-D는 CB의 부재에서 더 잘 볼 수 있습니다. 전기 영동 중에 CB에 순간적으로 노출 되는 것은 따라서 SCs 내에서 새로운 단백질 상호 작용을 공개 하는 데 유용할 수 있습니다. 전반적으로,이 하이브리드 CN/BN 페이지 프로토콜은 분석을 통해 젤 활동 측정에서 정밀 하 고 빠른 결합을 가능 하 게 합니다. SCs의 고급 분석을 위한 2D 전기 영동, 면역 검출 및/또는 프로 테오 믹스를 포함 하는 기술. SCs에 대 한 관심이 증가 하면서 연구 횟수가 증가 하면 네이티브 페이지를 위한 작은 10 x 10cm 젤이 사용 된다는 점에 유의 해야 합니다. 이 접근법은 풍부한 SC 어셈블리에서의 총 변화를 식별 하기에 충분할 수 있지만, 작은 겔의 낮은 분리 용량은 미묘한 재배열을 해결 하거나 단백질 분해 분석을 위해 별개의 밴드를 절단 하는 것으로 제한 될 가능성이 있습니다. 더욱이, 더 작은 젤을 사용 하는 몇몇 연구 결과는 respirasome가 ATPsynthase이 량 체와 같은 크기로 이주 한다는 것을 보고 하 고, 그들22를 해리 하기 어렵게 합니다. 따라서 큰 젤의 사용을 선호 해야 합니다.

감사의 글

저자는 기술 지원을 위해 제 나로 시에 게 감사 하 고,이 방법을 개발 하는 동안 도움이 되는 토론을 위해 미르 일 크 파초 박사와 데이비드 패튼 박사를 부탁 드립니다. 이 작품은 캐나다 건강 연구 기관 (CIHR) 및 국가 과학 및 공학 위원회 (NSERC)에 의해 자금을 지원 했다. AC는 프레드릭 반 팅과 찰스 베스트 캐나다 대학원 장학금 (CIHR)의 박사 학위를 받은 사람입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
3,3'-디아미노벤지딘 테트라-하이드로클로라이드 하이드레이트SigmaD5637
6-아미노 카프로산,시그마A2504
아크릴아미드SigmaA3553
아데노신 5'-트리포스페이트 디소듐 염 하이드레이트시그마A3377
Anti-ATPB 항체 [3D5] - 미토콘드리아 마커Abcamab14730로트 번호 GR3174539-12, RRID AB_301438
Anti-SDHA 항체 [2E3GC12FB2AE2]Abcamab14715로트 번호 GR3235943-1, RRID AB_301433
Anti-UQCRC2 항체 [13G12AF12BB11]Abcamab14745로트 번호 GR304308-3, RRID AB_2213640
Bis N,N'-Methylene-Bis-AcrylamideBiorad1610201
Brilliant Blue GSigma27815
COX4 Monoclonal 항체 (1D6E1A8)Invitrogen459600로트 번호 TI2637158, RRID AB_2532240
Cytochrome c from equine heartsigma C7752
DigitoninSigmaD141
Fisherbrand FH100M Multichannel 연동 펌프Thermo Fisher13-310-660
ImidazoleSigmaI0250
내부 유리판. 2, 20 x 20cm 패키지, 20cm PROTEAN II xi 및 PROTEAN II XL 전기영동 셀용 유리판, 외부 플레이트Biorad1651823
Model 485 Gradient Former와 함께 사용.40-175ml 아크릴아미드 그래디언트 포머, 밸브 스템 및 튜빙 키트 포함, Mini-PROTEAN 멀티 캐스팅 챔버 시스템Biorad1654120
NDUFA9 단클론 항체 (20C11B11B11)Invitrogen459100로트 번호 TD2536591, RRID AB_2532223
니트로테트라졸륨 블루 클로라이드시그마N6639
외부 유리판. 2개 패키지, 22.3 x 20cm, 20cm PROTEAN II xi 및 PROTEAN II XL 전기영동 세포용 유리판, 내부 플레이트Biorad1651824
Phenylmethanesulfonyl florideSigmaP7626
Powerpack 1000Biorad일련 번호 286BR 07171
PROTEAN II 샌드위치 클램프와 함께 사용. 2개 패키지, 러닝 젤용 클램프, 20cm PROTEAN II xi 전기영동 셀, 1개의 왼쪽 및 1오른쪽 Biorad1651902
PROTEAN II xi 셀용. 대형 수직 전기영동 셀, 16 x 20cm 겔 크기, 4개의 겔 용량, 스페이서 및 빗Biorad1651811
PROTEAN II xi Comb. PROTEAN II xi 전기영동 셀Biorad1651873
PROTEAN II xi Multi-Gel Casting Chamber용 1, 15웰, 1.5mm 빗 패키지. 멀티 겔 주조 챔버, 20 x 20cm 겔 크기, 1.5mm 두께의 겔 최대 10개, 밀봉 플레이트, 개스킷, 분리 시트, 아크릴 블록, PROTEAN II XL 정렬 카드, Biorad1652025
PROTEAN II xi 스페이서 포함. 4개 패키지, 1.5mm, 20cm PROTEAN II xi 전기영동 셀용 스페이서Biorad1651849
SCIENCEWARE 유틸리티 백(10 x 12") 4mil, Bel-Art, 100VWR11215-388
두꺼운 오점지 상자. 25매 패키지, 15 x 20cm, 흡수성 여과지, 플레이트Biorad
Trans-Blot 셀과 함께 사용. Transfer cell and cooling coil (#170-3912), 젤 홀더 카세트 2개, 버퍼 탱크, 케이블이 있는 뚜껑, 섬유 패드, 블로트 페이Biorad1703939
개의 전극 및 슈퍼 냉각 코일이 있는 Trans-Blot 카세트 1703956 퍼 1팩 포함

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