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Summary

이 문서는 초파리 번데기 망막 조직의 immunohistochemistry, 서쪽 분석 및 RNA 추출에 대 한 처리에 대 한 프로토콜 함께 해 부에 대 한 수술 메서드를 제공 합니다.

Abstract

초파리 번데기 망막 개발 하는 동안 전체적 프로세스의 연구에 대 한 우수한 모델 시스템을 제공합니다. 이 종이에 선물이 섬세 한 초파리 번데기 망막의 해 부에 대 한 신뢰할 수 있는 프로토콜. 외과 접근 pupae를 열고 정확 하 게 추출 눈 두뇌 단지를 쉽게 사용할 수 서 도구를 활용 합니다. 이러한 수 고정, 들어서는 immunohistochemistry, 망막에 다음 현미경 슬라이드에 장착 되며 목표 세포 또는 subcellular 구조를 감지 하는 경우를 몇 군데. 또는, 떼어낸된 망막 뇌 조직에서 분리, 적절 한 버퍼에 lysed 고 단백질 젤 전기 이동 법 또는 mRNA 추출 (각각 단백질 또는 유전자 식 평가)에 대 한 활용. 상당한 연습과 인내심, 기정 프로토콜을 마스터 해야 할 수 있습니다 하지만 일단 마스터, 프로토콜 수 주로 손상된 망막의 상대적으로 빠른 절연 있습니다.

Introduction

초파리 망막 색소 세포 벌집 격자^1,2,,34배열에 의해 포위 하는 약 750 ommatidia 구성 됩니다. 각 ommatidium 8 포토 리셉터 신경, 4 렌즈 은닉 원추 세포, 그리고 두 가지 기본 안료 세포에 포함 되어 있습니다. 각 ommatidium를 주변 안료 생산 격자 세포와 감각 강 모 그룹 있습니다. 포스트 mitotic 자연 및 틀에 박힌 6 각형 배열, 초파리 번데기 망막 세포 접착^5,6,^{를 포함 하 여 전체적 프로세스의 연구에 대 한 우수한 모델 시스템을 제공 7,8,9,10} 및 apoptosis^{11,12,13,,1415}.

여러 게시 프로토콜 초파리 번데기^16,,1718에서 눈 뇌 단지 추출 공기 압력을 이용 한다. 프로토콜 설명 여기 대신 활용 하 서 도구를 신중 하 고 정확 하 게 격리 눈-뇌 손상된 망막 조직을 얻기의 목적으로 단지. 이것은 망막에 대 한 활용 하는 경우 중요 한 형태학, 단백질, 또는 유전자 발현 분석 때문에 망막 손상 세포 스트레스 또는 죽음, 세포 표현 형 또는 진 식을 수정할 수 발생할 수 있습니다. 또한, 연습 후, 6 ~ 10 눈 두뇌 단지 10 ~ 15 분, 나이 및 해 부 눈 조직의 발달 단계에서 가변성을 최소화의 목표를 용이 하 게 고립 될 수 있다.

고정, immunostaining, 및 아래에 설명 된 전체 마운트 프로토콜은 형광 현미경 검사 법에 대 한 초파리 눈의 준비에 적합 하다. 망막은 관심사의 단백질을 대상으로 하는 항 체와 알을 품을 수 있다. 예를 들어 외화 접합 부품에 항 체 특성 셀을 포함 하 여, 모양 및 배치 평가¹⁹될 수 있도록 셀의 꼭대기 크기를 시각화 하기 위해 활용할 수 있습니다. 고정, 이전 서쪽 분석, 단백질 또는 RNA qRT-PCR에 사용 하기 위해 또는 RNA 시퀀싱을 추출 하기 위해 뇌에서 눈 죽 습 수 대신 수 있습니다.

Protocol

1. 조직 준비 초파리 를 설정 (앞에서 설명한20) 십자가 또는 원하는 유전자 형의 번데기를 특정 초파리 긴장 문화. 되도록 많은 pupae coincidently 등장, 그 영양소 풍부한 음식 미디어 또는 표준 식품 미디어 아낌없이 효 모-붙여넣기 보충에 중복이 비행 문화를 확립. 25 ° c.에 초파리 문화 유지 십자가 UAS GAL4 시스템을 활용 하 여, GMR GAL4 애벌레 눈 디스크 세포 후부 번데기 개발21,,2223, 를 통해 전체적 밭 고 랑을 표현 하는 이상적인 드라이버입니다. 24. 이상적인 제어 크로스 UAS lacZ X GMR GAL4 역할 크로스 비 생 및 불활성 β-galactosidase 단백질의 표현을 드라이브. 6″대나무 부 목 젖어 증류수 부드럽게 백색 사전 pupae (그림 1B) 건강 한 문화 튜브 (그림 1A)의 측면에서 고 1.5 mL microcentrifuge 튜브 (그림 1C)에 배치 된 팁을 사용 합니다. 튜브 건조 (그림 1D)에서 번데기를 보호 하기 위해 충분 한 습도 챔버를 유지 하기 위해 증류수에 배어 조직의 작은 조각 함께 플라스틱 피 펫 팁 상자에 놓습니다. 해 부까지 25 ° C에서 번데기를 품 어. 건조 6″대나무 부 목 사용 하 여 부드럽게 밀어 번데기 microcentrifuge 튜브에서와 해 부 접시 블랙에. 번데기에서 해 접시에 양면 테이프의 새로운 조각을 하다. 신중 하 게 집게의 쌍을 사용 하 여, 테이프 (그림 2A)에 번데기 등 쪽 (즉, operculums 향하도록, 그림 1B)를 배치 합니다. 번데기는 테이프에 잘 고착 확인 합니다.참고: 번데기 사건에 수 분 억제 보안 접착 테이프, 어떤 경우에, 이중 면 테이프에 배치 하기 전에 건조 하 pupae 허용 것 이다. 2입니다. 눈-두뇌 단지의 해 부 집게를 사용 하 여 각 번데기 (그림 2C)의 operculum 제거. 서가 위를 사용 하 여 슬라이스 또는 각 번데기의 번데기 케이스를 자르면. 플랩 머리, 흉부, 그리고 이중 면 테이프 (그림 2C) 번데기 케이스의 가장자리를 확보 하는 앞쪽 복 부 세그먼트 공개 번데기 케이스를 엽니다.참고: 그것은 전적으로 번데기를 밝힐 필요가 아니다. 날카로운 집게, 동물, 파악 된 각 번데기의 복 부를 관통 하 고 번데기의 경우 (그림 2C)에서 그것을 제거 합니다. 검은 해 부 접시, 테이프에서에 번데기를 놓고 차가운 인산 염-버퍼링-솔루션 (PBS, pH 7.4)의 약 400 µ L로 커버 합니다. 복 각 번데기 잡고 집게와 서가 위, 반에 번데기를 절단 전체 흉부를 통해 깨끗 한 횡단면 컷 (그림 2D). PBS에서 각 시체의 후부 잔재를 제거 하 고 해 접시에 한쪽에 넣어 (할 하지, 단계 3.2.1 참조). 두 켤레 미세 집게를 사용 하 여 열고 흉부 눈 두뇌 복잡 한 (그림 2E)을 각 번데기의 머리. 이렇게 하려면 흉부 상피의 잘라 가장자리를 파악 하 고 점차적으로 흉부를 열고 캡슐, 눈-뇌 복잡 하 고 주변 지방 조직의 노출 머리를 찢 어. 조직 파악 없이 집게를 사용 하 여 머리 캡슐의 나머지에서 눈 뇌 복잡 한 가이드 또는 찢어진 오픈 헤드 캡슐에서 눈 뇌 복잡 한 특 종.참고: 눈-두뇌 복잡 한 아령 모양의 오프 화이트, 그리고 주변 크림 지방 (그림 2B, E) 보다 더 반투명입니다. 집게, 신중 하 게 대부분 지방 눈 조직을 건드리지 않고 눈 두뇌 단지와 관련 된 제거. 3. 면역 형광 검사에 대 한 조직의 처리 설명된 (2.1-2.9 단계)으로 적어도 6 10 pupae를 해 부.참고: 각 해 부의 3 ~ 4 독립적인 복제 가설 테스트를 충분 한 데이터를 얻을 경향이 있다. 세척 및 고정 p 20의 끝 또는 P100 피 펫 팁 반경 m m ~ 1 팁 열기 고 PBS와 지방 위쪽 및 아래쪽의 믹스를 pipetting으로 기름칠 깨끗 한 면도날으로 잘라. 이 지방 단계 2.6에서에서 제거 하는 시체 잔해에서 얻을 수 있습니다. 얼음 9 잘 유리 접시에 PBS의 ~ 400 µ L로 눈 두뇌 단지를 전송 합니다. 윤 활된 팁과 P20 또는 P100 공기 변위 micropipette 사용 하 여 전송.참고: 눈-두뇌 단지 것 이다 pipetting 동안 unlubricated 팁 준수 및 수 손상 또는 손실. 아래로 부드럽게 눈 두뇌 단지 소용돌이에 PBS에 pipetting 여 눈 조직와 관련 된 나머지 지방을 제거 합니다. 이에 모든 후속 세척 단계, 할 하지 직접 플라스틱 위쪽 및 아래쪽 눈 두뇌 단지가 연약한 눈 조직 손상 것입니다. 최소 볼륨에서 눈 뇌 단지 전송 (< 20 µ L) 정착 액의 적어도 250 µ L로 PBS의. 솔루션을 위아래로 pipetting으로 혼합. 35 분, 얼음에 품 어.참고: 단계 3.1.1에서에서 준비 같은 윤 활된 팁이이 전송에 대 한 사용할 수 있습니다. 동일한 피 펫 팁, PBS의 잘 포함 ~ 400 µ L로 눈 두뇌 단지 전송. 솔루션을 위아래로 pipetting으로 혼합 하 고 씻어 얼음에 5-10 분 동안 품 어. 세척 단계를 두 번 이상 반복 합니다.참고: 눈-두뇌 단지 최종 PBS 세척, 얼음, 또는 3.3.1 단계로 진행 하기 전에 4 ° C에서에서 몇 시간 동안 유지할 수 있습니다. 항 체 얼룩이 지기 차단 항 체 솔루션에 노출 이전 조직, 눈-두뇌 단지 ~ 400 µ L PBT의 전송. 윤 활된 팁과 P20 또는 P100 공기 변위 micropipette를 사용 하 여 전송. 10 ~ 60 분, 얼음에 품 어. PBT에 적절 한 항 체를 희석 하 여 1 차적인 항 체 솔루션을 준비 합니다. 눈-두뇌 단지 항 체 솔루션의 10 µ L aliquots에서 알을 품는, 준비 볼륨 10의 복제 됩니다. 72-잘 microwell 쟁반의 깨끗 한 우물에 항 체 솔루션의 aliquot 10 µ L (내용 참조). 반경에 ~0.5 m m 팁 열기 고 pipetting PBT에 의해 아래로 기름칠 깨끗 한 면도날으로 P10 피 펫 팁의 끝을 잘라. 전송의 볼륨에 더 이상 5 눈-두뇌 단지 < P10 공기 변위 micropipette 및 윤 활된 팁을 사용 하 여 항 체 솔루션의 각 10 µ L로 PBS의 3 µ L. 솔루션을 위아래로 pipetting으로 항 체 솔루션을 균질. 이 조직에 손상을 것입니다 위쪽 및 아래쪽 눈 두뇌 단지 플라스틱 하지 않습니다. 항 체 해결책의 증발을 최소화 하려면 microwell 쟁반으로 증류수에 배어 조직의 작은 조각을 놓고 (예를 들어, 함께 제공 하는 뚜껑) 트레이 인감. 4 ° c.에서 밤새 품 어 씻고 9 던 유리 접시에 PBT의 ~ 400 µ L로 눈 두뇌 단지 microwell 트레이에서 전송. P10 공기 변위 micropipette 및 PBT 윤 활 팁 (준비 단계 3.3.4에에서 설명 된 대로)를 사용 합니다. 솔루션을 위아래로 pipetting으로 혼합. 얼음에 5-10 분 동안 품 어. 세척 단계를 두 번 이상 반복 합니다. 세척 솔루션 사이 눈 두뇌 단지를 전송 하는 P20 또는 P100 공기 변위 micropipette와 PBT 윤 활 팁을 사용 합니다. 적절 한 fluorophore 태그 2 차 항 체 PBT에서 필요에 따라를 diluting 하 여 이차 항 체 솔루션을 준비 합니다. 이차 항 체 솔루션의 100 µ L 6-10 pupae의 배치 당 충분 하다. 약 수 9 던 유리 해 부 접시에 이차 항 체 솔루션. 눈-두뇌 단지 이차 항 체 솔루션에 전송 합니다. 전송에 대 한 P20 또는 P100 공기 변위 micropipette 및 PBT 윤 활 팁을 사용 합니다. 실 온에서 1-2 시간 또는 3-5 h 4 ° c.에 대 한 이차 항 체 솔루션에서 눈 뇌 단지 품 어 빛에 의해 fluorophores의 표백 방지 하기 위해 호 일 준비 커버.참고: 이차 항 체 솔루션에 외피의 최적의 기간 사용 하는 차 및 2 차 항 체에 따라 달라질 수 있습니다. 씻고 9 잘 유리 접시에 PBT의 ~ 400 µ L로 눈 두뇌 단지를 전송 합니다. 솔루션을 위아래로 pipetting으로 혼합. 얼음에 5-10 분 동안 품 어. 이 세척 단계는 두 번 이상 반복 한다. 보조 고정 보조 고정을 위한 정착 액의 적어도 200 µ L 눈 두뇌 단지 전송 하 고 실내 온도에 또는 4 ° c.에 35 분 20 분 동안 품 어참고: 보조 고정 장착 (3.5 단계) 에이즈 눈 조직 자나. 눈-두뇌 단지 5 분 동안 씻어 얼음, 9 잘 유리 접시에 PBT의 ~ 400 µ L로 전송 하는 P20 또는 P100 공기 변위 micropipette와 PBT 윤 활 팁을 사용 합니다. 세척 단계를 한 번 이상 반복 합니다. 사용은 P20 또는 P100 공기 변위 micropipette 및 PBT 윤 활 팁 ~ 400 µ L 1-2 분에 대 한 린스에 얼음, 9 잘 유리 접시에 PBS의 눈-두뇌 단지 소프트웨어인 모션 pipetting PBS에 의해 조직 하지만 조직 하지 유지 눈-두뇌 단지 정착 하 고 PBS 린스 중 유리 접시에 고착에서 방지 하기 위해 아래로. 장착 미디어를 마운트의 ~ 200 µ L로 눈 두뇌 단지를 전송 합니다. 눈-두뇌 단지 전송 하는 P20 또는 P100 공기 변위 micropipette와 PBT 윤 활 팁을 사용 합니다. 1-2 h에 대 한 미디어의 장착에 equilibrate을 조직을 수 있습니다. 깨끗 한 현미경 슬라이드에 신선한 설치 미디어의 5-8 µ L 드롭 장소. P10 팁 반경 ~0.5 m m 팁 열기를 증가 하 고이 고 P10 공기 변위 micropipette를 사용 하 여 슬라이드에 미디어를 마운트의 드롭에 미디어를 장착의 5-8 µ L에서 눈 뇌 단지 전송를 깨끗 한 면도날으로 잘라. 두 개의 텅스텐 바늘을 사용 하 여 시 돌출부에서 눈을 분리. 견고한 텅스텐 바늘으로 슬라이드에 복잡 한 눈-뇌를 고정 하 고 좋은 텅스텐 바늘 (그림 2F)의 연결된 시 엽 멀리 각 눈을 슬라이스. 좋은 텅스텐 바늘을 사용 하 여 슬라이드에 인접 한 각 눈의 기저 표면으로 현미경 슬라이드의 표면에 각 눈 기동. 부드럽게 조직을 통해 깨끗 한 커버 슬립을 낮은 및 매니큐어와 보안.참고: 그렇게 그들은 서로 가까이 또는 라인에서 슬라이드에 눈 정리 후속 현미경을 촉진할 것 이다. 형광 또는 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 망막을 이미지.참고: 슬라이드 해야 될 4 ° C에서 저장 아니라면 즉시 몇 군데 있습니다. 4. 서 부 럽 눈 조직의 준비: 10-16 pupae (단계 2.1-2.9) 다음 수정 해 부: a) 수집 및 두 개의 배치, 10-15 분 간격에 번데기를 해 부 및 b) PBS (PBS + pi) 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제와 보충에서 해 부. 눈-두뇌 단지는 p 20을 사용 하 여 전송 또는 P100 변위 micropipette 공기와 PBS + 얼음, 9 잘 유리 접시에 파이 씻어 짧게 ~ 400 µ L로 팁 (단계 3.2.1에서 준비)을 윤 활.참고:이 윤 활된 팁 4.3 및 4.4 후속 단계에 사용할 수 있습니다. 두 번 린스 단계를 반복 합니다. 모든 눈-두뇌 단지 얼음 차가운 PBS + 깨끗 한 검은 해 접시에 decanted pi ~ 400 µ L로 전송 합니다. 각 눈 (눈 뇌 복잡 한 위해) 견고한 텅스텐 바늘을 사용 하 여 광학 돌출부에서 제거 하 고 정밀한 면도날 또는 서가 위는 깨끗 하 게 잘라 각 눈 시 엽에서.참고: 눈이이 단계에서 ‘스티커’는 고 해 접시에 가볍게 준수 수 있습니다. 이것은 유리 광 엽 (내용 참조)에서 눈의 제거를 용이 하 게 도울 수 있다입니다. ‘ 청소 ‘ 모든 눈 ‘더미’에 PBS + 집게의 좋은 쌍에의 한 블레이드를 사용 하 여 해 접시에 pi. P10 팁 반경 ~0.5 m m 팁 개방을 확대 하 여 아래로 팁 내부에 의해 pipetting 서 조직 세포의 용 해 버퍼 (WTLB)에 기름칠 깨끗 한 면도날으로 잘라. 5 µ L의 PBS + pi에서 눈 뇌 단지 500 µ L microcentrifuge 튜브로 전송 합니다. 이 윤 활된 팁과 P10 공기 변위 micropipette 사용 하 여 전송 완료. 얼음에 microcentrifuge 튜브를 놓습니다. 샘플, WTLB 그리고 2 x 집중된 단백질 견본 버퍼의 10 µ L (또는 5 x 집중된 단백질 견본 버퍼의 2.5 µ L)의 1 볼륨 (5 µ L)를 추가 합니다. 두 드려서 믹스. 소용돌이 microcentrifuge 짧게 튜브 고 데스크탑 미니 원심 분리기를 사용 하 여 샘플 아래로 회전. 분석까지-20 ° C에서 샘플을 저장 합니다. 표준 프로토콜을 사용 하 여 분석 합니다. 5. 눈 조직의 RNA 추출 준비: 입고 장갑, 깨끗 한 벤치탑, 현미경, 해 부 도구, 블랙 후 RNase 오염 제거 시 약 70% 에탄올으로 처음 요리를 해 부. 건조를 허용 합니다. 30-40 번데기 단계로 설명 (2.1-2.9) 다음 수정 해 부:는) 수집 및 배치, 15-20 분;에 6 ~ 8 pupae를 해 부 b) nuclease 무료 PBS와 c 해 부) 눈의 각 일괄 처리를 별도로 분리 하지만 모든 망막 조직 같은 microcentrifuge 튜브 (단계 5.5)으로 축적.참고: 두 사람이 동시에 해 부를 데 좋은 눈 조직의 효율적인 분리를 가속화할 것 이다. 각 일괄 처리에 대 한 눈-두뇌 단지 (단계 2.1-2.9)와 얼음, 짧게, 린스를 9 잘 유리 접시에 nuclease 무료 PBS의 ~ 400 µ L로 전송 P20 또는 P100 공기 변위 micropipette 및 윤 활된 팁 (준비 단계 3.1.2에에서 설명 된 대로)를 사용 하 여 격리 합니다.참고:이 윤 활된 팁 5.4, 5.5-5.8 후속 단계에 사용할 수 있습니다. 두 번 린스 단계를 반복 합니다. 깨끗 한 검은 해 부 접시에 얼음 처럼 차가운 nuclease 무료 PBS의 신선한 400 µ L 드롭 눈 두뇌 단지 전송할. (복잡 한 눈 두뇌 위해) 견고한 텅스텐 바늘을 사용 하 여 광학 돌출부에서 각 눈을 제거 하 고 정밀한 면도날 또는 서가 위는 깨끗 하 게 잘라 각 눈 시 엽에서.참고: 눈이이 단계에서 ‘스티커’는 고 해 접시에 가볍게 준수 수 있습니다. 이것은 유리 광 엽 (내용 참조)에서 눈의 제거를 용이 하 게 도울 수 있다입니다. ‘ 청소 ‘ 모든 눈 ‘더미’로 nuclease 무료 PBS 해 접시에 집게의 좋은 쌍에의 한 블레이드를 사용 하 여에서. 살 균 RNase 무료 microcentrifuge 튜브에 눈 전송 및 액체 질소에 플래시 동결. Pupae의 각 배치의 해 부 (5.3-5.8 단계)를 반복 합니다. 액체 질소 (단계 5.5)를 축적 한 튜브에 모든 눈에서에서 유지 관리 하는 동일한 microcentrifuge 튜브에 눈의 각 일괄 처리를 전송 합니다. RNA 추출까지-80 ° C에서 샘플을 저장 합니다.

Representative Results

번데기 눈은 그 드라이브 morphogenesis 발달 과정을 조사 하는 우수한 모델 역할을 쉽게 액세스할 수 있는 조직 이다. 여기, 우리 망막 해 부는 면역 형광 꼭대기 외화 접합 (그림 3A, C) 또는 apoptosis (그림 3)25동안 활성화 되는 Dcp-1 caspase (그림 3D)를 감지 하는데. 이러한 방식을 명확 하 게 모집 등 (18 h APF)?…

Discussion

여기에 설명 된 초파리 번데기 눈 해 부 방법 10 ~ 15 분 이내 6-10 눈 두뇌 단지의 격리에 대 한 수 있습니다. 그러나, 인 내와 연습 절 개 기술을 지배 품질 및 해의 속도 향상 시키기 위해 필수적입니다. 이 짧은 해 부 시간 각 눈 약 동일한 개발 단계, 표현 형 또는 유전자 표현의 데이터 집합에서 망막에 있는 가변성을 감소를 통해. 우리의 프로토콜은 조직적으로 찢 어 또는 깎기, 눈에 손상을…

Materials

Adobe Photoshop	Adobe		Image processing software
Bamboo splints, 6" 	Ted Pella Inc	116
Beta mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Beta-glycerol phosphate	Sigma-Aldrich	50020
Black dissecting dish			Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize.
Blade holder	Fine Science Tools	10053
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets	Roche	4693132001
Confocal microscope (Zeiss LSM 501)	Carl Zeiss		or similar microscope
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC)	Sigma-Aldrich	40718
Double-sided tape	3M	665
<em>Drosophila</em> food media, nutrient-rich&nbsp;			7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O, 0.125% CaCl<sub>2</sub>.2H<sub>2</sub>0
<em>Drosophila</em> food media, standard			Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe.&nbsp; (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E6758
Fixative solution			4% formadehyde in PBS, pH 7.4.
Fluorescence microscope (TCS SP5 DM microscope)	Leica Microsystems		or similar microscope
Forceps&nbsp;	Fine Science Tools	91150-20	Forceps should be sharpened frequently.
Formaldehyde	Thermo Scientific	28908
Glass 9-well dishes&nbsp;	Corning	7220-85	Also known as 9-well dishes&nbsp;
Glass coverslips (22 x 22 mm)	Fisher Scientific	12-542-B
Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm)	Fisher Scientific	12-550-413
Glass petri dish	Corning	3160-100BO
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Image Studio software version 5.2.5	LI-COR Biosciences		Image processing software for quantitation of Western blots.
Laemmli sample buffer	Bio-Rad	161-0737	2X concentrated protein sample buffer, supplement with beta mercaptoethanol as per manufacturer's instructions.
Lane marker reducing sample buffer&nbsp;	ThermoFisher Scientific	39000	5X concentrated protein sample buffer.
Microcentrigure tubes&nbsp;	Axygen	MCT-175-C
Microdissection scissors&nbsp;	Fine Science Tools	15000-03
Microwell trays (72 x 10 &micro;L wells)	Nunc	438733
Mounting media			0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS
N-propylgallate	Sigma-Aldrich	P3130
Nuclease-free PBS (PBS in 0.1% DEPC, pH 7.4)			Add appropriate volume of DEPC to PBS, mix well and incubate overnight at room temperature with constant stirring. Autoclave for at least 20 minutes. Store at 4&deg;C
PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)	Sigma-Aldrich	P5368	Prepare according to manufacturer's instructions
PBS+pi (PBS plus protease and phoshatase inhibitors)			10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na<sub>3</sub>VO<sub>4</sub> in PBS, pH 7.4.&nbsp;&nbsp;
PBT			0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4
Pin holder	Fine Science Tools	26016-12
Primary antibody: goat anti-GAPDH	Imgenex	IMG-3073	For Western blotting. Used at 1:3000
Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1	Cell signaling	9578S	For immunofluorescence. Used at 1:100
Primary antibody: rat anti-DEcad	Developmental Studies Hybridoma Bank	DCAD2	For immunofluorescence. Used at 1:20
Primary antibody: rat anti-DEcad	DOI: 10.1006/dbio.1994.1287	DCAD1	&nbsp;Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100.
RNA extration kit: Relia Prep RNA tissue Miniprep kit&nbsp;	Promega	Z6110
Rnase decontamination reagent (RNase Away)	Molecular BioProducts	7002
Scalpel blades	Fine Science Tools	10050	Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder.
Secondary antibody: 488-conjugated&nbsp; donkey anti-rat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	712-545-153	For immunofluorescence. Used at 1:200
Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-165-144	For immunofluorescence. Used at 1:100
Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)	Cell Signaling Technology	7077	For Western blotting. Used at 1:3000
Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	305-035-003	For Western blotting. Used at 1:3000
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium Fluoride	Sigma-Aldrich	215309
Sodium vanadate	Sigma-Aldrich	50860
Spectrophotometer (NanoDrop)	ThermoFisher Scientific	2000c&nbsp;
Stereo dissecting microscope (M60 or M80)	Leica Microsystems		or similar microscope
Sylgard (black)	Dow Corning	SYLG170
Sylgard (transparent)	Dow Corning	SYLG184	Color black with finely ground charcol powder
Tissue: Kimwipes	KIMTECH	34120
TritonX	Sigma-Aldrich	T8787
Trizma hydrochloride pH7.5	Sigma-Aldrich	T5941
Tungsten needle, fine	Fine Science Tools	10130-10	Insert into pin holder
Tungsten needle, sturdy	Fine Science Tools	10130-20	Insert into pin holder
WTLB (western tissue lysis buffer)			150mM NaCl, 1.5% Triton X-100, 1mM EDTA, 20% glycerol, 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na<sub>3</sub>VO<sub>4</sub> in 50mM Tris-HCl (pH 7.5). Supplement with one cOmplete protease cocktail table per 10 mL solution.
Yeast paste	(local supermarket)		Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H<sub>2</sub>O