이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

Immunohistochemistry, 서쪽 분석 및 RNA 격리에 대 한 초파리 번데기 망막의 해 부

8.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/59299

⸱

2019년 3월 15일

 , 
1Department of Biology, Wesleyan University

이 논문에서

요약

이 문서는 초파리 번데기 망막 조직의 immunohistochemistry, 서쪽 분석 및 RNA 추출에 대 한 처리에 대 한 프로토콜 함께 해 부에 대 한 수술 메서드를 제공 합니다.

초록

초파리 번데기 망막 개발 하는 동안 전체적 프로세스의 연구에 대 한 우수한 모델 시스템을 제공합니다. 이 종이에 선물이 섬세 한 초파리 번데기 망막의 해 부에 대 한 신뢰할 수 있는 프로토콜. 외과 접근 pupae를 열고 정확 하 게 추출 눈 두뇌 단지를 쉽게 사용할 수 서 도구를 활용 합니다. 이러한 수 고정, 들어서는 immunohistochemistry, 망막에 다음 현미경 슬라이드에 장착 되며 목표 세포 또는 subcellular 구조를 감지 하는 경우를 몇 군데. 또는, 떼어낸된 망막 뇌 조직에서 분리, 적절 한 버퍼에 lysed 고 단백질 젤 전기 이동 법 또는 mRNA 추출 (각각 단백질 또는 유전자 식 평가)에 대 한 활용. 상당한 연습과 인내심, 기정 프로토콜을 마스터 해야 할 수 있습니다 하지만 일단 마스터, 프로토콜 수 주로 손상된 망막의 상대적으로 빠른 절연 있습니다.

서론

초파리 망막 색소 세포 벌집 격자1,2,,34배열에 의해 포위 하는 약 750 ommatidia 구성 됩니다. 각 ommatidium 8 포토 리셉터 신경, 4 렌즈 은닉 원추 세포, 그리고 두 가지 기본 안료 세포에 포함 되어 있습니다. 각 ommatidium를 주변 안료 생산 격자 세포와 감각 강 모 그룹 있습니다. 포스트 mitotic 자연 및 틀에 박힌 6 각형 배열, 초파리 번데기 망막 세포 접착5,6,를 포함 하 여 전체적 프로세스의 연구에 대 한 우수한 모델 시스템을 제공 7,8,9,10 및 apoptosis11,12,13,,1415.

여러 게시 프로토콜 초파리 번데기16,,1718에서 눈 뇌 단지 추출 공기 압력을 이용 한다. 프로토콜 설명 여기 대신 활용 하 서 도구를 신중 하 고 정확 하 게 격리 눈-뇌 손상된 망막 조직을 얻기의 목적으로 단지. 이것은 망막에 대 한 활용 하는 경우 중요 한 형태학, 단백질, 또는 유전자 발현 분석 때문에 망막 손상 세포 스트레스 또는 죽음, 세포 표현 형 또는 진 식을 수정할 수 발생할 수 있습니다. 또한, 연습 후, 6 ~ 10 눈 두뇌 단지 10 ~ 15 분, 나이 및 해 부 눈 조직의 발달 단계에서 가변성을 최소화의 목표를 용이 하 게 고립 될 수 있다.

고정, immunostaining, 및 아래에 설명 된 전체 마운트 프로토콜은 형광 현미경 검사 법에 대 한 초파리 눈의 준비에 적합 하다. 망막은 관심사의 단백질을 대상으로 하는 항 체와 알을 품을 수 있다. 예를 들어 외화 접합 부품에 항 체 특성 셀을 포함 하 여, 모양 및 배치 평가19될 수 있도록 셀의 꼭대기 크기를 시각화 하기 위해 활용할 수 있습니다. 고정, 이전 서쪽 분석, 단백질 또는 RNA qRT-PCR에 사용 하기 위해 또는 RNA 시퀀싱을 추출 하기 위해 뇌에서 눈 죽 습 수 대신 수 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

1. 조직 준비

  1. 초파리 를 설정 (앞에서 설명한20) 십자가 또는 원하는 유전자 형의 번데기를 특정 초파리 긴장 문화. 되도록 많은 pupae coincidently 등장, 그 영양소 풍부한 음식 미디어 또는 표준 식품 미디어 아낌없이 효 모-붙여넣기 보충에 중복이 비행 문화를 확립.
  2. 25 ° c.에 초파리 문화 유지 십자가 UAS GAL4 시스템을 활용 하 여, GMR GAL4 애벌레 눈 디스크 세포 후부 번데기 개발21,,2223, 를 통해 전체적 밭 고 랑을 표현 하는 이상적인 드라이버입니다. 24. 이상적인 제어 크로스 UAS lacZ X GMR GAL4 역할 크로스 비 생 및 불활성 β-galactosidase 단백질의 표현을 드라이브.
  3. 6"대나무 부 목 젖어 증류수 부드럽게 백색 사전 pupae (그림 1B) 건강 한 문화 튜브 (그림 1A)의 측면에서 고 1.5 mL microcentrifuge 튜브 (그림 1C)에 배치 된 팁을 사용 합니다.
  4. 튜브 건조 (그림 1D)에서 번데기를 보호 하기 위해 충분 한 습도 챔버를 유지 하기 위해 증류수에 배어 조직의 작은 조각 함께 플라스틱 피 펫 팁 상자에 놓습니다. 해 부까지 25 ° C에서 번데기를 품 어.
  5. 건조 6"대나무 부 목 사용 하 여 부드럽게 밀어 번데기 microcentrifuge 튜브에서와 해 부 접시 블랙에. 번데기에서 해 접시에 양면 테이프의 새로운 조각을 하다.
  6. 신중 하 게 집게의 쌍을 사용 하 여, 테이프 (그림 2A)에 번데기 등 쪽 (즉, operculums 향하도록, 그림 1B)를 배치 합니다. 번데기는 테이프에 잘 고착 확인 합니다.
    참고: 번데기 사건에 수 분 억제 보안 접착 테이프, 어떤 경우에, 이중 면 테이프에 배치 하기 전에 건조 하 pupae 허용 것 이다.

2입니다. 눈-두뇌 단지의 해 부

  1. 집게를 사용 하 여 각 번데기 (그림 2C)의 operculum 제거.
  2. 서가 위를 사용 하 여 슬라이스 또는 각 번데기의 번데기 케이스를 자르면. 플랩 머리, 흉부, 그리고 이중 면 테이프 (그림 2C) 번데기 케이스의 가장자리를 확보 하는 앞쪽 복 부 세그먼트 공개 번데기 케이스를 엽니다.
    참고: 그것은 전적으로 번데기를 밝힐 필요가 아니다.
  3. 날카로운 집게, 동물, 파악 된 각 번데기의 복 부를 관통 하 고 번데기의 경우 (그림 2C)에서 그것을 제거 합니다.
  4. 검은 해 부 접시, 테이프에서에 번데기를 놓고 차가운 인산 염-버퍼링-솔루션 (PBS, pH 7.4)의 약 400 µ L로 커버 합니다.
  5. 복 각 번데기 잡고 집게와 서가 위, 반에 번데기를 절단 전체 흉부를 통해 깨끗 한 횡단면 컷 (그림 2D).
  6. PBS에서 각 시체의 후부 잔재를 제거 하 고 해 접시에 한쪽에 넣어 (할 하지, 단계 3.2.1 참조).
  7. 두 켤레 미세 집게를 사용 하 여 열고 흉부 눈 두뇌 복잡 한 (그림 2E)을 각 번데기의 머리. 이렇게 하려면 흉부 상피의 잘라 가장자리를 파악 하 고 점차적으로 흉부를 열고 캡슐, 눈-뇌 복잡 하 고 주변 지방 조직의 노출 머리를 찢 어.
  8. 조직 파악 없이 집게를 사용 하 여 머리 캡슐의 나머지에서 눈 뇌 복잡 한 가이드 또는 찢어진 오픈 헤드 캡슐에서 눈 뇌 복잡 한 특 종.
    참고: 눈-두뇌 복잡 한 아령 모양의 오프 화이트, 그리고 주변 크림 지방 (그림 2B, E) 보다 더 반투명입니다.
  9. 집게, 신중 하 게 대부분 지방 눈 조직을 건드리지 않고 눈 두뇌 단지와 관련 된 제거.

3. 면역 형광 검사에 대 한 조직의 처리

  1. 설명된 (2.1-2.9 단계)으로 적어도 6 10 pupae를 해 부.
    참고: 각 해 부의 3 ~ 4 독립적인 복제 가설 테스트를 충분 한 데이터를 얻을 경향이 있다.
  2. 세척 및 고정
    1. p 20의 끝 또는 P100 피 펫 팁 반경 m m ~ 1 팁 열기 고 PBS와 지방 위쪽 및 아래쪽의 믹스를 pipetting으로 기름칠 깨끗 한 면도날으로 잘라. 이 지방 단계 2.6에서에서 제거 하는 시체 잔해에서 얻을 수 있습니다.
    2. 얼음 9 잘 유리 접시에 PBS의 ~ 400 µ L로 눈 두뇌 단지를 전송 합니다. 윤 활된 팁과 P20 또는 P100 공기 변위 micropipette 사용 하 여 전송.
      참고: 눈-두뇌 단지 것 이다 pipetting 동안 unlubricated 팁 준수 및 수 손상 또는 손실.
    3. 아래로 부드럽게 눈 두뇌 단지 소용돌이에 PBS에 pipetting 여 눈 조직와 관련 된 나머지 지방을 제거 합니다. 이에 모든 후속 세척 단계, 할 하지 직접 플라스틱 위쪽 및 아래쪽 눈 두뇌 단지가 연약한 눈 조직 손상 것입니다.
    4. 최소 볼륨에서 눈 뇌 단지 전송 (< 20 µ L) 정착 액의 적어도 250 µ L로 PBS의. 솔루션을 위아래로 pipetting으로 혼합. 35 분, 얼음에 품 어.
      참고: 단계 3.1.1에서에서 준비 같은 윤 활된 팁이이 전송에 대 한 사용할 수 있습니다.
    5. 동일한 피 펫 팁, PBS의 잘 포함 ~ 400 µ L로 눈 두뇌 단지 전송. 솔루션을 위아래로 pipetting으로 혼합 하 고 씻어 얼음에 5-10 분 동안 품 어. 세척 단계를 두 번 이상 반복 합니다.
      참고: 눈-두뇌 단지 최종 PBS 세척, 얼음, 또는 3.3.1 단계로 진행 하기 전에 4 ° C에서에서 몇 시간 동안 유지할 수 있습니다.
  3. 항 체 얼룩이 지기
    1. 차단 항 체 솔루션에 노출 이전 조직, 눈-두뇌 단지 ~ 400 µ L PBT의 전송. 윤 활된 팁과 P20 또는 P100 공기 변위 micropipette를 사용 하 여 전송. 10 ~ 60 분, 얼음에 품 어.
    2. PBT에 적절 한 항 체를 희석 하 여 1 차적인 항 체 솔루션을 준비 합니다. 눈-두뇌 단지 항 체 솔루션의 10 µ L aliquots에서 알을 품는, 준비 볼륨 10의 복제 됩니다.
    3. 72-잘 microwell 쟁반의 깨끗 한 우물에 항 체 솔루션의 aliquot 10 µ L (내용 참조).
    4. 반경에 ~0.5 m m 팁 열기 고 pipetting PBT에 의해 아래로 기름칠 깨끗 한 면도날으로 P10 피 펫 팁의 끝을 잘라.
    5. 전송의 볼륨에 더 이상 5 눈-두뇌 단지 < P10 공기 변위 micropipette 및 윤 활된 팁을 사용 하 여 항 체 솔루션의 각 10 µ L로 PBS의 3 µ L.
    6. 솔루션을 위아래로 pipetting으로 항 체 솔루션을 균질. 이 조직에 손상을 것입니다 위쪽 및 아래쪽 눈 두뇌 단지 플라스틱 하지 않습니다.
    7. 항 체 해결책의 증발을 최소화 하려면 microwell 쟁반으로 증류수에 배어 조직의 작은 조각을 놓고 (예를 들어, 함께 제공 하는 뚜껑) 트레이 인감. 4 ° c.에서 밤새 품 어
    8. 씻고 9 던 유리 접시에 PBT의 ~ 400 µ L로 눈 두뇌 단지 microwell 트레이에서 전송. P10 공기 변위 micropipette 및 PBT 윤 활 팁 (준비 단계 3.3.4에에서 설명 된 대로)를 사용 합니다. 솔루션을 위아래로 pipetting으로 혼합. 얼음에 5-10 분 동안 품 어.
    9. 세척 단계를 두 번 이상 반복 합니다. 세척 솔루션 사이 눈 두뇌 단지를 전송 하는 P20 또는 P100 공기 변위 micropipette와 PBT 윤 활 팁을 사용 합니다.
    10. 적절 한 fluorophore 태그 2 차 항 체 PBT에서 필요에 따라를 diluting 하 여 이차 항 체 솔루션을 준비 합니다. 이차 항 체 솔루션의 100 µ L 6-10 pupae의 배치 당 충분 하다. 약 수 9 던 유리 해 부 접시에 이차 항 체 솔루션.
    11. 눈-두뇌 단지 이차 항 체 솔루션에 전송 합니다. 전송에 대 한 P20 또는 P100 공기 변위 micropipette 및 PBT 윤 활 팁을 사용 합니다.
    12. 실 온에서 1-2 시간 또는 3-5 h 4 ° c.에 대 한 이차 항 체 솔루션에서 눈 뇌 단지 품 어 빛에 의해 fluorophores의 표백 방지 하기 위해 호 일 준비 커버.
      참고: 이차 항 체 솔루션에 외피의 최적의 기간 사용 하는 차 및 2 차 항 체에 따라 달라질 수 있습니다.
    13. 씻고 9 잘 유리 접시에 PBT의 ~ 400 µ L로 눈 두뇌 단지를 전송 합니다. 솔루션을 위아래로 pipetting으로 혼합. 얼음에 5-10 분 동안 품 어. 이 세척 단계는 두 번 이상 반복 한다.
  4. 보조 고정
    1. 보조 고정을 위한 정착 액의 적어도 200 µ L 눈 두뇌 단지 전송 하 고 실내 온도에 또는 4 ° c.에 35 분 20 분 동안 품 어
      참고: 보조 고정 장착 (3.5 단계) 에이즈 눈 조직 자나.
    2. 눈-두뇌 단지 5 분 동안 씻어 얼음, 9 잘 유리 접시에 PBT의 ~ 400 µ L로 전송 하는 P20 또는 P100 공기 변위 micropipette와 PBT 윤 활 팁을 사용 합니다.
    3. 세척 단계를 한 번 이상 반복 합니다.
    4. 사용은 P20 또는 P100 공기 변위 micropipette 및 PBT 윤 활 팁 ~ 400 µ L 1-2 분에 대 한 린스에 얼음, 9 잘 유리 접시에 PBS의 눈-두뇌 단지 소프트웨어인 모션 pipetting PBS에 의해 조직 하지만 조직 하지 유지 눈-두뇌 단지 정착 하 고 PBS 린스 중 유리 접시에 고착에서 방지 하기 위해 아래로.
  5. 장착
    1. 미디어를 마운트의 ~ 200 µ L로 눈 두뇌 단지를 전송 합니다. 눈-두뇌 단지 전송 하는 P20 또는 P100 공기 변위 micropipette와 PBT 윤 활 팁을 사용 합니다. 1-2 h에 대 한 미디어의 장착에 equilibrate을 조직을 수 있습니다.
    2. 깨끗 한 현미경 슬라이드에 신선한 설치 미디어의 5-8 µ L 드롭 장소.
    3. P10 팁 반경 ~0.5 m m 팁 열기를 증가 하 고이 고 P10 공기 변위 micropipette를 사용 하 여 슬라이드에 미디어를 마운트의 드롭에 미디어를 장착의 5-8 µ L에서 눈 뇌 단지 전송를 깨끗 한 면도날으로 잘라.
    4. 두 개의 텅스텐 바늘을 사용 하 여 시 돌출부에서 눈을 분리. 견고한 텅스텐 바늘으로 슬라이드에 복잡 한 눈-뇌를 고정 하 고 좋은 텅스텐 바늘 (그림 2F)의 연결된 시 엽 멀리 각 눈을 슬라이스.
    5. 좋은 텅스텐 바늘을 사용 하 여 슬라이드에 인접 한 각 눈의 기저 표면으로 현미경 슬라이드의 표면에 각 눈 기동. 부드럽게 조직을 통해 깨끗 한 커버 슬립을 낮은 및 매니큐어와 보안.
      참고: 그렇게 그들은 서로 가까이 또는 라인에서 슬라이드에 눈 정리 후속 현미경을 촉진할 것 이다.
    6. 형광 또는 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 망막을 이미지.
      참고: 슬라이드 해야 될 4 ° C에서 저장 아니라면 즉시 몇 군데 있습니다.

4. 서 부 럽 눈 조직의 준비:

  1. 10-16 pupae (단계 2.1-2.9) 다음 수정 해 부: a) 수집 및 두 개의 배치, 10-15 분 간격에 번데기를 해 부 및 b) PBS (PBS + pi) 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제와 보충에서 해 부.
  2. 눈-두뇌 단지는 p 20을 사용 하 여 전송 또는 P100 변위 micropipette 공기와 PBS + 얼음, 9 잘 유리 접시에 파이 씻어 짧게 ~ 400 µ L로 팁 (단계 3.2.1에서 준비)을 윤 활.
    참고:이 윤 활된 팁 4.3 및 4.4 후속 단계에 사용할 수 있습니다.
  3. 두 번 린스 단계를 반복 합니다.
  4. 모든 눈-두뇌 단지 얼음 차가운 PBS + 깨끗 한 검은 해 접시에 decanted pi ~ 400 µ L로 전송 합니다.
  5. 각 눈 (눈 뇌 복잡 한 위해) 견고한 텅스텐 바늘을 사용 하 여 광학 돌출부에서 제거 하 고 정밀한 면도날 또는 서가 위는 깨끗 하 게 잘라 각 눈 시 엽에서.
    참고: 눈이이 단계에서 '스티커'는 고 해 접시에 가볍게 준수 수 있습니다. 이것은 유리 광 엽 (내용 참조)에서 눈의 제거를 용이 하 게 도울 수 있다입니다.
  6. ' 청소 ' 모든 눈 '더미'에 PBS + 집게의 좋은 쌍에의 한 블레이드를 사용 하 여 해 접시에 pi.
  7. P10 팁 반경 ~0.5 m m 팁 개방을 확대 하 여 아래로 팁 내부에 의해 pipetting 서 조직 세포의 용 해 버퍼 (WTLB)에 기름칠 깨끗 한 면도날으로 잘라.
  8. 5 µ L의 PBS + pi에서 눈 뇌 단지 500 µ L microcentrifuge 튜브로 전송 합니다. 이 윤 활된 팁과 P10 공기 변위 micropipette 사용 하 여 전송 완료.
  9. 얼음에 microcentrifuge 튜브를 놓습니다. 샘플, WTLB 그리고 2 x 집중된 단백질 견본 버퍼의 10 µ L (또는 5 x 집중된 단백질 견본 버퍼의 2.5 µ L)의 1 볼륨 (5 µ L)를 추가 합니다. 두 드려서 믹스.
  10. 소용돌이 microcentrifuge 짧게 튜브 고 데스크탑 미니 원심 분리기를 사용 하 여 샘플 아래로 회전.
  11. 분석까지-20 ° C에서 샘플을 저장 합니다. 표준 프로토콜을 사용 하 여 분석 합니다.

5. 눈 조직의 RNA 추출 준비:

  1. 입고 장갑, 깨끗 한 벤치탑, 현미경, 해 부 도구, 블랙 후 RNase 오염 제거 시 약 70% 에탄올으로 처음 요리를 해 부. 건조를 허용 합니다.
  2. 30-40 번데기 단계로 설명 (2.1-2.9) 다음 수정 해 부:는) 수집 및 배치, 15-20 분;에 6 ~ 8 pupae를 해 부 b) nuclease 무료 PBS와 c 해 부) 눈의 각 일괄 처리를 별도로 분리 하지만 모든 망막 조직 같은 microcentrifuge 튜브 (단계 5.5)으로 축적.
    참고: 두 사람이 동시에 해 부를 데 좋은 눈 조직의 효율적인 분리를 가속화할 것 이다.
  3. 각 일괄 처리에 대 한 눈-두뇌 단지 (단계 2.1-2.9)와 얼음, 짧게, 린스를 9 잘 유리 접시에 nuclease 무료 PBS의 ~ 400 µ L로 전송 P20 또는 P100 공기 변위 micropipette 및 윤 활된 팁 (준비 단계 3.1.2에에서 설명 된 대로)를 사용 하 여 격리 합니다.
    참고:이 윤 활된 팁 5.4, 5.5-5.8 후속 단계에 사용할 수 있습니다.
  4. 두 번 린스 단계를 반복 합니다.
  5. 깨끗 한 검은 해 부 접시에 얼음 처럼 차가운 nuclease 무료 PBS의 신선한 400 µ L 드롭 눈 두뇌 단지 전송할.
  6. (복잡 한 눈 두뇌 위해) 견고한 텅스텐 바늘을 사용 하 여 광학 돌출부에서 각 눈을 제거 하 고 정밀한 면도날 또는 서가 위는 깨끗 하 게 잘라 각 눈 시 엽에서.
    참고: 눈이이 단계에서 '스티커'는 고 해 접시에 가볍게 준수 수 있습니다. 이것은 유리 광 엽 (내용 참조)에서 눈의 제거를 용이 하 게 도울 수 있다입니다.
  7. ' 청소 ' 모든 눈 '더미'로 nuclease 무료 PBS 해 접시에 집게의 좋은 쌍에의 한 블레이드를 사용 하 여에서.
  8. 살 균 RNase 무료 microcentrifuge 튜브에 눈 전송 및 액체 질소에 플래시 동결.
  9. Pupae의 각 배치의 해 부 (5.3-5.8 단계)를 반복 합니다. 액체 질소 (단계 5.5)를 축적 한 튜브에 모든 눈에서에서 유지 관리 하는 동일한 microcentrifuge 튜브에 눈의 각 일괄 처리를 전송 합니다.
  10. RNA 추출까지-80 ° C에서 샘플을 저장 합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

번데기 눈은 그 드라이브 morphogenesis 발달 과정을 조사 하는 우수한 모델 역할을 쉽게 액세스할 수 있는 조직 이다. 여기, 우리 망막 해 부는 면역 형광 꼭대기 외화 접합 (그림 3A, C) 또는 apoptosis (그림 3)25동안 활성화 되는 Dcp-1 caspase (그림 3D)를 감지 하는데. 이러한 방식을 명확 하 게 모집 등 (18 h APF)에서 1 차 셀의 morphogenesis 키 전체적 과정 동안 세포를 관찰 할 수, 격자의 윤 각 ommatidium (18-24 h APF), 주위 세포의 설립은 3 차 틈새 (21-24 h APF), 셀 크기와 모양 (18 h 40 h APF)에서 및 apoptosis (18 ~ 33 h APF)에서 변경 합니다. 이러한 전체적 이...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

여기에 설명 된 초파리 번데기 눈 해 부 방법 10 ~ 15 분 이내 6-10 눈 두뇌 단지의 격리에 대 한 수 있습니다. 그러나, 인 내와 연습 절 개 기술을 지배 품질 및 해의 속도 향상 시키기 위해 필수적입니다. 이 짧은 해 부 시간 각 눈 약 동일한 개발 단계, 표현 형 또는 유전자 표현의 데이터 집합에서 망막에 있는 가변성을 감소를 통해. 우리의 프로토콜은 조직적으로 찢 어 또는 깎기, 눈에 손상을 수 있는 스트레스 통로 활성화를 유도 또는 때문에의 위험을 최소화 하면서 섬세 한 망막 조직을 분리 하도록 대체 프로토콜 마스터를 덜 연습 해야, 하는 동안 세포 죽음입니다. 우리는 초보자 첫 번째 마스터 pupae 젊은 눈 해 부를 하기 전에 40 h APF 경작의 해 부를 조언. 거기는 항상 충분 한 pupae 컬렉션 (1.3 단계)에 사용할 수 있도록 것입니다 모든 실험 (단계 1.1)에 대 한 복제 설정 교차 하는 것이 좋습니다. 망막은 번데기 개발 연구원에 관심의 뚜렷한 전체적 이벤트에 따라 다양 한...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 공개 없다.

감사의 글

우리는 원고에 잭 드럼과 도움이 의견에 대 한 우리의 검토 감사합니다. 이 작품은 R15GM114729에 의해 지원 되었다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Adobe PhotoshopAdobe이미지 처리 소프트웨어
대나무 부목, 6" Ted Pella Inc116
베타 메르캅토에탄올시그마-알드리치M3148
베타-글리세롤 포스페이시그마-알드리치50020
검은색 해부 접시가장자리까지 SYLG170 또는 SYLG184(곱게 간 숯 가루로 검은색)으로 채워진 유리 페트리 접시. 중합을 위해 24-48시간 동안 실온에 두십시오.
블레이드 홀더Fine Science Tools10053
소 혈청 알부민Sigma-AldrichA7906
cOmplete, EDTA free 프로테아제 억제제 칵테일 정제Roche4693132001
Confocal microscope (Zeiss LSM 501)Carl Zeiss또는 이와 유사한 현미경
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC)Sigma-Aldrich40718
양면 테이프3M665
Drosophila 식품 매체, 영양이 풍부한 7.5% 자당, 15% 포도당, 2.5% 한천, 20% 맥주 효모, 5% 펩톤, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H2
>0Drosophila 식품 매체, 표준블루밍턴 초파리 스톡 센터 옥수수 가루 레시피.  (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)
에틸렌디아민테트라아세트산시그마-알드리치E6758
PBS의 고정액4% 포마데히드, pH 7.4.
형광 현미경 (TCS SP5 DM 현미경)Leica Microsystems또는 유사한 현미경
집게 Fine Science Tools91150-20집게는 자주 날카롭게 해야 합니다.
포름알데히드Thermo Scientific28908
유리 9-웰 디쉬 Corning7220-859-웰 디쉬라고도 함 
유리 커버 슬립 (22 x 22 mm)Fisher Scientific12-542-B
유리 현미경 슬라이드 (25 x 75 x 1 mm)Fisher Scientific12-550-413
유리 페트리 접시Corning3160-100BO
글리세롤Sigma-AldrichG5516
Image Studio 소프트웨어 버전 5.2.5LI-COR Biosciences웨스턴 블롯의 정량화를 위한 이미지 처리 소프트웨어.
Laemmli 샘플 버퍼Bio-Rad161-07372X 농축 단백질 샘플 버퍼, 제조업체의 지침에 따라 베타 메르캅토에탄올을 보충합니다.
샘플 버퍼를 줄이는 레인 마커 ThermoFisher Scientific390005X 농축 단백질 시료 버퍼.
마이크로 원심분리기 튜브 AxygenMCT-175-C
미세해부 가위 Fine Science Tools15000-03
Microwell 트레이 (72 x 10 µ L wells)Nunc438733
마운팅 매체PBS N-프로필갈레이트에 0.5% N-프로필갈레이트 및 80% 글리세롤
Sigma-AldrichP3130
뉴클레아제가 없는 PBS(0.1% DEPC의 PBS, pH 7.4)PBS에 적절한 양의 DEPC를 첨가하고 잘 섞은 후 실온에서 일정한 교반으로 밤새 배양합니다. 최소 20분 동안 오토클레이브합니다. 4°C에 저장; C
PBS (인산염 완충 식염수 pH 7.4)Sigma-AldrichP5368제조업체의 지시에 따라 준비
PBS+pi (PBS 플러스 프로테아제 및 포샤타제 억제제)10mM NaF, 1mM 베타-글리세롤 포스페이트 및 1mM Na3VO4 PBS, pH 7.4.   
PBT0.15% TritonX 및 0.5% 소 혈청 알부민, PBS, pH 7.4
핀 홀더Fine Science Tools26016-12
1차 항체: 염소 항-GAPDHImgenexIMG-3073웨스턴 블로팅용. 1:3000에서 사용
1차 항체: 토끼 anti-cleaved Dcp-1세포 신호9578S면역형광용. 1:100 1차
쥐 anti-DEcadDevelopmental Studies Hybridoma BankDCAD2. 1:20
1 차 항체 : rat anti-DEcadDOI : 10.1006 / dbio.1994.1287DCAD1  우에무라 타다시의 선물. 1:100에 사용됩니다.
RNA 제거 키트: Relia Prep RNA 조직 Miniprep 키트 PromegaZ6110
Rnase 오염 제거 시약(RNase Away)Molecular BioProducts7002
메스 블레이드Fine Science Tools10050스케이프 블레이드의 작은 조각을 부수고 블레이드 홀더에 고정합니다.
2차 항체: 488-conjugated  당나귀 항쥐 IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch712-545-153면역형광용. 1:200
2차 항체: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch111-165-144면역형광용. 1:100
2차 항체에서 사용: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)Cell Signaling Technology7077웨스턴 블로팅용. 1:3000
2차 항체: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch305-035-003웨스턴 블로팅용. 1:3000
나트륨 염화물Sigma-AldrichS3014
나트륨 플루오라이드Sigma-Aldrich215309
바나데이트 나트륨Sigma-Aldrich50860
분광광도계 (NanoDrop)ThermoFisher Scientific2000c 
실체 해부 현미경 (M60 또는 M80)Leica Microsystems또는 이와 유사한 현미경
Sylgard (black)Dow CorningSYLG170
Sylgard (투명)Dow CorningSYLG184색상 곱게 분쇄 된 숯 가루가있는 검정색
조직 : KimwipesKIMTECH34120
TritonXSigma-AldrichT8787
Trizma hydrochloride pH7.5Sigma-AldrichT5941
텅스텐 바늘, 미세Fine Science Tools10130-10핀 홀더에 삽입
텅스텐 바늘, 견고한Fine Science Tools10130-20핀 홀더에 삽입
WTLB (Western Tissue lysis Buffer)50mM Tris-HCl (pH 7.5)에서 150mM NaCl, 1.5 % Triton X-100, 1mM EDTA, 20 % 글리세롤, 10mM NaF, 1mM 베타 글리세롤 인산염 및 1mM Na3VO4. 10mL 용액당 1개의 cOmplete 프로테아제 칵테일 테이블을 보충하십시오.
효모 페이스트(현지 슈퍼마켓)~20mL 증류된 H2O에 용해된 Fleischmann's ActiveDry 효모(또는 이와 유사한 것) 약 2테이블스푼
트 항체에서 사용: 면역형광을 위한

참고문헌

  1. Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Developmental biology. 136 (2), 346-362 (1989).
  2. Wolff, T., Ready, D. The development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview. 1277-1325 (1993).
  3. Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Current opinion in genetics & development. 17 (4), 309-313 (2007).
  4. Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Developmental Dynamics. 241 (1), 136-149 (2012).
  5. Hayashi, T., Carthew, R. W. Surface mechanics mediate pattern formation in the developing retina. Nature. 431, 647(2004).
  6. Bao, S., Cagan, R. Preferential Adhesion Mediated by Hibris and Roughest Regulates Morphogenesis and Patterning in the Drosophila Eye. Developmental Cell. 8 (6), 925-935 (2016).
  7. Cordero, J. B., Larson, D. E., Craig, C. R., Hays, R., Cagan, R. Dynamic Decapentaplegic signaling regulates patterning and adhesion in the Drosophila pupal retina. Development (Cambridge, England). 134 (10), 1861-1871 (2007).
  8. Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. Cellular behavior in the developing Drosophila pupal retina. Mechanisms of development. 125 (3-4), 223-232 (2008).
  9. Martín-Bermudo, M. D., Bardet, P. L., Bellaïche, Y., Malartre, M. The vav oncogene antagonises EGFR signalling and regulates adherens junction dynamics during Drosophila eye development. Development. 142 (8), 1492-1501 (2015).
  10. Chan, E. H., Chavadimane Shivakumar, P., Clément, R., Laugier, E., Lenne, P. F. Patterned cortical tension mediated by N-cadherin controls cell geometric order in the Drosophila eye. eLife. 6, e22796(2017).
  11. Lin, H. V., Rogulja, A., Cadigan, K. M. Wingless eliminates ommatidia from the edge of the developing eye through activation of apoptosis. Development. 131 (10), 2409-2418 (2004).
  12. Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye. Mechanisms of development. 121 (12), 1523-1530 (2004).
  13. Mendes, C. S., et al. Cytochrome c‐d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina. EMBO reports. 7 (9), 933-939 (2006).
  14. Monserrate, J., Brachmann, C. B. Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye. Cell Death & Differentiation. 14 (2), 209-217 (2007).
  15. Bushnell, H. L., et al. JNK is antagonized to ensure the correct number of interommatidial cells pattern the Drosophila retina. Developmental Biology. 433 (1), 94-107 (2018).
  16. Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, (2007).
  17. Hsiao, H. Y., et al. Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4347(2012).
  18. Tea, J. S., Cespedes, A., Dawson, D., Banerjee, U., Call, G. B. Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (93), e52315(2014).
  19. Johnson, R. I., Cagan, R. L. A Quantitative Method to Analyze Drosophila Pupal Eye Patterning. PLoS ONE. 4 (9), e7008(2009).
  20. Greenspan, R. J. Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
  21. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  22. Ellis, M. C., O'Neill, E. M., Rubin, G. M. Expression of Drosophila glass protein and evidence for negative regulation of its activity in non-neuronal cells by another DNA-binding protein. Development. 119 (3), 855-865 (1993).
  23. Duffy, B. J. GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife. genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  24. Li, W. Z., Li, S. L., Zheng, H. Y., Zhang, S. P., Xue, L. A broad expression profile of the GMR-GAL4 driver in Drosophila melanogaster. Genet Mol Res. 11 (3), 1997-2002 (2012).
  25. Song, Z., McCall, K., Steller, H. DCP-1, a Drosophila Cell Death Protease Essential for Development. Science. 275 (5299), 536-540 (1997).
  26. Hay, B. A., Wassarman, D. A., Rubin, G. M. Drosophila homologs of baculovirus inhibitor of apoptosis proteins function to block cell death. Cell. 83 (7), 1253-1262 (1995).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

더 많은 논문 탐색

안구-뇌 복합체미세해부 프로토콜면역조직화학 분석웨스턴 블롯 분석RNA 분리 방법번데기 눈 해부조직 고정 프로토콜항체 배양현미경 슬라이드 마운팅
Immunohistochemistry, 서쪽 분석 및 RNA 격리에 대 한 초파리 번데기 망막의 해 부
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.