신형성 및 시냅스 성숙의 고함량 스크리닝을 위한 인간 다능성 줄기 세포 유래 뉴런의 분화 후 리포팅

Summary

이 프로토콜은 이전에 여러 주 동안 시험관 내 신경 전구체로부터 분화 된 인간 줄기 세포 유래 뉴런을 재중단하고 배양하기위한 상세한 절차를 설명합니다. 이 절차는 경질 현미경 검사법 및 고함량 스크리닝과 호환되는 형식으로 neurites, 시냅스 및 늦게 발현되는 뉴런 마커의 이미징 기반 검술을 용이하게 합니다.

Abstract

인간 다능성 줄기 세포 유래 신경 전구 세포 (NPC)에서 2 차원 배양으로 분화 된 뉴런은 질병 메커니즘을 탐구하고 화합물을 심문하는 고함량 스크리닝 (HCS)을 수행하는 강력한 모델 시스템을 나타냅니다. 라이브러리 또는 유전자 돌연변이 표현형을 식별합니다. 그러나, 인간 세포와 함께 NPC에서 기능으로의 전환, 성숙한 뉴런은 몇 주가 필요합니다. 시냅스는 전형적으로 단층 배양에서 분화의 3 주 후에 형성하기 시작하고, 몇몇 신경 특이적 단백질, 예를 들면 나중에 pan-neuronal 마커 NeuN, 또는 층 5/6 대뇌 피질 신경 마커 CTIP2를 발현하는, 발현하기 시작합니다 약 4-5 주 후 차별화. 이 긴 분화 시간은 소량의 다중 웰 HCS 플랫폼에 사용되는 최적의 배양 조건과 호환되지 않을 수 있습니다. 많은 과제 중 에는 최소한의 세포 군집으로 잘 부착되고 균일하게 분포된 세포와 장기적인 생존력과 기능성 시냅스 성숙을 촉진하는 배양 절차가 필요합니다. 한 가지 접근법은 큰 볼륨 형식으로 뉴런을 분화한 다음 HCS 호환 멀티 웰의 나중 시점에서 뉴런을 재플레이트하는 것입니다. 이 보충 접근법을 사용할 때 몇몇 주요 도전은 수지상 및 축색 네트워크의 스트레스 중단 때문에 재현성 및 세포 생존을 염려합니다. 여기에서 우리는 4-8 주 동안 대용량 형식으로 분화 한 후 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC) 파생 뉴런을 효소적으로 재중단시키는 상세하고 신뢰할 수있는 절차를 입증하여 384 웰 마이크로 티터로 옮김합니다. 플레이트, 우수한 세포 생존과 함께 추가로 1-3 주 동안 그들을 배양. 인간 뉴런의 이 보충은 시냅스 어셈블리의 연구와 보충에서 2 주 안에 성숙의 연구를 허용할 뿐만 아니라, 또한 신경질성 재생 및 성장 콘 특성의 연구를 가능하게 합니다. 우리는 384 웰 플랫폼을 사용하여 신생 및 시냅토 발생에 대한 확장 가능한 분석의 예를 제공합니다.

Introduction

인간 만능 줄기 세포 (hiPSC) 유래 뉴런은 기초 연구, 약물 개발 및 재생 의학 분야에서 점점 더 관련이 있습니다. 워크플로우 및 프로시저들은 그들의 배양 및 유지관리를 최적화하고, 특정 뉴런 아류형으로의 분화효율을 향상시키고, 급속히 진화하고 있다^1,2. 모델 시스템으로서 인간 줄기 세포 유래 뉴런의 유용성과 비용 효율성을 향상시키기 위해 약물 발견 및 표적 검증에서 고함량 분석을 수행할 수 있으며, 성숙하고 기능적인 뉴런을 생성하는 데 필요한 배양 시간을 줄이는 것이 유용하다. 최대 견고성, 재현성 및 표현형 관련성을 유지하면서 뉴런을 유지합니다. 3차원 오르가노이드 배양이 신경 발달 연구^3에서돌파구를 주도하고 있지만, 2차원 단층 문화는 최소한의 조직 두께로 인해 자동화된 이미징 기반 응용 분야와 특히 호환됩니다.

그러나, 인간 신경및 신경 발달 질병의 모형에 화상 진찰 기지를 둔 검열 방법의 적응은 중요한 도전에 직면합니다. 인간 신경계가 생체 내에서 성숙하는 연장된 기간은 유전자 발현의 자연적인 프로그램을 수용하고 신경 성숙을 달성하기 위해 문화에서 연장 된 시간을 필요로합니다.

긴 신경 분화 프로그램의 한 가지 실질적인 결과는 hiPSC 유래 단층 배양의 유지가 적절한 시냅스 성숙을 달성하기 위해 몇 주 동안 지속되어야한다는 것입니다. 이 시간 동안, 미분화 남아 있는 신경 선조는 분열을 계속합니다. 이들은 신속 하 게 문화를 성장 하 고 실행 가능한 postmitotic 신경 세포를 유지 하는 데 필요한 영양소 콘텐츠를 usurp 수 있습니다. 신경 전구 세포 (NPC)를 적극적으로 분할하는 것은 또한 성장 기판에 대한 뉴런과 경쟁 할 수 있습니다. 이것은 나쁜 접착의 문제, 화상 진찰 기지를 둔 비검사에 적합하지 않은 조건에 그 같은 문화를 렌더링할 수 있습니다. 더욱이, 많은 연구자들은 배양량이 작을수록, 신경분화의 후기 단계를 관찰할 수 있을 만큼 충분히 긴 분화 뉴런의 건강한 집단을 유지하는 데 더 큰 어려움이 있다는 것을 발견한다. 즉, 고함량 스크리닝(HCS) 접근법을 이용한 시냅스 성숙의 어설션은 인간 유래 뉴런에 대해 매우 어려울 수 있다.

이러한 문제 중 일부를 우회하기 위해 이전에 차별화된 hiPSC 유래 뉴런을 다시 일시 중단하고 보충하는 절차가 사용되었습니다. 첫째, 그것은 완전히 헌신 된 뉴런의 인구에서 neurite 파생 (또는 더 정확하게는 neurite 재생)에 대한 연구를 허용합니다. 둘째, 이전에 분화된 뉴런을 대용량(예: 10cm 플레이트 이상)에서 작은 볼륨 형식(예: HCS 호환 96- 또는 384웰 마이크로티터 플레이트)까지 재구성하면 총 배양 시간을 크게 줄일 수 있습니다. 볼륨 조건이 작습니다. 이것은 시험관내에서 후속 주에 걸쳐 시냅스 조립 및 성숙의 연구를 용이하게한다.

그러나, 이미 긴 neurites및 복잡한 연결 네트워크를 설치한 성숙한 뉴런의 replating는 몇몇 도전을 제출합니다, 그 중 하나는 때때로 높고 가변적인 세포 사멸의 비율입니다. 여기에서, 우리는 우수한 세포 생존 및 재현성 귀착되는 보충 절차를 기술합니다. 일반적으로, 뉴런은 짧은 잠복기 (전형적으로 ~ 3-10 분) 삼조 전에 기질에서 세포를 분리하기 위해 proteolytic 효소에 노출됩니다. 이 짧은 proteolysis 시간은 관례적으로 비 신경 세포 및 미분화 선조^4,5,6을포함하여 분할 세포의 많은 모형을 중단하고 통과시키기 위해 이용됩니다. 그러나, 길고 상호 연결된 신경염을 가진 분화한 뉴런의 경우, 기판에서 세포를 분리하는 것뿐만 아니라 손상을 최소화하면서 개별 세포를 격리하기 위해 수지상 및 축색 네트워크를 방해하는 것이 필수적입니다. 실제로, 뉴런의 두꺼운 메쉬 워크는 일반적으로 개별 세포보다는 단일 시트로 기판에서 분리하는 경향이있다. 신경질의 두꺼운 네트워크를 느슨하게하기 위해 주의를 기울이지 않으면 뉴런은 삼중 화 중에 돌이킬 수 없을 정도로 손상될뿐만 아니라 많은 사람들이 덩어리를 제거하는 데 사용되는 필터를 통과하지 못하여 세포 수율이 떨어집니다. 아래에서 우리는 이러한 어려움에 대처하기 위해 널리 사용되는 프로테아제 배양 절차에 대한 간단한 수정을 설명합니다.

아래에 기술된 프로토콜에서, 뉴런은 프로테오용 효소(예를 들어, Accutase)와 같은 가벼운 프로테아제와 함께 40-45분 동안 배양된다. 효소를 첨가한 후 처음 5-10분 동안, 뉴런 네트워크는 시트로서 기판으로부터 들어올린다. 프로테아제와의 인큐베이션은 부드러운 삼각 및 여과로 진행하기 전에 추가로 30-40 분 동안 진행됩니다. 이 추가 배양 시간은 물질의 소화가 세포 간 네트워크를 이완시키는 것을 보장하는 데 도움이, 따라서 후속 삼조는 개별 세포의 현탁액을 생성하는 것을 보장. 이 절차는 세포 사멸을 최소화하면서 보충시 세포 분포의 균일성을 극대화합니다. 우리는 성공적으로 hiPSC 파생된 신경 배양에 이 replating 방법을 다양한 분화 프로토콜^7,8 및 hiPSCs의 각종 선에서 생성된 적용했습니다. 절차는 줄기 세포 파생된 신경세포의 대부분 또는 전부와 함께 사용하기에 명목상 에 적당합니다. 우리는 확장 된 프로테아제 배양 시간이 작은 형식 의 플레이트 (예를 들어, 35mm 직경)에서 배양을 보충하는 데 절대적으로 필수적이지 않다는 것을 관찰했습니다. 그러나 여기에서 볼 수 있듯이, 이러한 플레이트의 neurites가 매우 긴 공정을 확장하고 조밀하게 상호 연결된 배열을 형성 할 수 있기 때문에 큰 직경의 플레이트 (예 : 직경 10cm 이상)에서 보충 할 때 상당한 이점을 제공합니다.

여기에서 우리는 이 방법을 설명하고 초기 신생에 대한 분석과 시냅스 성숙에 대한 분석에서 그 적용을 간략하게 설명하며, 이는 수상돌기와 축삭을 따라 전과 후의 후배 단백질을 군집화하는 것을 포함하고, 그 다음에 그들의 후에 시냅스 사이트에서 의 국소화. 이 예제에서는 이 프로토콜이 세포 생존가능성과 재현성을 보존하는 데 제공하는 이점을 강조합니다. 첫째, 그것은 인간 적인 신생에 있는 초기 단계를 공부하는 조사자가 허용합니다. 실험 설정은 설치류 피질 또는 해마 뉴런의 일반적으로 사용되는 기본 문화와 유사하며, 여기서 세포는 늦은 태아 또는 초기 산후 뇌에서 추출되고, 부드러운 프로테아제 치료 후 삼각에 의해 해리되고, 허용 신경을 시작하거나 절차^9,10에서절단 된 신경 을 재생합니다. 이러한 설치류 기본 뉴런과 유사하게, hiPSC 유래 뉴런은 보충 후 몇 시간 내에 신경 세포를 형성하거나 재생하기 시작하여 적은 수의 높은 시공간 이미징에 최적 환경에서 성장 원추형 및 신경 세포형성의 이미징을 허용합니다. 미분화 세포를 둘러싸고 있습니다. 우리는 뉴런이 처음 선조 집단과 구별하기 시작할 때 볼 수있는 가변 지연 및 다른 파생 속도에 비해 neurite 의 성장은 더 동기화되는 것을 관찰했습니다. 또한, replating은 피질 층 5/6 전사 인자 CTIP2 (치킨 ovalbumin 업스트림 프로모터 전사와 같은 신경 발달에서 일반적으로 나중에 나타나는 신경 아류형 마커를 발현하는 뉴런의 분석분석서를 가능하게 합니다) 인자 상호 작용 단백질 2), 또는 범 뉴런 마커 NeuN^11. 리피팅 접근법의 특히 유용한 특징은 시냅토발생이 HCS와 호환되는 시간 프레임 내에서 진행된다는 것입니다.

Protocol

1. 보충 이전의 차별화 기간

1. 10cm 접시에 뉴런을 분화하고, 선택^7,8의 프로토콜을 사용하여 뉴런이 그들의 프로세스와 두꺼운 네트워크를 형성하고 MAP2 또는 TuJ1과 같은 초기 뉴런 마커뿐만 아니라 NeuN과 같은 후기 마커를 표현할 때까지.
2. 신경 분화 과정 동안 4일마다 선택의 절반 의 배지를 변경합니다.
   참고 : 더 광범위하거나 빈번한 매체 변화는 필수 영양 요인을 희석하고 성숙을 불리하게 할 수 있습니다.
   1. iPSC 유래 WT126 뉴런의 경우, 다음 분화 후 배양 배지 사용: 5 mL 100x N2 보충제, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF, 10 ng/mL 라미닌, 200 μM 아스코르브산, 1 μM 디부티릴-cAMP 및 10 mL SM1 에 대한 500 mL Dulbec의 변형 영양소 혼합물 F-12 (DMEM / F12). 점차적으로, 반 배지 변화를 사용 하 여신경 기저 매체 (재료표)와 동일한 보충제로 대체 하십시오.
   2. iPSC 유래 CVB WT 뉴런의 경우, 다음의 분화 후 배양 배지를 사용하십시오: 500 mL 신경 기저 A 배지 (재료표)및 500 mL DMEM/F12 배지와 2 μg/mL 라미닌, 10 mL 글루타민 보충제 (재료표), 0.75 mg/mL 중탄산나트륨, 5 mL 최소 필수 배지(MEM) 비필수 아미노산, 0.2 mM 아스코르브산, 10 ng/mL BDNF, 20 mL 50x B27, 10 mL 100x N2 보충제.

2. 코팅 멀티웰

1. 전날, 폴리-L-오르니틴(PLO)으로 코팅하십시오. 재고 용액 (10 mg / mL)을 만들기 위해 멸균 물에 PLO를 용해. 이 스톡은 -20 °C에 보관하십시오. 플라스틱 코팅 시 PLO 1:100을 물로 희석하여 유리코팅 시 50 μg/mL의 농도를, 1:1,000 비율(10 μg/mL)의 농도를 생성합니다.
2. 코팅을 대상 플레이트에 직접 바하십시오. 플레이트 크기에 적합한 코팅의 부피를 사용하십시오(즉, 24웰 플레이트의 경우 웰당 500 μL의 PLO 용액을 적용).
3. 접시가 실온에서 하룻밤 동안 어두운 색에 앉을 수 있도록 하십시오.
4. 시료 류의 날에 코팅 된 접시를 회수하고 멸균 생물 안전 성 캐비닛으로 옮니다.
5. PLO 용액을 흡인하고 멸균수로 두 번 헹구세요.
6. 1:400 희석에서 인산완충식염수(PBS)에 라미닌(1.15 mg/mL)을 희석합니다.
   참고: 4 °C에서 라미닌을 해동하고 신속하게 라미닌과 고르지 않은 코팅의 응집을 방지하기 위해 PBS에 추가합니다.
7. 멸균수를 흡인하고 이전에 PLO로 코팅 된 우물에 500 μL의 라미닌 코팅을 적용합니다.
8. 플레이트를 37°C 인큐베이터에 넣고 최소 4-6시간 동안 유리 표면에 대해 최대 16시간 의 긴 배양을 사용하십시오. 일관된 배양 시간을 사용합니다.

3. 차별화된 뉴런 을 보충

1. PBS로 분화 뉴런의 플레이트를 한 번 부드럽게 헹구십시오. PBS를 플레이트 의 벽아래로 부드럽게 분산시키고 세포에 직접 직접 가지 말고 방해하지 않도록 하십시오.
2. 부드럽게 PBS를 흡인, 직접 세포를 만지지 않도록조심하지만 연구원을 향해 팁동안 접시의 가장자리에서 흡인.
3. 10cm 플레이트당 최소 1 mL의프로테올리산 효소(재료 표)를 바르고 세포를 인큐베이터로 되돌려 놓습니다. 조직 배양실이 낮은 습도로 인해 높은 증발속도를 보이는 경우 약간 더 높은 부피를 첨가한다.
4. 판에서 그(것)들을 분리하고 신경 네트워크 내의 그밖 신경에서 그(것)들을 분리하기 위하여 40-45 분 동안 proteolytic 효소로 세포를 배양합니다.
   참고: 이 단계의 타이밍은 매우 중요합니다. 프로테아제를 너무 일찍 담금질하면 보충 후 세포 사멸이 증가할 수 있습니다. 프로테오리액 효소 제조업체는 37°C보다 훨씬 낮은 온도를 세포주 통과(예: 4°C에서 하룻밤)에 대한 더 긴 잠복기와 함께 사용할 것을 권장합니다. 그러나, 4 °C에서 신경 을 취급 하는 것은 피해 야 한다, 그들은 종종 차가운 노출 후 가난한 생존을 보여. 제조자는 또한 37°C에서 효소를 가진 60 분 배양이 효소 불활성화로 이끌어 낸다는 것을 명시합니다. 그러나, 저자의 경험에서, 37°C에서 hiPSC 유래 뉴런 배양의 40-45분 배양은 반응시 효율적인 해리 및 우수한 뉴런 생존에 충분하다.
5. 인큐베이션 시간 동안 상 대비 현미경으로 뉴런을 확인하고 신경망이 플레이트에서 완전히 분리되고 아래 판을 잠깐 흔들면 작은 시트에서 분리되기 시작할 때까지 프로테아제 치료가 계속될 수 있습니다. 현미경.
6. 10 cm 플레이트에서 프로테아제 1mL당 5 mL의 신선한 DMEM 미디어를 사용하여 프로테아제 활성을 담금질하여 소화를 중지합니다. 혈청학적 파이펫을 사용하여 네트워크를 방해하기 위해 플레이트에 대해 5-8 회 부드럽게 삼중 화합니다. 차별화된 뉴런이 취약하기 때문에 삼중화 시 너무 많은 압력을 가하지 않도록 주의하십시오. 끝이 너무 날카롭고 좁기 때문에 P1000 팁을 사용하지 마십시오.
7. 100 μm 직경의 메쉬가 있는 셀 스트레이너를 통해 세포로 용액을 신선한 50 mL 원점 튜브 드롭에 한 방울씩 바릅니다.
8. 세포가 여과된 후 신선한 DMEM 매질 5mL를 추가로 헹구는 스트레이너.
9. 벤치탑 원심분리기의 스핀 셀을 1,000 x g에서 5분 동안 회전시다.
10. 원유관을 생체 안전 성 캐비닛으로 되돌려 서 대부분의 매체를 흡인하여 세포가 수분을 유지하도록 약 250 μL을 남깁니다.
11. 신선한 DMEM 매체 2mL에서 세포를 부드럽게 다시 일시 중단합니다. 튜브 측면에 펠릿을 피펫하지 마십시오. 대신, 원추형 2-3회 부드럽게 반전하고 5 mL 의 혈청학적 파이펫 끝을 통해 세포를 통과하여 빼냅니다.
12. 10 μL의 재중단 된 뉴런을 혈세포계의 가장자리에 적용하십시오.
13. 이 재서스펜션 단계 도중 세포 생존가능성을 평가하기 위하여 세포의 방울에 트리판 블루의 8-10 μL를 추가하십시오. 이 혼합물의 10 μL을 혈전계 또는 기타 자동 세포 카운터에 적용하십시오. 단계 밝은 그 세포를 실행 가능한 평가 하 고 trypan 블루 염료를 제외.
14. 생존 세포 /mL의 양을 결정하고 원하는 세포 밀도에 따라 원점 튜브의 내용을 희석 할 준비를하십시오.
15. 플레이트 ~10,000 웰 당 384 웰 플레이트; 플레이트 ~ 150,000-200,000 세포 24 웰 플레이트에 대한 웰 당.
16. 적절한 희석을 달성하기 위해 재 중단 된 세포의 원추형 튜브에 신선한 DMEM을 추가하고 특정 세포주 요구 사항에 따라 B27 및 / 또는 BDNF와 같은 추가 적절한 보충제를 추가하십시오.
17. 원유튜브를 부드럽게 기울여 2-3회 섞습니다.
18. 24 웰 플레이트에서 래미닌 코팅, 또는 PBS로 16 채널 파이펫을 사용하여 384 웰 멀티 웰 플레이트에서 한 번 헹구는 다중 웰 플레이트.
19. 24웰 플레이트에 대한 P1000, 또는 384웰 플레이트용 16채널 파이펫을 사용하여 PBS를 흡인한다.
20. 응집을 피하기 위해 그림 8 모션에서 각 잘 셀 솔루션을 적용합니다. 자동 액체 처리 장치를 사용하여 도금 균일성을 최적화할 수도 있습니다.
    참고: 2-4일 후부터 매질에 라미닌을 첨가하면 세포의 균질한 분포를 유지하는 데도 도움이 된다.
21. 각 웰에 대해 3.19 단계와 3.20 단계를 반복합니다.
22. 플레이트를 37°C 및 5% CO2로 설정된인큐베이터로 되돌려 놓는다.
23. 2일 후, 섹션 1.2에 기재된 분화 후 배양 배지를 사용하여 4일마다 배지의 절반을 변경하기 시작한다. 원하는 성숙 시간 후, 실험 요건에 따라 37°C에서 3.7% 포름알데히드를 사용하여 배양을 수정하고 얼룩 세포를 염색한다.

4. 세포 생존 성 시험 사후 보충

1. 스톡 용액을 간략하게 소용돌이치게 한 후 초기 세포 사멸 리포터(VivaFix: 50 μL 스톡 용액당 50μL 배양 배지당 0.5 μL)를 추가했다.
2. 유리 바닥 멀티웰에서 배양된 살아있는 세포와 죽은 세포를 20분 후에 세척 단계 없이, 세포 내부에 한 번만 염색하기 때문에, 또는 이미징 전에 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 및/또는 기타 항체로 염색 및 공동 얼룩을 고치고 공초점 현미경을 사용하여.

5. 면역 염색

1. 37°C에서 20분 동안 PBS에 포름알데히드를 더한 120 mM 자당으로 배양액을 수정합니다.
2. 실온에서 5분 동안 0.2% 트리톤 X-100으로 헹구고 투과한 다음, 2% 소 혈청 알부민(BSA)으로 30분 동안 차단합니다.
3. 토끼 항 MAP2 항체 1:1,000, 마우스 항β3 튜불린(TuJ1) 항체 1:2,000, 닭항-NeuN 항체(1:100) 및 랫트 항-CTIP2 항체(1:500), 또는 마우스 항체를 사용하여 실온에서 1시간 동안 헹구지 않고 BSA를 흡인합니다. 1:200), 토끼 항시냅신 1(1:200) 및 시냅스 염색을 위한 닭 안티 MAP2 항체.
4. PBS로 헹구고, 37°C에서 45분 동안 알렉사 플루오르-컨쥬게이트 이차 항체와 DAPI로 배양한다.
5. 마지막으로, 이미징 전에 PBS로 두 번 씻으하십시오.

6. 칼슘 이미징

1. AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE (살크 생물학 연구소, GT3 핵심 시설)로 배양 된 세포를 10 일 후 보충 및 이미지로 감염하여 3-4 주 후 보충에서 자발적인 칼슘 과도 상태를 평가합니다.

7. 이미지 수집 및 분석

참고: 취득 시스템에 대한 자세한 내용은 칼라브레스 외^12를참조하십시오.

1. 수동 또는 자동 이미지 수집을 위해 이미징 모듈을 사용하고, 형태 측정을 위해 CellProfiler^13과같은 이미지 분석 소프트웨어 모듈을 사용합니다.
2. 동일한 필드 내의 뉴런(DAPI + MAP2 또는 TuJ1 양성 세포)으로 나눈 시야당 총 길이를 측정하여 TuJ1 양성 신경과 MAP2 양성 모수석의 평균 길이를 계산합니다.

Results

여러 주 동안 차별화 된 hiPSCs 파생 된 뉴런의 replating 몇 가지 장점을 제공 합니다. 그러나, 길고 상호 연결된 모수석과 축산(그림1A)이 있는 분화된 뉴런을 분리하고 보충하면 돌이킬 수 없는 손상된 뉴런의 높은 분획을 초래할 수 있다.

프로토콜 섹션에 설명된 바와 같이, 우리는 기질에서 뉴런을 분리하기 위해 프로테오리틱 효소로 배양을 사용했습니다. 전형적으로, 신경염의 그들의 두꺼운 메쉬워크 때문에 (그림1A), 세포는 수시로 우물에 떠 있는 것을 시작하는 단 하나 syncytial 같이 층으로 한 번에 모두 분리하는 경향이 있습니다 (그림1C). 이것은 상당히 빨리 일어나고, 대부분의 실험실이 선택의 그들의 pr...

Discussion

우리는 높은 콘텐츠 스크리닝 플랫폼과 호환되는 방식으로 생존, 분화 성공 및 세포 외 이미징을 최적화하는 인간 신경 배양물의 재중단 및 보충을 위한 정직한 절차를 입증했습니다. 및 약물 발견과 관련된 기타 검사. 그림 6은 이러한 응용 프로그램의 전반적인 워크플로우 및 예제를 보여 줍니다.

여기서 우리는 피질 뉴런 운명을 향한 hiPSC 파생 뉴런에 초점을 맞추고 있지만,이 방법은 인간 배아 줄기 세포 유래 뉴런에 동등하게 적용되어야하며, 줄기 세포 유래 뉴런은 다른 뉴런을 향하게할 것으로 예상됩니다. 신경 표현형^{14,15,16,17,18}...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Post Replating Media
L-Ascorbic Acid	Sigma	A4403	N2B27 매체 1L에 200mM 스톡 1mL 추가
Dibutyryl-cAMP	Sigma	D0627	1 µ M
Human BDNF	Peprotech	450-02	10 ng/ml 최종 농도
B27 (50x)	Thermofisher Scientific	17504044	1 L N2B27 배지
DMEM/F12			N2 추가 및 50 mL 원추형으로 분배; 파라필름 랩 뚜껑
Human GDNF	Peprotech	450-10	10 ng/mL 최종 농도
Glutamax	Thermofisher Scientific	35050038	1 L N2B27 매체에 10 ml를 추가합니다. 글루타민 보충제
Mouse Laminin	Sigma	P3655-10mg	100 µ를 추가합니다. L - 50 mL N2B27
MEM 비필수 아미노산	Thermofisher Scientific	11140035	1 L에 5 mL 추가 N2B27 배지
N2 (100x) Supplement	Life Technologies	17502048	5 mL - 500 mL 배지 추가
Neurobasal A 배지 Thermofisher	Scientific	10888022	DMEM/F12와 결합하여 CVB wt 세포용 N2B27 배지 생성; 신경 기저 A 배지
Neurobasal 배지	Thermofisher Scientific		WT126 세포용 21103049; 신경 기초 매체
SM1 보충제	StemCell Technologies	5711	배지에 1:50 첨가
중탄산나트륨	Thermofisher Scientific	25080-094	1 L N2B27 배지에 10 mL 첨가
Plate Preparation
10 cm 조직 배양 접시	Fisher Scientific	08772-E	플라스틱 TC 처리 접시
6웰 조직 배양 접시	Thomas Scientific	1194Y80	NEST 플레이트
마우스 Laminin	Life Technologies	23017-015	플라스틱에 1:400 추가
Poly-Ornithine	Sigma	P3655-10mg	플라스틱에 1:1,000 추가
UltraPure Distilled Water	Life Technologies	10977-015	희석하기 위해 Poly-L-Ornithine
Replating Reagents
100 mM Cell Strainer	Corning	431752	Sterile, 개별 포장
384웰 플레이트,	PLO 및 Laminin	PerkinElmer	6007550
		14190144	Dulbecco의 인산염 완충 식염수
Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates	PerkinElmer	6057500	코팅 전 헹굼
StemPro Accutase	Life Technologies	A1110501	1 mL/10 cm 플레이트를 30-45분 동안 적용; 단백질 분해 효소
Fixation Materials
37% 포름알데히드	Fisher Scientific	F79-1	PBS
에 용해Sucrose	Fisher Scientific	S5-12
Alexa Fluor 488 염소 항-마우스	Invitrogen	A-11001	2차 항체
Alexa Fluor 568 염소 항닭	Invitrogen	A-11041	2차 항체
Alexa Fluor 647 염소 항닭	10mL당 0.8 gInvitrogen	A-21449	2차 항체
Alexa Fluor 561 Goat anti-rat	Invitrogen	A-11077	2차 항체
DAPI	Biotium	40043	은
b3-tubulin (TuJ-1)에 대한 DNA 마우스 항체	Neuromics	MO15013	early stage neuronal marker
CTIP2	Abcam	ab18465	layer 5/6 cortical에 대한 Rat 항체 뉴런
MAP2	LifeSpan Biosciences	LS-B290	초기 단계 뉴런 마커
대한 닭 항체 NeuN	Millipore	ABN91	후기 뉴런 마커
대한 닭 항체 MAP2	Shelley Halpain	N/A	초기 뉴런 마커
PSD-95	Sigma	P-246	시냅스 후 마커에 대한 마우스 항체
Synapsin 1	Millipore	AB1543	pre-synaptic marker
Bovine serum albumin (BSA)	GE Healthcare Life Sciences	SH30574.02	10% Titon
X-100	Sigma	9002931
Vivafix 차단을 위해 PBS에서 0.2%로 희석 649/660	Biorad	135-1118	세포 사멸 마커
칼슘 이미징
시약명/ 장비	회사	카탈로그 번호	코멘트/설명
AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE	THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility	N/A	바이러스 전달 시스템의 칼슘 리포터
hiPSC 유래 NPC
WT 126 (Y2610)	Gage lab	N/A	Marchetto et al., 2010
CVB WT24	Yeo and Goldstein labs	N/A	미공개