방법 논문

차에서 파생된 새로 설립된 세포 현탁액 배양에서 6개의 전신 살충제의 물질대사에 관한 연구(동백나무시넨시스 L.) 잎

DOI:

10.3791/59312

⸱

2019년 6월 15일

 ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, School of Tea and Food Science & Technology, Anhui Province Key Lab of Analysis and Detection for Food Safety, 2School of Resource & Environment, Anhui Agricultural University, Key Laboratory of Agri-food Safety of Anhui Province

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 살충제 와 같은 전체 식물에 의해 채택될 수 있는 외부 화합물의 대사를 연구하는데 사용될 수 있는 차(동백나무)에서 유래된 세포 현탁액 배양을 확립하기 위한 프로토콜을 제시한다.

초록

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차 공장의 체외 조직을 사용하여 살충제 대사를 연구하기위한 플랫폼이 개발되었습니다. 멸균차 식물로부터의 잎은 식물 호르몬 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D, 1.0 mg L-1)과 키네틴(KT, 0.1mg L-1)을 가진 무라시게및 스쿠그(MS) 기저 매에 느슨한 굳은살을 형성하도록 유도하였다. 캘러스는 각각 28 일 동안 지속되는 3 또는 4 라운드의 후 형성되었습니다. 느슨한 캘러스(약 3 g)를 동일한 식물 호르몬을 함유하는 B5 액상 배지로 접종한 후 25±1°C에서 어둠 속에서 흔들리는 인큐베이터(120 rpm)에서 배양하였다. 3-4 서브컬쳐 후, 차잎에서 유래된 세포 현탁액을 1:1 및 1:2(현탁액 어머니 액체: 신선한 배지) 사이의 하위 배양 비율로 확립하였다. 이 플랫폼을 사용하여, 6개의 살충제(5 μg mL-1 각 티아메톡삼, 이미다클로프리드, 아세트타미프리드, 이미다클로시즈, 디메토에이트 및 오메토아테)를 차 잎 유래 세포 현탁액 배양에 첨가하였다. 살충제의 대사를 액체 크로마토그래피 및 가스 크로마토그래피를 사용하여 추적했습니다. 차 세포 현탁액 배양의 유용성을 검증하기 위해, 처리된 세포 배양 및 손상되지 않은 식물에 존재하는 티아메톡산 및 디메토이트의 대사산물을 질량분광법을 사용하여 비교하였다. 처리된 차 세포 배양에서, 티아메톡산의 7개의 대사산물 및 디메토아테의 2개의 대사산물이 발견되었으며, 처리된 그대로 식물에서는 티아메톡삼의 대사산물 2개와 디메토에이트 중 하나만 발견되었다. 세포 현탁액의 사용은 특히 차와 같은 어려운 매트릭스에 대해 그대로 차 식물의 사용에 비해 대사 분석을 단순화했다.

서론

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차는 세계에서 가장 널리 소비되는 무알코올 음료중 하나입니다 1,2. 차는 우디다년 동백꽃의 잎과 싹에서 생산되며 L. 차 식물은 광대한 농장에서 재배되며 수많은 곤충 해충3,4에취약하다. 유기인산및네오니코티노이드 살충제는 백색파리, 잎호퍼 및 일부 레피도프테란 종6,7과 같은 해충으로부터 차 식물을 보호하기 위해 전신 살충제5로 자주 사용된다. 적용 후, 이러한 살충제는 흡수되거나 식물로 전이됩니다. 식물 내에서, 이러한 전신 살충제는 식물 효소에 의해 가수 분해, 산화 또는 환원 반응을 통해 형질전환될 수 있다. 이러한 변형 제품은 모 화합물보다 더 극성 및 덜 독성이 있을 수 있습니다. 그러나 일부 유기 인산염의 경우 일부 제품의 생체 활동이 더 높습니다. 예를 들어, 아세트산은 보다 독성이 강한 메타미도포스8, 9, 및 이메토에이트 내로 대사되어10,11. 식물 대사 연구는 따라서 식물 내의 농약의 운명을 결정하는 데 중요하다12.

식물 조직 배양은 농약 대사를 조사하기 위한 유용한 플랫폼으로 입증되었으며, 확인된 대사산물은 그대로식물13,14,15에서발견되는 것과 유사하다. 조직 배양, 특히 세포 현탁액 배양의 사용은 몇 가지 장점을 갖는다. 첫째, 실험은 미생물이 없는 실험을 수행하여 미생물에 의한 농약 변형 또는 분해의 간섭을 피할 수 있습니다. 둘째, 조직 배양은 언제든지 사용하기 위한 일관된 물질을 제공한다. 셋째, 대사 산물은 손상되지 않은 식물보다 조직 배양에서 추출하기가 더 쉬울 수 있으며, 조직 배양은 종종 인터링 화합물이 적고 화합물의 복잡성이 낮습니다. 마지막으로, 조직 배양은 단일 실험16에서일련의 농약 대사를 비교하는데 보다 용이하게 사용될 수 있다.

본 연구에서는 멸균 재배 차 식물의 잎에서 파생 된 세포 현탁액이 성공적으로 확립되었습니다. 차 세포 현탁액 배양은 6개의 전신 살충제의 발산 거동을 비교하기 위해 사용되었다.

이 상세한 프로토콜은 연구원이 차에 있는 xenobiotics의 신진 대사 운명을 공부하기 위하여 유용한 식물 조직 문화 플랫폼을 설치할 수 있도록 몇몇 지도를 제공하기 위한 것입니다.

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프로토콜

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1. 차 캘러스 문화

참고: 멸균 잎은 연구그룹17에서처음 개발된 시험관내 재배 식물군 라인에서 유래되었다. 섹션 5까지의 모든 절차는 인큐베이터에서 배양 시간을 제외하고 멸균 층류 흐름 후드에서 수행되었다.

  1. 오토클레이브(121°C, 20분)에 앞서 두 배지(무라시게 및 스쿠그[MS] 기저 배지 및 감보그의 B5 액상 배지)의 pH를 5.8로 조정한다.
  2. 가위를 사용하여 멸균 잎의 중간 정맥을 따라 자른 다음 페트리 접시에 약 0.3 cm x 0.3 cm의 작은 조각으로 각 반을 세분화합니다.
  3. 멸균 이식(작은 잎 조각)을 식물 호르몬을 함유하는 MS 기저 매상에 2,4-D(1.0 mg L-1) 및 KT(0.1 mg L-1)에 놓는다. 6개의 이식체는 MS 기저 매질의 100 mL를 포함하는 300 mL 플라스크에 배치될 수 있다.
  4. 위의 잎을 25°C의 일정한 온도에서 배양하여 어둠 속에서 배양한다. 28일 후, 유도된 캘러스의 1세대를 선택하고 신선한 플라스크(subculture)로 옮김을 옮김한다. 3−4 서브컬쳐 후 느슨하고 부서지기 쉬운 캘러스를 획득합니다.

2. 차 세포 현탁액 배양

  1. 멸균 조건하에서 멸균 수술용 블레이드를 사용하여 고체 매체에서 부터 0.5−2mm 범위의 소인으로 격렬하고 부서지기 쉬운 느슨한 굳은살을 자릅니다.
  2. 작은 굳은 면 약 3g의 무게를 달수 있습니다. 캘러스를 2,4-D(1.0 mgL-1)및 KT(0.1 mg L-1)로 보충한 B5 액상 매체 20 mL을 함유한 150 mL 플라스크에 넣습니다.
  3. 액체 세포 현탁액을 120 rpm에서 흔들림 인큐베이터에서 일정한 온도(25±1°C)에서 배양하였다.
  4. 배양 후 7~10일 후에 배양 플라스크를 제거하고 몇 분 간 방치하십시오.
  5. 서브 컬쳐를 위한 종자 재료로 모든 상판을 신선한 매체로 가져 가라 (서스펜션 어머니 액체의 하위 배양 비율은 1 : 1과 1 : 2 사이의 범위 신선한 매체). 침전된 큰 굳은 살을 제거하십시오.
  6. 각각 28일의 3-4 하위 배양 주기 후에 최종 잘 자란 세포 현탁액 배양을 얻는다.

3. 세포 생존의 트리페닐 테트라 졸륨 염화물 분석

  1. 생존 력 염색 전에 대조군 세포로 100 °C에서 살아있는 세포의 샘플을 10 분 동안 죽입니다.
  2. 원심분리기 6000 x g에서 8 분 동안 모든 세포 현탁액 배양. 인산완식염수(PBS) 완충액(pH 7.3)의 2.5 mL에서 세포를 일시 중단하기 전에 상판액을 제거하고 손으로 1분 간 흔들어 줍니다.
  3. 0.4% 트리페닐 테트라졸륨 염화물(TTC) 용액의 2.5 mL를 추가하고 다시 손으로 흔들어 주세요.
  4. 서 있는 인큐베이터(30°C)에서 1시간 동안 혼합물을 배양한다.

4. 살충제를 가진 차 세포 현탁액 배양의 처리 그리고 샘플링

  1. 400 μL의 aliquot를 추가하여 4개의 네오니코티노이드(티아메톡삼, 아세트타미프리드, 이미다클로프리드, 이미다클로시즈) 또는 2개의 유기인산염(디메토아테 및 오메토아테)의 4개의 네오니코티노이드(500 μg mL-1)를 세포 현탁액 배양에 추가합니다. 각각.
    참고: xenobiotic 행동을 비교하는 것이 목표인 경우에, 다른 화합물을 시험하기 위하여 세포 현탁액의 동일 어머니 배치를 이용하십시오.
  2. 일정한 온도(25±1°C)에서 살충제를 사용하여 세포 현탁액의 샘플을 배양하고 인큐베이터 속도(120 rpm)를 흔들었다. 샘플을 0, 3, 5 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 및 75일에 샘플(4.3 단계 참조)을 수행합니다.
  3. 네오니코티노이드를 함유한 샘플을 시험하려면, 균질한 세포 배양물의 1 mL aliquot를 제거하고, 1.5 mL 플라스틱 원심분리기 튜브에 넣고, 원심분리기를 4000 x g에서 2분 동안.
    1. 고성능 액체 크로마토그래피 자외선(HPLC-UV) 및 초고성능 액체 크로마토그래피-사중극기(UPLC-QTOF) 질량으로 분석하기 전에 0.22-μm 모공 크기의 필터 멤브레인을 통해 초나토이를 통과합니다. 분광법(재료표).
  4. 유기 인산염을 포함하는 샘플을 테스트하려면 세포 배양500 μL aliquot를 제거하고 35 mL 원심 분리튜브 또는 1.5 mL 플라스틱 원심 분리기 튜브에 넣습니다 (네오니코티노이드와 같은 후자의 샘플을 준비하십시오).
    1. 염화나트륨 0.1 g과 아세톤/에틸 아세테이트 5mL(3:7, v/v)를 500 μL 샘플의 35mL 원심분리튜브에 넣습니다.
    2. 혼합물을 1 분 동안 소용돌이로 한 다음 10 분 동안 휴식을 취합니다.
    3. 상급제의 2.5 mL을 10 mL 유리 튜브에 넣고 40 °C에서 질소 증발기를 사용하여 거의 건조로 증발합니다.
    4. 잔류물을 1 mL 아세톤, 와류 1 분 동안 용해하고 가스 크로마토 그래피 - 화염 광 측정 검출기 (GC-FPD)에 의해 분석하기 전에 0.22-μm 필터 멤브레인을 통과하십시오.

5. 살충제를 가진 손상되지 않은 차 식물의 견본 준비

참고 : 그대로 차 식물 시험은 영양 용액의 50 mL에서 성장 차 묘목을 사용하여 수경 시스템에서 실시되었다 (30 NH4+, 10 NO3-, 3.1 PO4-, 40 K+, 20 Ca2 +, 25 Mg2 +, 0.35 Fe 2+, 0.1 B 3+, 1.0 Mn2+ ,0.1 Zn2+ ,0.025 Cu2+, 0.05 Mo+및 10 Al3++ , mg L-1)18. 실험 온실은 안후이 농업 대학에서 20 °C에서 밝은 어두운 주기 (빛의 12 시간 및 어둠의 12 시간)에서했다.

  1. 15 일 동안 4 L 플라스틱 냄비에 5 개의 식물을 넣습니다.
  2. 0 ppm (제어) 또는 티아메톡삼 100 ppm또는 디메토이트를 플라스틱 냄비에 각각 넣습니다.
  3. 19를미리 담그는 것을 제외하고 이전 방법에 따라 손상되지 않은 식물 샘플을 준비한 다음 질량 분석법으로 분석하여 정확한 질량 스펙트럼을 얻습니다.

6. 계측기 분석

  1. 네오니코티노이드의 대사 행동의 HPLC 분석
    1. HPLC-UV(재료표)를 사용하여 254 nm의 파장에서 티아메톡삼과 아세타미프리드의 함량및 대사 산물을 검출하고, 4.3절의 시료에서 270 nm의 이미다클로스트리와 이미다클로시즈를 검출한다.
      참고: HPLC-UV 상태는 이전 연구19와동일했습니다.
  2. 유기 인산염의 대사 행동의 GC 분석
    1. 키랄 컬럼(재료 표)을 사용하여 GC-FPD에 의해 섹션 4.4에서 샘플에서 디메토에이트 및 오메토에이트함량을검출합니다.
    2. 질소를 캐리어 가스로 사용하고 유량을 1.0 mL min-1로설정합니다.
    3. 초기 온도를 120°C로 설정하고, 5분 간 유지한다. 온도를 30°C에서 150°C로 올리고 3분 간 유지한다. 10°C에서 170°C로 올리고 7분 동안 유지한다. 마지막으로 30°C 에서 210°C로 증가시키고-1분 간 유지합니다.
    4. 스플릿리스 모드에서 사출 온도를 200°C로 설정; 검출기 온도를 250°C로 설정합니다.
    5. 사출 량을 1 μL로 설정합니다.
  3. 세포 배양에서 살충제 대사산물의 UPLC-QTOF 분석
    1. C18 컬럼(물자 표)을 사용하여 UPLC-QTOF를 사용하여 세포 배양물(섹션 4.3의샘플)에서 살충제의 대사산물을 검출한다.
    2. 유량을 0.2 mL min-1로설정합니다. 사출 량을 10 μL로 설정합니다.
    3. 네오니코티노이드 처리 된 샘플의 경우 초기 이동 상을 85 % A (5 mM 암모늄 포메이트 물) 및 15 % B (아세토니트릴)로 설정합니다. 10분 이상, 이동단계 B를 38%로 늘리고 1분 동안 15%로 되돌리고 9분 동안 유지합니다.
    4. 유기 인산염 처리 된 샘플의 경우 초기 이동 상을 55 % A (0.1 % 포믹 산 물) 및 45 % B (아세트 니트릴)로 설정합니다. 5분 이상, 이동단계 B를 70%로 올리고, 0.5분 이상 B의 45%로 되돌리고, 2.5분 동안 유지합니다.
    5. QTOF 작동 파라미터를 다음과 같이 설정한다: 가스 온도, 325°C; 건조 가스 (질소), 10 L 분-1; 시스 가스 온도, 350 °C; 시스 가스 흐름, 11 L 분-1; 모세관 전압, 4000 V; 노즐 전압, 1000 V; 단편성 전압, 네오니코티노이드 살충제에 대한 100 V 또는 유기 인성 살충제에 대한 110V; 스키머 전압, 65 V; 양이온 모드에서 작동합니다.
    6. 계측기를 전체 스캔 스펙트럼으로 설정하고 MS/MS 모드를 대상으로 합니다.
    7. 정확한 질량 도구를 사용하여 데이터를 처리합니다. MS/MS 항문뿐만 아니라 문헌12,15,20,21,22에서표준 제품이 없는 대사 산물을 추론한다.
  4. 온전한 식물 추출물에서 살충제 대사산물의 UPLC-Orbitrap 분석
    1. UPLC-Orbitrap 질량 분광법 (재료 표)을 사용하여 그대로 식물 추출물에서살충제의 대사 산물을 검출합니다.
    2. 질량 분석법(표재료)작동 파라미터를 다음과 같이 설정한다: 시스 가스 압력, 35 arb; 가스 온도, 300 ° C; 노즐 전압, 3.5 KV; 모세관 온도, 350 °C.
    3. 세포 배양의 UPLC-QTOF 분석을 위해 용출 프로그램을 위(단계 6.3.3 및 6.3.4 단계)로 설정합니다.

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결과

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현장에서 자란 차 나무와 멸균 환경에서 시험관 내에서 자란 차 식물에서 절제된 잎에서 수확한 잎에서 칼의 유도는 MS 매체에 재배 한 후 오염, 브라우닝 및 유도를 측정하여 비교했습니다. 그림1A)를 참조하십시오. 캘러스 성장은 20, 37, 62 및 90일의 배양(도1B)에서기록되었다. 시험관내에서 자란 잎에서 유래한 캘러스는 재배 90일 동안 밭에서 자란 잎에서 유래한 캘러스보다 더 활발한 성장을 보였다. 멸균 된 잎에서 나온 캘러스는 밝은 노란색이었고, 밭에서 자란잎의 캘러스는 갈색이었습니다 (그림 1B).

2,4-D23의1.0 mgL-1의

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토론

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이 기사는 이식물의 선택, 세포 생존력의 결정, 높은 대사를 가진 차 세포 현탁액 배양의 확립을 포함하여 차 식물 조직에 있는 농약 물질 대사의 모형을 설치하는 상세한 과정을 제시합니다 활동. 식물 조직의 모든 부분은 살균 된 환경에서 굳은 살을 시작하는 데 사용할 수있습니다 25. 차 잎은 이 연구에서 캘러스 개시를 위해 선택되었으며, 잎이 지하 부분보다 덜 오염되는 경향이 있을 뿐만 아니라 작물의 식용 부분이며 농약 적용의 주요 대상이기 때문입니다.

본 연구에서는, 시험관 내에서 자란 멸균 식물로부터 절제된 잎과 현장에서 수확한 잎으로부터의 캘러스의 유도 속도 및 성장 상태를 비교했다. 멸균 된 잎은 갈색 과 오염의 훨씬 낮은 속도와 필드 성장 잎에 비해 유도의 높은 비율을 했다. 이는 현장에서 자란 식물의 잎이 에탄올과 수은을 사용하여 표면 살균을 거쳤을 뿐만 아니라 성장 환경의 변화뿐만 아니라 멸균 된 잎이 멸균 환경에서 재배되어...

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공개 사항

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저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 글

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이 작품은 중국의 국가 핵심 연구 및 개발 프로그램 (2016YFD0200900), 중국의 국가 자연 과학 재단 (No. 31772076 및 No. 31270728), 중국 박사 후 과학 재단 (2018M630700), 그리고 오픈 펀드의 지원을 받았습니다. 차 식물 생물학 및 활용의 국가 키 연구소 (SKLTOF20180111).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아세트 아미 프리드 (99.8 %)Dr. Ehrenstorfer46717CAS 번호 : 135410-20-7
아세토 니트릴 (CAN, 99.9 %)테디아AS1122-801CAS 번호 : 75-05-8
한천Solarbio 과학 & 기술A8190CAS 번호: 9002-18-0
Clothianidin (99.8%)Dr. Ehrenstorfer525CAS 번호: 210880-92-5
디메토에이트(98.5%)Dr. Ehrenstorfer109217CAS 번호: 60-51-5
이미다클로프리드(99.8%)Dr. Ehrenstorfer91029CAS 번호: 138261-41-3
Imidaclothiz(99.5%)토론토 연구 화학 물질I275000CAS 번호: 105843-36-5
키네틴 (KT, >98.0%)솔라바이오사이언스 & 기술K8010CAS 번호: 525-79-1
오메토에이트(98.5%)Dr. Ehrenstorfer105491CAS 번호: 1113-02-6
폴리비닐폴리피롤리돈(PVPP)Solarbio Science & 기술P8070CAS 번호: 25249-54-1
수크로오스토크리스 바이오사이언5511CAS 번호: 57-50-1
티아메톡삼(99.8%)Dr. Ehrenstorfer20625CAS 번호: 153719-23-4
트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC, 98.0%)Solarbio Science & 기술T8170CAS 번호: 298-96-4
2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D, >98.0%)Guangzhou Saiguo BiotechD8100CAS No: 94-75-7
키랄 컬럼Agilent CYCLOSIL-B112-6632크로마토그래피 컬럼(30m × 0.25mm × 0.25 & μ; m)
가스 크로마토 그래피 (GC)Shimadu2010-Plus와 화염 광도 검출기 (FPD)   
고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)Agilent1260Paired with 자외선 검출기(UV)
HSS T3 C18 컬럼Waters186003539크로마토그래피 컬럼(100 mm × 2.1 mm × 1.8 μ m)
초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC)Agilent1290-6545Tandem Quadrupole Time-of-Flight 질량분석기(QTOF)
초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC)Orbitrap 질량분석기에 연결된Thermo ScientificUltimate 3000-Q Exactive Focus
스

참고문헌

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